本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法及克里本类芽孢杆菌的培养基。
背景技术：
克里本类芽孢杆菌(Hypocrea virens)是一种抑制多种土传植物病原真菌的重寄生菌，菌落生长快，培养4天后直径7～9.5cm，气生菌丝卷毛状，白色或者灰色。分生孢子丰富，近于平展状覆盖于平板。克里本类芽孢杆菌作为植物病害生物防治的主要机制，已经越来越受到各国植物病理学家的重视。重寄生菌作为生物防治的重要因子，对于防治植物病害具有重要作用。
现有技术中，关于克里本类芽孢杆菌发酵工艺的报道较少，仅专利号为CN 103756931 A的发明专利记载了关于克里本类芽孢杆菌的发现和应用的相关内容，克里本类芽孢杆菌培养方法和培养基仅是对克里本类芽孢杆菌的活化培养及活化培养基两方面有记载，并未就克里本类芽孢杆菌发酵方法以及发酵各阶段所使用的培养基有记载。
克里本类芽孢杆菌活化培养方法无法满足本领域预防植物病害的应用，而传统的真菌发酵方法能够实现工业化生产，但存在发酵时间长，成本高，收率低等问题，不能满足现有防止植物病害的应用。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于得到优化的发酵生产方法，能够得到一种更高效的控制手段，最终获取孢子含量较高的克里本类芽孢杆菌粉。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，包括下列步骤：
1)将克里本类芽孢杆菌菌种活化，接种到一级液体培养基中进行一级培养，得到一级种子液；
2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行二级发酵培养，得到二级种子液；
3)将所述步骤2)得到的二级种子液接种到三级液体培养基进行三级发酵培养，浓缩分离后，得到克里本类芽孢杆菌菌粉；
所述三级液体培养基包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水。
优选的，所述步骤1)中一级培养的时间为28～32h，一级培养的温度为28～32℃。
优选的，所述步骤1)中一级培养须进行光照培养，所述光照培养的光强3000～4000xl。
优选的，所述步骤1)中的一级培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入培养24h内，通气量为10～20m3/h，培养24h后，通气量15～24m3/h；
优选的，所述培养的接种量为1.5～2.5％。
优选的，所述一级培养的初始pH值为7.0～8.0。
优选的，所述步骤1)中的一级培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min，所述搅拌的转速为150～300r/min。
优选的，所述步骤2)中二级发酵培养的时间为45～52h，二级发酵培养温度为30～35℃。
所述二级发酵培养在光照下进行，所述光照的光强为4000～5000xl。
优选的，所述二级发酵培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入二级发酵培养后24h之内，通气量控制在100～180m3/h，培养24h后，通气量为200～260m3/h。
优选的，所述二级发酵培养的接种量为7～15％。
优选的，所述二级发酵培养的初始pH为7.0～8.0。
优选的，所述步骤2)中的二级发酵培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min(发明人需确认)，所述搅拌的转速为150～300r/min。
优选的，所述步骤3)三级发酵培养的时间为62～67h，三级发酵培养的温度28～32℃。
所述三级发酵培养在光照下进行，所述光照的的光强为5000～7000xl。
优选的，所述三级发酵培养过程进行通气，所述通气的程序具体为：进入三级发酵培养后36h之内，通气量控制在1800～2300m3/h，培养48h后，通气量为800～1200m3/h。
优选的，所述三级发酵培养的接种量为7～15％。
优选的，所述三级发酵培养的初始pH值为7.0～8.0。
优选的，所述步骤3)中的三级发酵培养在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min，所述搅拌的转速为150～300r/min。
