诱导裂藻微生物在含宿主藻的半固体平板上形成趋化环的方法与流程

本发明涉及裂藻微生物，尤其是涉及诱导裂藻微生物在含宿主藻的半固体平板上形成趋化环的方法。

背景技术：

微藻能源，由于其可再生性，已引起了公众及科学研究的广泛兴趣(Stephens et al.,2010；Wang et al.,2012)。与作为能源原料的部分高等植物相比，藻类生物质具有更高的生长速率及可对污染物和温室气体CO₂进行生物固定等优点(Prajapati et al.,2013)。在诸多进行研究的产能微藻中，三角褐指藻由于其生长速率快，可适应于海水环境及可大规模培养，油脂产量高，尤其是其全基因组也已公开化等优点，成为微藻能源研究中一种重要的模式藻种(Bowler et al.,2008)。

尽管如此，在将微藻转化为可用的生物燃料过程中，科学家们仍面临着诸多困难和挑战，其中重要的一点就是微藻细胞的破碎。目前已有利用病毒或细菌等微生物方法来裂解微藻细胞壁以释放藻体内的油脂等有益成分的研究报道，如Cheng等(Cheng et al.,2013)利用病毒裂解自养小球藻的细胞壁，使得储藏在胞内的淀粉释放出来，再利用大肠杆菌对释放的淀粉等有益物质进行生物转化，从而获得生物乙醇。利用微生物的方法来破碎藻细胞，从成本、方便程度及规模化程度来看，其比传统的物理化学方法更有优势。

在水环境中，细菌的趋化性是一种普遍现象，浮游植物如藻类会释放一些分泌物，某些细菌在感知到营养物的存在后会向其移动。如Lovejoy等(Lovejoy et al.,1998)曾报道一种杀藻细菌Pseudoalteromonas会在目标藻周围形成高浓度的分布区域，即趋化环。Sonnenschein等(Sonnenschein et al.,2012)人则发现菌株Marinobacter adhaerens的趋化性介导了其与硅藻Thalassiosira weissflogii的直接接触。由于目前有关溶藻细菌的研究主要是在水华或赤潮调控及治理等方面，且大多数的报道是有关间接杀藻方式，即细菌通过释放一类化合物来杀死藻细胞。而有关利用细菌直接杀藻，尤其是能源微藻的研究则是少之又少。

技术实现要素：

本发明的第一目的是提供团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531。

本发明的第二目的是提供一种裂藻微生物裂解液的制备方法。

本发明的第三目的是提供一种裂藻微生物裂解液在裂解产油微藻细胞壁中的应用。

本发明的第四目的是提供一种诱导裂藻微生物在含宿主藻的半固体平板上形成趋化环的方法。

所述团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531已于2016年7月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M 2016378。

所述裂藻微生物裂解液的制备方法，包括以下步骤：

1)将对数期生长的三角褐指藻原液接种于灭菌的f/2培养基中培养，获得藻液；

2)将步骤1)所得藻液灭菌，得液体PTF培养基；

3)将团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531接种于步骤2)所得的液体PTF培养基培养，得菌液；

4)将步骤3)所得菌液与浓缩后的藻液混合后倒双层平板，具体方法如下：

配制琼脂浓度为1.2％的f/2培养基作为下层培养基，配制琼脂浓度为0.7％的f/2培养基为上层培养基并分装至5mL/管；取50mL处于对数生长周期的藻液于4000g离心5min后倒去上清，用1mL的灭菌f/2培养基重悬沉淀形成浓缩藻液；将步骤3)得到的菌液和浓缩藻液与50℃上层培养基按照体积比为100μL︰1mL︰5mL混合后倒入下层培养基上，待琼脂凝固后倒置于光照培养箱内培养至出现明显的空斑现象；

5)挖取步骤4)出现的单个空斑，用f/2培养基浸泡，按照1︰10的体积比加入到新鲜的生长至对数期的三角褐指藻藻液中，感染一周后得裂解液；

6)将步骤5)得到的裂解液按步骤4)重新倒双层平板，再按步骤5)获得变澄清的裂藻微生物裂解液。

在步骤1)中，所述接种的接种量可按对数期生长的三角褐指藻原液︰f/2培养基＝1︰10；所述f/2培养基的组成可为：75mg NaNO₃,5mg NaH₂PO₄·H₂O，4.36mg Na₂EDTA·2H₂O，3.15mg FeCl₃·6H₂O，0.01mg CoCl₂·6H₂O，0.18mg MnCl₂·4H₂O，0.006mg NaMoO₄·2H₂O，0.1mg thiamine·HCl，0.5μg vitamin B₁₂，0.5μg biotin，溶解于1L经0.45μm膜过滤的海水中；所述培养可于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons m^-2s^-1光照强度条件下培养14d。

