一种用叶绿体微卫星引物对鉴定霍山石斛的方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种用于鉴定霍山石斛的叶绿体微卫星引物对及其应用。

背景技术：

霍山石斛（Dendrobium huoshanense）是安徽省大别山区特有的、国家重点保护的名贵中草药，隶属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）。由于霍山石斛同属的近缘植物比较多，导致混淆品较多。目前市场上的一些混淆品包括广东石斛、罗河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、叠鞘石斛、美花石斛和黄花石斛等。

霍山石斛与同属混淆品的形态特征比较相近，外形鉴别比较困难，采用传统的鉴定方法有一定的局限。因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保霍山石斛药材鉴定的准确性。丁小余等建立了枫斗类石斛的rDNA ITS全序列数据库，其中包括霍山石斛一个单倍型的ITS序列，研究发现枫斗类石斛在ITS区的种间差异显著而稳定，并利用该数据库对部分石斛属植物进行了准确鉴别，但没有进行霍山石斛样品的鉴别（丁小余，王峥峥，徐红，徐珞珊，周开亚，枫斗类石斛rDNA ITS区的全序列数据库及其序列分析鉴别，药学学报，2002，37（7）：567）。栗丹等利用DNA条形码ITS序列对霍山石斛及其近缘物种进行了鉴定（栗丹，李振坚，毛萍，严雪锋，淳泽，马欣荣，基于ITS序列石斛材料的鉴定及系统进化分析，园艺学报，2012，39（8）：1539），但该方法需要进行测序，耗时较长，且使用大型仪器，不利于实现快速、现场检测。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种用叶绿体微卫星引物对鉴定或辅助鉴定霍山石斛的方法。

一种用叶绿体微卫星引物对鉴定霍山石斛的操作步骤如下：

（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；

所述引物对为：上游引物CPSSR1s：5’-CGTATGCGATAGAAGAAT-3’，

下游引物CPSSR1a：5’-ATCTGTAGATTGGGCTCT-3’；

（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物

若PCR扩增产物中含有282 bp的DNA片段，则所述待测样品中含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有282 bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有霍山石斛。

进一步限定的具体鉴定操作步骤如下：

步骤（1）PCR扩增反应中，PCR反应体系的总体积25 µL，其中0.5 µL待测样品的DNA，1.0µL含量为10 pmol的上游引物CPSSR1s，1.0 µL含量为10 pmol的下游引物CPSSR1a，2.5 µL 10×buffer缓冲液，1.5 µL浓度为25 mM的氯化镁水溶液，0.5 µL浓度为10 mM的dNTPs ，0.5 µL浓度为5U/µL的Taq DNA聚合酶，无菌双蒸水补足至25 µL；

PCR扩增反应条件： 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

步骤（2）的具体操作如下：取5 µL PCR扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照；若PCR扩增产物中含有282 bp的DNA片段，则所述待测样品为霍山石斛；若PCR扩增产物中未含有282 bp的DNA片段，则所述待测样品为非霍山石斛。

一种用叶绿体微卫星引物对鉴定霍山石斛的检测试剂盒，将PCR反应体系中的上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a分别单独包装；将除待测样品的DNA、上游引物CPSSR1s和下游引物外CPSSR1a的其它物质混合均匀单独包装；将以上分别单独包装的物质放置于同一个试剂盒内，组成一个检测试剂盒。

进一步限定的检测试剂盒的技术方案如下：

根据进一步限定的鉴定操作技术方案所述的检测试剂盒，在每次检测时，需要从检测试剂盒中取用不同的物质，各种物质所取的量必须满足进一步限定的鉴定操作技术方案中PCR反应体系中各物质量的要求。

实验证明，采用本发明所提供的引物对，通过快速PCR方法实现了霍山石斛与广东石斛、罗河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、叠鞘石斛、美花石斛和黄花石斛等混淆品的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。

附图说明

图1为通用引物扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100 bp）；1：霍山石斛；2：广东石斛；3：罗河石斛；4：鼓槌石斛；5：球花石斛；6：聚石斛；7：叠鞘石斛；8：美花石斛；9：黄花石斛；10：空白对照。

图2为特异性PCR引物对cpSSR1（上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a）扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNA Marker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100 bp）；1：用特异性PCR引物对CPSSR1扩增1个霍山石斛样本的结果；2：用特异性PCR引物对CPSSR1扩增1个广东石斛的结果；3：用特异性PCR引物对CPSSR1扩增1个罗河石斛样本的结果；4：用特异性PCR引物对CPSSR1扩增1个鼓槌石斛样本的结果；5：用特异性PCR引物对CPSSR1扩增1个球花石斛样本的结果；6：用特异性PCR引物对CPSSR1扩增1个聚石斛样本的结果；7：用特异性PCR引物对CPSSR1扩增1个叠鞘石斛样本的结果；8：用特异性PCR引物对CPSSR1扩增1个美花石斛样本的结果；9：用特异性PCR引物对CPSSR1扩增1个黄花石斛样本的结果；10：空白对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于鉴定霍山石斛的试剂盒的制备及使用方法