优选的，其特征在于，所述一级液体培养基包括下列质量百分含量组分：蔗糖2～5％、硝酸钠0.1～0.2％、磷酸氢二钾0.08～0.2％、硫酸镁0.03～0.1％、氯化钾0.02～0.1％、硫酸铁0.001～0.003％，余量为水；更优选的，所述一级液体培养基包括下列百分含量组分：蔗糖3％、硝酸钠0.15％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、硫酸铁0.001％，余量为水。
优选的，所述二级液体培养基包括下列质量百分含量组分：蔗糖1.00～2.00％、葡萄糖1.00～2.00％、黄豆粉0.70～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水；更优选的，所述二级液体培养基包括下列百分含量组分：蔗糖1.5％、葡萄糖1.5％、黄豆粉1％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钙0.1％，余量为水。
本发明还提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产用培养基，包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水。
优选的，包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.5％、玉米粉1％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钙0.1％，余量为水。
本发明提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，将克里本类芽孢杆菌菌种活化，在一级种子液体培养基和二级液体培养基进行培养以扩大繁殖，得到强健的菌体和一定量的孢子，将二级种子液接种到复合的碳源和氮源形成的三级液体培养基上，使克里本类芽孢杆菌的快速生长和产芽孢。得到的发酵液中活菌数为10-50亿CFU/ml，喷雾干燥后，得到菌粉的收率为10％-15％。由此可见，采用本发明的技术方案最终获取孢子含量较高的克里本类芽孢杆菌粉，解决了本发明的技术问题。
附图说明
图1为本发明实施例中三级发酵菌液处理流程图。
菌种保藏
克里本类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)，包藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国.北京.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所，保藏机构简称：CGMCC，保藏日期为2013年8月13日，保藏编号CGMCC No.7996，菌株编号：TRCC82001。
具体实施方式
本发明提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，包括下列步骤：
1)将克里本类芽孢杆菌菌种活化，接种到一级液体培养基中进行一级培养，得到一级种子液；
2)将所述步骤1)得到的一级种子液接种到二级液体培养基进行二级发酵培养，得到二级种子液；
3)将所述步骤2)得到的二级种子液接种到三级液体培养基进行三级发酵培养，浓缩分离后，得到克里本类芽孢杆菌菌粉；
所述三级液体培养基包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水。
本发明提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法，将克里本类芽孢杆菌菌种活化，在一级种子液体培养基和二级液体培养基进行培养以扩大繁殖，得到强健的菌体和一定量的孢子，将二级种子液接种到由复合的碳源和氮源形成的三级培养基上进行的三级发酵培养，使克里本类芽孢杆菌的快速生长和产孢。
本发明将克里本类芽孢杆菌菌种活化，得到活化的克里本类芽孢杆菌菌种。本发明对所述活化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的活化的技术方案即可。在本发明的实施例中，所述克里本类芽孢杆菌菌种为江西天人生态股份有限公司提供。
在本发明中，所述活化的培养基优选为改良的固体察氏培养基II。
在本发明中，所述固体察氏培养基II的配方参见申请号为CN201310643992.5的专利。
得到活化的克里本类芽孢杆菌，本发明将所述活化的克里本类芽孢杆菌接种到一级种子液体培养基中进行一级培养，得到一级种子液。
