一种抗衰老益生菌制剂及制备方法与流程

本发明涉及一种生物制剂，尤其涉及一种抗衰老益生菌制剂及制备方法。

背景技术：

我国老龄化问题日渐严重，老年人口所占人口比重越来越大，寻找抗衰老活性物质并对其机理的探索成为当今应对老龄化问题的研究热点。目前，多种天然产物的抗衰老活性已被证实，但是由于其来源单一、分离纯化困难、且成本昂贵，难以得到大范围的应用。益生菌作为一种潜在的抗衰老物质，来源广泛、安全性相对高、且价格便宜，逐渐受到大众欢迎。

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，大量报道证实益生菌具有多种生理功效，益生菌可以改善肠道环境、调节菌群平衡、增强机体免疫力、缓解过敏症状等，目前有关益生菌的抗衰老功能的研究相对较少，主要集中在肠道菌群的调节、抗氧化、免疫调节等方面。

研究发现，人体从出生到衰老的过程中，肠道菌群发生动态变化，从幼儿到成年，乳杆菌、拟杆菌数量上升，双歧杆菌数量略有下降，机体逐渐衰老进入老年后，双歧杆菌、拟杆菌等菌群种类及数量明显下降，而一些产腐败的梭状芽孢杆菌等兼性厌氧菌数量显著上升，益生菌作为肠道菌群中对宿主有益的菌群可以调节肠道菌群平衡。有学者研究表明，肠道中的腐败菌分解蛋白质及含硫化合物会产生硫化氢、生物胺等腐败产物，这些腐败产物被人体吸收后进入血液对大脑、肝脏等重要器官产生毒害作用，加速机体的衰老，但是肠道中的双歧杆菌、乳酸菌等可以分解糖类，生成乙酸、乳酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸，显著降低肠道中pH值，抑制腐败菌的生长，延缓机体衰老。

一般认为随着年龄的增长，自由基在机体中不断积累，自由基使机体受到氧化损伤，人体的抗氧化防御系统的能力也逐渐下降，例如羟自由基与不饱和脂肪酸反应改变细胞膜的完整性，也会使DNA脱氧核糖遭到破坏，导致DNA损伤及细胞死亡，加速机体的衰老，为弥补抗氧化能力的损失，可以强化体内的抗氧化系统，同时也可以补充抗氧化物质，有研究发现一些乳酸菌中存在抗氧 化酶类，例如超氧化物歧化酶(SOD)、NADH氧化酶、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)等从而使其具有抗氧化活性，同时一些非酶类菌体成分以及代谢产物也可能具有抗氧化功能。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种通过对肠道菌群的调节、维持肠道菌群平衡、抑制有害菌的生长、从而延缓机体衰老的抗衰老益生菌制剂及制备方法。

本发明第一方面提供一种抗衰老益生菌制剂，包括有效量的长双歧杆菌BL21、植物乳杆菌Lp90以及辅料，其中：

所述长双歧杆菌BL21，已于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10452，分类命名为长双岐杆菌（Bifidobacterium longum），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

所述植物乳杆菌Lp90，已于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.10453，分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明使用的术语“有效量”是指这样的活性剂的量：其足够高以递送希望的益处，但是足够低以避免在医学判断范围内的严重副作用。

具体的，所述辅料包括但不限于赋形剂、食品添加剂或益生元。

本发明第二方面提供一种如本发明第一方面提供的抗衰老益生菌制剂，在食品、保健品、以及药品中的应用。

具体的，所述药品包括有效量的组合物以及适当量的药学上可接受的赋形剂，所述组合物包括长双歧杆菌BL21和植物乳杆菌Lp90。

应当说明的是，所述药品可以制备成任意合适的形式，所述形式不会不利地影响形成本发明的组合物的菌株的生物利用度。因而，本发明的组合物可以配制成以下述形式口服施用：例如，冷冻干燥的粉末、胶囊、片剂、液体制品等。考虑到组合物的具体目的，赋形剂和最适当的配制方法的选择是在药物技术领域的普通技术人员的知识范围内。

本发明中所述的药品，优选为粉剂、片剂或胶囊。

本文使用的术语“药学上可接受的”是指这样的化合物、物质、组合物和/ 或剂型：其在合理的医学判断范围内，适用于接触受试者(例如人)的组织，没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。每种载体、赋形剂等还必须是“可接受的”，其含义是，与制剂的其它成分相容。合适的载体、赋形剂等可以参见标准的药学教材。