在步骤2)中，所述灭菌的条件可为：121℃，21min。

在步骤3)中，所述培养的条件可置于27℃摇床，180rpm震荡培养10d。

所述裂藻微生物裂解液可在裂解产油微藻细胞壁中应用。

本发明获得新鲜的感染效果良好的裂解液，该裂解液能够裂解包括三角褐指藻，自养小球藻等几种能源微藻，能够应用于利用微生物方法破碎藻细胞壁使得藻内如油脂、淀粉等有益物质释放，进而有助于生物转化为生物燃料。

配制半固体培养基的琼脂浓度为0.18％，适合于裂解液中的裂藻微生物的运动，适合于趋化环现象的观察。

所述诱导裂藻微生物在含宿主藻的半固体平板上形成趋化环的方法，包括以下步骤：

1)配制寡营养的MM₂液体培养基，加入琼脂后灭菌；

在步骤1)中，所述寡营养的MM₂液体培养基的组成可为：1L陈海水中含有18mM(NH₄)₂SO₄、1μM FeSO₄.7H₂O、100μL 1M KH₂PO₄/Na₂HPO₄缓冲液；所述寡营养的MM₂液体培养基与琼脂的配比可为100mL︰0.18g；所述灭菌可置于高压灭菌锅内按照121℃灭菌21min。

2)待步骤1)中灭菌培养基的温度降至50℃后，向其中加入裂藻微生物裂解液，混合后倒平板，得半固体琼脂平板；

在步骤2)中，所述倒平板可按15mL/板倒平板。

3)对处于对数生长期的三角褐指藻藻液，离心后取1mL上清液置于灭菌的1.5mL离心管中，得到处理液A；将离心得到的藻体沉淀重悬于灭菌的3mL MM₂液体培养基中得到浓缩的藻液，取1mL作为处理液B；另取1mL置于高压灭菌锅内按照121℃灭菌21min，得到处理液C；取1mL浓缩的藻液置于超声破碎仪中按照功率120W，工作时间5s︰间歇时间5s,80次循环来对藻体进行破碎，得到处理液D；取1mL的新鲜的藻裂解液，作为处理液E；以灭菌的Milli-Q水为对照；

4)取步骤3)中的藻液处理液A、处理液B、处理液C、处理液D、处理液E和对照组的Milli-Q各10μL加于步骤2)得到的半固体琼脂平板的中心位置，然后置于黑暗、温度20℃的环境下2天，直至在半固体琼脂平板的中心位置出现明显的趋化环为止。

所述团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531能够在三角褐指藻的藻平板上形成直径约2cm的空斑，并且随着时间的延长，空斑区域会延伸至整个平板。

本发明获得新鲜的感染效果良好的裂解液，该裂解液能够裂解包括三角褐指藻，自养小球藻等几种能源微藻，能够应用于利用微生物方法破碎藻细胞壁使得藻内如油脂、淀粉等有益物质释放，进而有助于生物转化为生物燃料。

附图说明

图1为团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在三角褐指藻平板上形成的逐渐扩大的空斑。

图2为团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在滴加有藻体的半固体琼脂平板上形成的趋化环。

图3为团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在滴加有不同处理藻体的半固体琼脂平板上形成的趋化环的直径大小。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明，但本发明不限于下述实施例。

实施例1：团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在三角褐指藻的空斑形成

1)按照1︰10的接种量，将对数期生长的三角褐指藻原液接种于灭菌的f/2培养基中，于20±1℃，12h光照，12h黑暗，50μmol photons/m²s-1光照强度条件下培养14d以获得较浓的藻液；

2)将步骤1)中所得的藻液进行高压灭菌(121℃,21min)以获得液体的PTF培养基，并按照4mL/管分装于玻璃试管中；

3)将团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531接种于步骤2)所得的培养基中，置于27℃摇床，180rpm震荡培养10d；

4)配制琼脂浓度为1.2％的f/2固体培养基作为下层培养基，配制琼脂浓度为0.7％的f/2培养基为上层培养基并分装至5mL/管；

5)取50mL处于对数生长周期的藻液于4000g离心5min后倒去上清，用1mL的灭菌f/2培养基重悬沉淀形成浓缩的藻液；

6)将步骤3)得到的菌液，步骤5)得到的浓缩藻液与步骤4)得到的50℃上层培养基按照体积比为100μL︰1mL︰5mL进行混合迅速均匀倒入到下层培养基上，待琼脂凝固后倒置于光照培养箱内培养10d至出现明显的空斑现象。