在本发明中，所述一级培养的时间优选为28～32h，更优选为30℃。所述一级培养的温度优选为28～32℃，更优选为30℃。所述的一级培养优选在光照条件下进行，所述的光照的光强优选为3000～4000lx，更优选为3500lx。
在本发明中，所述一级培养优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率优选为1～2次/h，每次搅拌的时间优选为10～20min。所述搅拌的转速为150～300r/min。
在本发明中，所述一级培养过程优选进行通气，所述通气的程序具体优选为：进入培养24h内，通气量为10～20m3/h，更优选为15m3/h；进入培养24h后，通气量优选为15～24m3/h，更优选为20m3/h。
在本发明中，所述通气的气体种类优选为无菌空气。
在本发明中，所述一级培养的接种量优选为1.5～2.5％，更优选为2％。
在本发明中，所述一级培养的初始pH值为7.0～8.0，更优选为7.5。
在本发明中，所述一级种子液体培养基优选包括下列质量百分含量的组分：蔗糖2～5％、硝酸钠0.1～0.2％、磷酸氢二钾0.08～0.2％、硫酸镁0.03～0.1％、氯化钾0.02～0.1％、硫酸铁0.001～0.003％，余量为水；更优选为蔗糖3％、硝酸钠0.15％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、硫酸铁0.001％，余量为水。本发明对上述组分的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的用于制备培养基的药品即可。
得到一级种子液后，本发明将所述一级种子液接种到二级液体培养基中进行二级发酵培养，得到二级种子液。
本发明对所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所述熟知的接种的技术方案即可。
在本发明中，所述二级发酵培养的接种量优选为7～15％，更优选为10％。
在本发明中，所述的二级发酵培养的时间优选为45～52h，更优选为48h。所述二级发酵培养的温度优选为30～35℃，更优选为32℃。所述二级发酵培养优选在光照条件下进行，所述光照的光强优选为4000～5000lx，更优选为4500lx。
在本发明中，所述二级发酵培养过程优选在通气条件下进行，所述通气的程序具体优选为：进入二级发酵培养后24h之内，通气量控制在100～180m3/h，更优选为150m3/h；培养24h后，通气量为200～260m3/h，更优选为250m3/h。
在本发明中，所述通气的气体种类优选为无菌空气。
在本发明中，所述二级发酵培养的初始pH优选为7.0～8.0，更优选为7.5。
在本发明中，所述二级发酵培养优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率优选为1～2次/h，每次搅拌的时间为10～20min。所述搅拌的转速为150～300r/min。
在本发明中，所述的二级种子液体培养基优选包括下列质量百分含量组分：蔗糖1.00～2.00％、葡萄糖1.00～2.00％、黄豆粉0.70～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水，更优选为蔗糖1.5％、葡萄糖1.5％、黄豆粉1％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钙0.1％，余量为水。
得到二级种子液后，本发明将所述二级种子液接种到三级液体培养基进行三级发酵培养，得到三级发酵菌液。
在本发明中，所述三级发酵培养的时间优选为62～67h，更优选为64h。所述三级发酵培养的温度优选为28～32℃，更优选为30℃。所述三级发酵培养优选在光照培养条件下进行，所述光照的光强优选为5000～7000lx，更优选为6000lx。
在本发明中，所述三级发酵培养过程进行通气，所述通气的程序具体如下：进入三级发酵培养后36h之内，通气量控制在1800～2300m3/h，更优选为2000m3/h；培养48h后，通气量优选为800～1200m3/h，更优选为1000m3/h。
在本发明中，所述三级发酵培养36-48之间，通气量逐渐减少，呈倒V型，在42h时进行缺氧操作，之后逐渐增加通气量。所述缺氧操作的作用是在适当缺氧的条件下促使菌丝体更大程度的转变为芽孢体。
在本发明中，所述通气的气体种类优选为无菌空气。