本发明组合物中的菌株也可以被包含在多种食品中，诸如乳制品、酸乳、凝乳、干酪(例如quark、奶油、加工过的、软的和硬的)、发酵乳、奶粉、基于奶的发酵的产品、冰淇淋、基于发酵的谷物的产品、基于奶的粉末、饮料、调味品和宠物食品。术语“食品”在本文中以它的最广泛的含义使用，包括处于任意呈现形式的、可以被动物摄入的任意类型的产品，但是不包括药用的和兽药用的产品。其它可食用的产品的实例是肉制品(例如肝糊、香肠和意大利腊肠或肉糊)、巧克力糊、填充物(例如松露、乳油)和霜白状糖覆、巧克力、糖果(例如焦糖糖果、软糖或太妃糖)、烘焙食品(蛋糕、馅饼)、调味料和汤、果汁和咖啡白化剂。特别令人感兴趣的食品是饮食添加物和婴儿配方。从本发明的意义上而言，饮食添加物也包括营养制品，所述营养制品已知是对人健康具有医疗效果的食品提取物。用于动物食物的饲料也被包括在本发明的范围内。本发明的组合物也可用作在其它食物产品中的成分。

具体的，所述食品或保健品包括组合物以及食品添加剂，所述组合物包括长双歧杆菌BL21和植物乳杆菌Lp90，所述食品添加剂包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、抗酸剂、以及营养强化剂中的一种或多种。

具体的，所述填充剂包括淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纤维素、三硅酸镁、以及氢氧化铝中的一种或多种；所述矫味剂为乳糖和/或蔗糖；所述崩解剂为淀粉；所述粘合剂为蔗糖；所述抗酸剂为三硅酸镁和/或氢氧化铝；所述润滑剂为滑石粉；所述营养强化剂包括维生素、矿物质、益生元和/或膳食纤维。

本发明第三方面提供一种抗衰老益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、将长双歧杆菌BL21、植物乳杆菌Lp90分别于试管中活化，得到一级种子液，再将一级种子液分别转接至种子培养基中得到二级种子液，将二级种子液分别接入发酵培养基中进行高密度发酵，待发酵液中菌体密度达到10⁹cfu/mL，分别收集所述发酵液；

S2、将所述发酵液分别离心，收集菌体后加入保护剂乳化，真空冷冻干燥制得菌粉；

S3、将菌粉与辅料复配，混合均匀得到所述抗衰老益生菌制剂。

具体的，所述辅料为低聚糖。

具体的，所述种子培养基为MRS液体培养基，所述MRS液体培养基的pH值为6.5～6.8，所述MRS液体培养基以质量分数计包括：2％的乳糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的柠檬酸氢二铵、0.2％的磷酸氢二钾、0.06％的七水硫酸镁、0.02％的一水硫酸锰、0.1％的L-半胱氨酸盐、0.1％的吐温-80、余量为水。

具体的，所述长双歧杆菌BL21的发酵培养基的pH值为6.0～7.0，以质量分数计包括：1％的乳糖、1％的葡萄糖、1％的蛋白胨、0.5％的牛肉膏、1％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的柠檬酸氢二铵、0.2％的磷酸氢二钾、0.06％的七水硫酸镁、0.02％的一水硫酸锰、0.1％的L-半胱氨酸盐、余量为水。

具体的，所述植物乳杆菌Lp90发酵培养基的pH值为6.0～7.0，以质量分数计包括：2％的葡萄糖、1％的蛋白胨、1％的牛肉膏、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的柠檬酸氢二铵、0.2％的磷酸氢二钾、0.06％的七水硫酸镁、0.02％的一水硫酸锰、0.1％的L-半胱氨酸盐、余量为水。

具体的，所述二级种子液接至发酵培养基中的接种量为1％-5％。

具体的，所述种子的培养条件为28～40℃，厌氧培养8～24h，所述发酵培养条件为30～40℃，厌氧培养8～18h。

具体的，所述长双歧杆菌BL21、植物乳杆菌Lp90二者比例为：2-5:2、或者2:1-4，所述抗衰老益生菌制剂中二者总活菌数不少于5×10⁹cfu/g。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明的抗衰老益生菌制剂，其有效成分为长双歧杆菌BL21、植物乳杆菌Lp90，研究结果表明该益生菌制剂耐受力强，抗氧化作用明显，具有广阔的市场前景，且本发明的益生菌制剂制备简单，易于工业化生产。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术 手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明中两种菌株经酸化及胆盐处理后的存活率结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一 抗衰老益生菌菌粉的制备

S1、将长双歧杆菌BL21、植物乳杆菌Lp90分别于试管中活化，得到一级种子液，再将一级种子液分别转接至种子培养基中得到二级种子液，培养条件为28～40℃，厌氧培养8～24h；将二级种子液分别接入发酵培养基中进行高密度发酵，二级种子液接至发酵培养基中的接种量为1％-5％，培养条件为30～40℃，厌氧培养8～18h，待发酵液中菌体密度达到10⁹，分别收集发酵液；

其中，种子培养基为MRS液体培养基，MRS液体培养基的pH值为6.5～6.8，MRS液体培养基以质量分数计包括：2％的乳糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的柠檬酸氢二铵、0.2％的磷酸氢二钾、0.06％的七水硫酸镁、0.02％的一水硫酸锰、0.1％的L-半胱氨酸盐、0.1％的吐温-80、余量为水。