实施例2：裂藻微生物裂解液的制备

1)挖取实施例1中出现的直径较大的单个空斑，用灭菌的f/2培养基浸泡过夜；

2)按照1︰10的体积比例将浸泡液加入到新鲜的生长至对数期的三角褐指藻藻液中，感染一周形成新鲜的裂藻效果很好已经变澄清的裂解液；

3)将步骤2)获得的裂解液按照双层平板法重新倒双层平板，将得到的空斑重新感染新鲜的三角褐指藻藻液，以使得团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531能够同时在藻液及藻平板上保持稳定的感染活性。

实施例3：趋化环现象的发现

1)配制100mL寡营养的MM₂液体培养基，并向其中添加0.18g的琼脂，以使得琼脂的终浓度为0.18％，将此培养基置于高压灭菌锅内按照121℃灭菌21min；

2)按照实施例2中裂解液的制备方法获得新鲜的裂解效果较好的裂解液；

3)待步骤1)中灭菌培养基的温度降至50℃后，向其中加入步骤2)得到的裂解液10mL，充分混合后按照15mL/板倒平板，待冷却后备用；

4)滴加10μL新鲜的藻液于步骤3)得到的半固体平板中间；另取一半固体平板并于中间滴加灭菌的Milli-Q水作为对照；

5)将步骤4)后得到的平板放置于黑暗，温度20℃的环境下2天，直至在平板的中心位置出现明显的趋化环为止。

实施例4：团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在不同藻体营养下的趋化环直径大小

1)配制100mL寡营养的MM₂液体培养基，并向其中添加0.18g的琼脂，以使得琼脂的终浓度为0.18％，将此培养基置于高压灭菌锅内按照121℃灭菌21min；

2)按照权利要求2中裂解液的制备方法获得新鲜的裂解效果较好的裂解液；

3)待步骤1)中灭菌培养基的温度降至50℃后，向其中加入步骤2)得到的裂解液10mL，充分混合后按照15mL/板倒平板，待冷却后备用；

4)对500mL处于对数生长期的三角褐指藻藻液，于5000g离心10min，取部分上清液置于灭菌的1.5mL离心管中，得到处理液A；将离心得到的藻体沉淀重悬于灭菌的3mL MM₂液体培养基中得到浓缩的藻液，取1mL作为处理液B；另取1mL置于高压灭菌锅内按照121℃灭菌21min，得到处理液C；取1mL浓缩的藻液置于超声破碎仪((NingBo Scientiz Biotechnological Co.,Ltd,China)中按照功率120W，工作时间5s︰间歇时间5s，80次循环来对藻体进行破碎，得到处理液D；取1mL的新鲜的藻裂解液，作为处理液E；以灭菌的Milli-Q水为对照；

5)取步骤4)中的藻液处理液A、处理液B、处理液C、处理液D、处理液E及对照组的Milli-Q各10μL小心滴加于步骤3)得到的半固体琼脂平板的中心位置；

6)将步骤5)后得到的平板放置于黑暗，温度20℃的环境下2天，直至在平板的中心位置出现明显的趋化环，再分别测量趋化环的直径大小。根据趋化环直径大小结果显示，高压灭菌对藻细胞的破坏最为彻底而趋化环直径也最大。

团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在三角褐指藻平板上形成的逐渐扩大的空斑参见图1，团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在滴加有藻体的半固体琼脂平板上形成的趋化环参见图2，团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia sp.)KD531在滴加有不同处理藻体的半固体琼脂平板上形成的趋化环的直径大小参见图3。

本发明所述宿主藻为三角褐指藻(Phacodactylum tricornutum)。通过双层平板法获得裂藻微生物在宿主藻平板上形成的空斑，然后挖取空斑，并用灭菌f/2培养基浸泡过夜后，加入到新鲜的生长至对数期的三角褐指藻液中感染一周以形成裂解液；离心宿主藻液收集藻细胞，将藻细胞通过超声破碎仪或高压灭菌方法破碎藻细胞以释放营养物质，并滴加在混合有裂解液的半固体琼脂平板上，以观察趋化性现象。该裂藻微生物的裂解液能裂解三角褐指藻细胞，促进藻内有益物质如油脂等的释放，对其裂藻特点及趋化性的研究使其在微藻能源的开发利用及裂藻机制方面具有重要的意义和实用价值。