在本发明中，所述三级发酵培养的接种量优选为7～15％，更优选为10％。
在本发明中，所述三级发酵培养的初始pH值为7.0～8.0，更优选为7.5。
在本发明中，所述三级发酵培养优选在搅拌的条件下进行，所述搅拌的频率优选为1～2次/h，每次搅拌的时间优选为10～20min。所述搅拌的转速为150～300r/min。
三级发酵培养后，本发明优选将得到的三级发酵培养液分离，得到上清液和浓缩液。
在本发明中，所述离心的转速为10000-15000r/min更优选为12000～13000r/min。
在本发明中，所述离心的设备没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的离心机即可。在本发明实施例中，所述离心的设备为蝶式离心机。
在本发明中，所述浓缩液优选经喷雾干燥塔干燥，最终得到克里本类芽孢杆菌的菌粉。
在本发明中，所述干燥的温度优选为35℃～40℃，更优选为37℃。
在本发明中，所述上清液经包装后得到无菌发酵液产品。
本发明还提供了一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产用培养基，包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水；更优选为包括下列质量百分含量组分：葡萄糖2.5％、玉米粉1％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钙0.1％，余量为水。
本发明提供的一种克里本类芽孢杆菌的发酵生产用培养基，所述培养基采用复合氮源和碳源及营养元素组成，通过优化各组分配比，使菌体产生含量丰富的芽孢和代谢产物。
下面结合实施例对本发明提供的克里本类芽孢杆菌的发酵生产方法及培养基进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
江西天人生态股份有限公司提供的克里本类芽孢杆菌菌种在改良的固体察氏培养基II的固体斜面上接种1％的接种量，在30℃条件下培养3天，对菌种进行活化。将活化的菌种按照2％的接种量接种到一级液体培养基中在30℃条件培养30h，培养过程添加光照，光强为3000lx，进行一级培养，培养过程通入无菌空气，进入培养24h内，通气量为18m3/h，培养24h后，通气量20m3/h，同时培养过程需搅拌的条件下进行，每小时内搅拌一次，每次搅拌持续20min，搅拌的转速为150～300r/min，一级液体培养基配方为蔗糖3％、硝酸钠0.15％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钾0.05％、硫酸铁0.001％，余量为水，培养的初始pH值为7.5。结束一级培养后，将获得一级种子液按照10％的接种量接种到二级液体培养基上，二级液体培养基包括蔗糖1.5％、葡萄糖1.5％、黄豆粉1％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钙0.1％，余量为水，培养的初始pH值为7.5，在32℃条件下培养48h，培养过程需5000lx的光照，进入二级培养后24h之内，通入无菌空气150m3/h，培养24h后，通气量上调到250m3/h，二级培养过程中每小时搅拌2次，每次搅拌10min。结束二级培养后，将获得二级种子液按照10％的接种量接种到三级液体培养基上，二级液体培养基包括葡萄糖2.5％、玉米粉1％、硫酸铵0.05％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钙0.1％，余量为水，培养的初始pH值为7.5；在30℃条件下三级发酵培养64h，培养过程中光照的光强控制为5000lx，进入三级发酵培养后36h之内，通气量控制在2000m3/h，培养48h后，通气量为1000m3/h；每小时搅拌2次，每次搅拌持续15min(发明人需确认)。得到三级发酵菌液后，采用蝶式离心机在10000r/min条件下离心，得到上清液和浓缩液，上清液经包装后得到无菌发酵液产品，将浓缩液经喷雾干燥塔37℃干燥，得到克里本类芽孢杆菌的菌粉。
实施例2
