一种青稞RPL11cDNA基因的反转录PCR方法及其PCR扩增和重组表达方法与流程

技术特征：

1.一种青稞RPL11 cDNA基因的反转录PCR方法，包括以下步骤：

(1)提取青稞320和/或喜8种子苗株新鲜叶片的总RNA；

(2)使用反转录试剂盒进行反转录操作，采用20uL反应体系：在微量离心管中加入步骤(1)提取的总RNA5uL，加入4uL的5×RT Reaction Mix、1.4uL的Oligo(dT)、1uL的TUREscript H^-RTase/RI Mix和8.6uL的8.6uL，轻轻混匀，离心；

(3)42℃加热50分钟，65℃加热15分钟；

(4)降解残余RNA；得到cDNA，-20℃保存。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)采用TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit反转录试剂盒提取总RNA。

3.一种RPL11基因的PCR方法，包括以下步骤：

(1)按表2所示的PCR反应体系，在微量离心管中加入RPL11基因cDNA与引1和引物2，引物1的核苷酸序列如序列表SEQ NO ID.1的核苷酸序列所示，引物2的核苷酸序列如序列表SEQ NO ID.2的核苷酸序列所示；

表2 PCR反应体系

(2)95℃保持5分钟进行预变性后，将94℃变性1分钟、58℃退火1分钟和72℃延伸1分钟的步骤循环30次，于72℃延伸10分钟，得扩增的RPL11基因cDNA。

4.一种重组表达质粒pET28a-RPL11，其核苷酸序列如序列表SEQ NO ID.5的核苷酸序列所示。

5.一种重组表达质粒pET28a-RPL11的制备方法，包括以下步骤：

(1)取pET28a载体与权利要求3扩增得到的RPL11基因cDNA，分别用BamHI酶与Xhol酶进行双酶切，酶切条件如表3所示；

表3 pET28a载体与RPL11基因片段的酶切条件

(2)取步骤(1)得到的pET28a载体酶切产物与RPL11基因cDNA酶切产物，进行1％琼脂糖电泳后使用胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；

(3)取0.2mL灭菌Eppendorf管一个，加入步骤(2)得到的pET28a(+)酶切回收片段0.5μl与RPL11酶切回收片段4.5μl，并加入5.0μl的T4DNA连接酶缓冲液，16℃连接过夜，得重组表达质粒pET28a-RPL11。

6.一种重组表达质粒pET28a-RPL11的表达方法，包括以下步骤：

(1)将重组表达质粒pET28a-RPL11转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞；同时将提取的空载体pET28a(+)转化表达宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，作阳性对照；BL21(DE3)感受态细胞不转化组作阴性对照；

(2)以含硫酸卡那霉素100ug/mL的LB固体培养基培养步骤(1)所述的感受态细胞；挑取LB固体培养基上生长的已转化入pET28a-RPL11的BL21(DE3)菌落接种于5mL的含硫酸卡那霉素100ug/mL的LB液体培养基；

(3)37℃振荡培养至OD600约为0.5时，取1mL按1:100比例接种于含硫酸卡那霉素的LB液体培养基中；

(4)将培养的100mL培养液分为2份，其中一份加硫代半乳糖苷诱导表达，另一份不加硫代半乳糖苷作为对照；加入硫代半乳糖苷至终浓度为0.1mmol/L，调整培养温度至25℃转速为220转每分钟，继续振荡培养16h；

(5)取硫代半乳糖苷诱导后菌液1mL，离心，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤后，加入100ul生理盐水及5×SDS上样缓冲液25ul，100℃煮沸10min，离心，取上清进行SDS-PAGE；对未诱导菌液做同样处理，观察表达情况；同时将LB液体培养未转化及空载体pET28a(+)转化的BL21作为对照。

7.根据权利要求6所述的表达方法，其特征在于，步骤(4)所述表达条件为：0.1mM硫代半乳糖苷，25℃，转速为220转每分钟。