长双歧杆菌BL21的发酵培养基的pH值为6.0～7.0，以质量分数计包括：1％的乳糖、1％的葡萄糖、1％的蛋白胨、0.5％的牛肉膏、1％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的柠檬酸氢二铵、0.2％的磷酸氢二钾、0.06％的七水硫酸镁、0.02％的一水硫酸锰、0.1％的L-半胱氨酸盐、余量为水。

植物乳杆菌Lp90发酵培养基的pH值为6.0～7.0，以质量分数计包括：2％的葡萄糖、1％的蛋白胨、1％的牛肉膏、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的柠檬酸氢二铵、0.2％的磷酸氢二钾、0.06％的七水硫酸镁、0.02％的一水硫酸锰、0.1％的L-半胱氨酸盐、余量为水。118℃灭菌20min。

S2、将所述发酵液分别离心，收集菌体后加入保护剂乳化，真空冷冻干燥制得菌粉。

实施例二 益生菌体外耐酸耐胆盐能力测试

A、菌株耐酸能力测定

方法：将菌粉按照1％(w/v)的接种量接入模拟人工胃液中(pH＝2.5)处理3h，取样进行平板菌落计数，以0时活菌数作为对照，计算菌株的存活率。

B、菌株耐胆盐能力测定

方法：菌粉按照1％(w/v)的接种量接入模拟人工肠液中(胆盐浓度0.3％)培养3h，取样进行平板菌落计数，以0时活菌数作为对照，计算菌株的存活率。

结果如图1所示，长双歧杆菌BL21、植物乳杆菌Lp90经过酸化及胆盐处理后，存活率均在60％以上，耐受能力较强。

实施例三 清除自由基能力与超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

A、材料

SOD试剂盒，H₂O₂，FeSO₄，邻苯三酚，O-菲罗啉及其他试剂均为分析纯试剂。

B、方法

1)无细胞提取物的制备

2株菌株(长双歧杆菌BL21、植物乳杆菌Lp90)在MRS培养基中37℃连续培养3代，8000r/min离心20min收集菌体，PBS缓冲液洗涤3次后重悬于PBS缓冲液中，活菌数调整在10¹⁰cfu/mL，冰浴并于超声细胞破碎仪中破碎细胞，4℃条件下离心30min后收集上清液。

2)2株菌对超氧自由基(O₂^-)的清除能力的测定

采用邻苯三酚自氧化比色分析法，将浓度为150mmol/L、pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液，以及3mmol/L二乙三胺五乙酸，1.2mmol/L的邻苯三酚加入到1mL收集的上清液中，25℃恒温反应10min，325nm下测定吸光值。

O₂^-清除率％＝(1-(A3-A1)/(A2-A0))×100％

其中，A3为含上清液及邻苯三酚；A2为不含上清、含邻苯三酚；A1为含上清、不含邻苯三酚；A0为不含上清及邻苯三酚

3)2株菌对羟自由基(HO·)清除能力的测定

2mL、pH为7.0的PBS缓冲液中加入2mLO-菲啰啉，以及2mL的浓度为2.5mmol/L的FeSO₄，20mmol/L的H₂O₂以及1mL的上清液，37℃恒温反应1.5h，536nm处测吸光值。

HO·清除率(％)＝〔(A2-A1)/(A0-A1)〕×100％

其中，A0为不含上清和H₂O₂；A1为不含上清、含H₂O₂；A2为含上清和H₂O₂。

4)2株菌的超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

用SOD试剂盒，按产品说明操作，定义每毫克蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个SOD活力单位。

C、结果与分析

清除自由基能力及SOD活性测定结果如表1所示：

表1自由基清除率及SOD活性测定结果统计表

由表1可知，长双歧杆菌BL21对超氧自由基清除率及羟自由基清除率都较好，植物乳杆菌Lp90对羟自由基清除能力较好，其中植物乳杆菌Lp90超氧化物歧化酶具有较好的活力，总体来说两株菌的抗氧化活性较强。

实施例四 抗衰老益生菌制剂的制备

实验步骤如下：

S1、长双歧杆菌BL21、植物乳杆菌Lp90分别于种子培养基中37℃培养24h制备一代种子液。所得的一级种子液转接入种子培养基中37℃培养16h制备二代种子液。

S2、二级种子液按照5％的接种量接入发酵培养基中进行高密度培养，37℃ 培养12h，发酵起始PH6.0-7.0，待发酵液活菌数达到10⁹cfu/mL，收集发酵液，离心获得菌体。

S3、收集的菌体加入保护剂后冻干得到冻干菌粉，将长双歧杆菌BL21：植物乳杆菌Lp90成比例进行复配，加入低聚糖混合均匀，制得抗衰老益生菌制剂。所得抗衰老益生菌制剂成品中两株菌菌落总数不少于5×10⁹cfu/g。

按照长双歧杆菌BL21：植物乳杆菌Lp90＝2:3比例进行复配，所得抗衰老益生菌制剂可以获得较为均衡的清除超氧自由基能力、对羟自由基清除能力、以及超氧化物歧化酶活力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。