江西天人生态股份有限公司提供的克里本类芽孢杆菌菌种在改良的固体察氏培养基II的固体斜面上接种1％的接种量，在30℃条件下培养3天，对菌种进行活化。将活化的菌种按照1.5％的接种量接种到一级液体培养基中在32℃条件培养28h，培养过程在光照下进行，光强为4000lx，进行一级培养，培养过程通入无菌空气，进入培养24h内，通气量为10m3/h，培养24h后，通气量15m3/h，同时培养过程需搅拌的条件下进行，每小时内搅拌一次，每次搅拌持续20min，所述搅拌的转速为150～300r/min，一级液体培养基配方为蔗糖5％、硝酸钠0.1％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.03％、氯化钾0.1％、硫酸铁0.001％，余量为水，培养的初始pH值为7.0。结束一级培养后，将获得一级种子液按照7％的接种量接种到二级液体培养基上，二级液体培养基包括蔗糖1.00％、葡萄糖2.00％、黄豆粉0.70％、硫酸铵0.10％、磷酸氢二钾0.03％、氯化钙0.20％，余量为水，培养的初始pH值为8.0，在30℃条件下培养45h，培养过程需45000lx的光照，进入二级培养后24h之内，通入无菌空气180m3/h，培养24h后，通气量上调到200m3/h，二级培养过程中每小时搅拌2次，每次搅拌10min。结束二级培养后，将获得二级种子液按照10％的接种量接种到三级液体培养基上，三级液体培养基包括葡萄糖2.00％、玉米粉1.50％、硫酸铵0.03％、磷酸氢二钾0.10％、氯化钙0.07％，余量为水，培养的初始pH值为7.5；在32℃条件下三级发酵培养62h，培养过程中光照的光强控制为7000lx，进入三级发酵培养后36h之内，通气量控制在2300m3/h，培养48h后，通气量为1200m3/h；每小时搅拌2次，每次搅拌持续15min(发明人需确认)。得到三级发酵菌液后，采用蝶式离心机在15000r/min条件下离心，得到上清液和浓缩液，上清液经包装后得到无菌发酵液产品，将浓缩液经喷雾干燥塔40℃干燥，得到克里本类芽孢杆菌的菌粉。
实施例3
江西天人生态股份有限公司提供的克里本类芽孢杆菌菌种在改良的固体察氏培养基II的固体斜面上接种1％的接种量，在30℃条件下培养3天，对菌种进行活化。将活化的菌种按照2.5％的接种量接种到一级液体培养基中在28℃条件培养32h，培养过程在光照下进行，光强为3500lx，进行一级培养，培养过程通入无菌空气，进入培养24h内，通气量为20m3/h，培养24h后，通气量22m3/h，同时培养过程需搅拌的条件下进行，每小时内搅拌一次，每次搅拌持续20min，所述搅拌的转速为150～300r/min，一级液体培养基配方为蔗糖2％、硝酸钠0.2％、磷酸氢二钾0.08％、硫酸镁0.1％、氯化钾0.02％、硫酸铁0.003％，余量为水，培养的初始pH值为8.0。结束一级培养后，将获得一级种子液按照15％的接种量接种到二级液体培养基上，二级液体培养基包括蔗糖2.00％、葡萄糖1.00％、黄豆粉1.50％、硫酸铵0.03％、磷酸氢二钾0.10％、氯化钙0.07％，余量为水，培养的初始pH值为7.5，在35℃条件下培养45h，培养过程需4000lx的光照，进入二级培养后24h之内，通入无菌空气180m3/h，培养24h后，通气量上调到200m3/h，二级培养过程中每小时搅拌2次，每次搅拌10min。结束二级培养后，将获得二级种子液按照10％的接种量接种到三级液体培养基上，三级液体培养基包括葡萄糖2.00～3.00％、玉米粉0.50～1.50％、硫酸铵0.03～0.10％、磷酸氢二钾0.03～0.10％、氯化钙0.07～0.20％，余量为水，培养的初始pH值为7.5；在28℃条件下三级发酵培养67h，培养过程中光照的光强控制为6000lx，进入三级发酵培养后36h之内，通气量控制在1800m3/h，培养48h后，通气量为800m3/h；每小时搅拌2次，每次搅拌持续20min。得到三级发酵菌液后，采用蝶式离心机在12000r/min条件下离心，得到上清液和浓缩液，上清液经包装后得到无菌发酵液产品，将浓缩液经喷雾干燥塔35℃干燥，得到克里本类芽孢杆菌的菌粉。
实施例1-3中得到的发酵液中活菌数为10-50亿CFU/ml，干燥得到的菌粉与发酵液之比为菌粉收率，经计算实施例1-3中得到的菌粉收率为10％-15％。
由以上实施例可知，采用合适的碳氮比，在一级种子液制备中以高的氮含量，促使菌种集中的菌体生产上，生长出更加强健的菌体，在二级种子液产生中，碳氮比菌体生产适宜，有强健的菌丝可以产生出更多的孢子，同时孢子萌发在菌液中，可以在三级发酵培养阶段中更加大量的菌体；提供最适宜的非生物影响因子，在生产中优化发酵培养参数，更高效的控制手段，最终浓缩烘干出菌粉。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。