一、用于鉴定霍山石斛的引物对的设计与合成

从GenBank查找获得霍山石斛叶绿体基因组全序列，GenBank登录号为NC_028430。利用SSRIT软件搜索叶绿体基因组全序列中的多核苷酸碱基重复序列，再通过SciRoKo 2.1软件分析校正，共搜索得到简单重复序列位点52个。利用primer5和oligo6软件对含有(AT)₂₃简单重复序列位点（叶绿体微卫星位点）的两端设计霍山石斛检测特异性PCR引物，如下：

上游引物CPSSR1s：5’-CGTATGCGATAGAAGAAT-3’（序列1）；

下游引物CPSSR1a：5’-ATCTGTAGATTGGGCTCT-3’（序列2）。

理论PCR产物长度为282 bp（序列3）

二、用于鉴定霍山石斛的试剂盒的组装

将PCR反应体系中，步骤一设计合成的上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a分别单独包装；将除待测样品的DNA、上游引物CPSSR1s和下游CPSSR1a外的其它物质混合均匀单独包装；将以上分别单独包装的物质放置于同一个试剂盒内，组成本发明用于鉴定霍山石斛的检测试剂盒。

三、鉴定待测样品中是否含有霍山石斛的方法

采用步骤二的试剂盒按照包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有霍山石斛：

1、PCR扩增

从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用步骤一设计合成的上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a外（序列1和序列2）按照如下进行PCR扩增：

PCR反应总体积25µL，包括以下试剂：0.5µL模板DNA，1.0µL上游引物CPSSR1s（10 pmol），1.0µL下游引物CPSSR1a（10 pmol），2.5µL 10×buffer缓冲液，1.5µL浓度为25 mM的MgCl₂水溶液，0.5µL浓度为10 mM的dNTPs ，0.5µL Taq DNA聚合酶（5U/µL），无菌双蒸水补足至25µL。

PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体反应条件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

2、PCR产物检测

采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物，具体如下：

取5µL扩增产物，采用2%的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有霍山石斛：若获得大小约为282 bp的目的条带（序列3），则所述待测样品中含有霍山石斛；若没有获得大小为282 bp的目的条带（序列3），则所述待测样品中不含有霍山石斛。

实施例2、采用实施例1制备的试剂盒鉴定霍山石斛的特异性分析

待测样品：霍山石斛（采自于安徽）、广东石斛（采自于广西）、罗河石斛（采自于广西）、鼓槌石斛（采自于广西）、球花石斛（采自于广西）、聚石斛（采自于广西）、叠鞘石斛（采自于广西）、美花石斛（采自于广西）和黄花石斛（采自于广西）。均符合中国植物志的鉴别特征描述。通过鉴定，各样品的实物与名称相符，质量符合标准。

一、从待测样品中提取基因组DNA

分别取约50 mg干燥样品（当然也可采用100 mg新鲜样品进行基因组DNA提取），用CTAB法提取总DNA。具体如下：

将无霉变的干燥药材置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2.0 mL的微量离心管中，加入900 µL已灭菌的CTAB提取液（配方：2%(2g/100ml)CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl）、0.02 g PVP 40000、10 µL β-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5 h-2 h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900 µL氯仿-异戊醇（体积比24：1），充分振荡混匀，12000 g离心10 min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇（体积比24：1），充分振荡混匀，12000 g离心10 min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5 h以上。取出，12000 g离心10 min，弃上清，沉淀用70 %（体积分数）乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20℃保存。

用通用引物TY2s和TY2a检测以上提取的霍山石斛、广东石斛、罗河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、叠鞘石斛、美花石斛和黄花石斛的基因组DNA质量。

TY2s：5’- CGCCATATTGATTGACACG-3’；

TY2a：5’- GGCAGCCAACGAGAAGA-3’。

反应总体系为25µL，包括DNA模板0.5µL（5- 50ng），上游引物1µL（10 pmol），下游引物1µL（10 pmol），10×PCR Buffer 2.5µL，MgCl₂（25 mM）1.5µL，dNTPs（10 mM）0.5µL，Taq DNA聚合酶（5U/µL） 0.5µL，ddH₂O补足至25µL。通用引物PCR反应条件为：95℃ 5 min、35个循环（每个循环包括95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s）、72 ℃ 10 min。

结果发现所有样品均能扩增出DNA条带（图1）。

二、PCR扩增

以步骤一从待测样品中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对（上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a）进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。

反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。

结果如图2所示，从图2中可以看出：

利用本发明的引物对（上游引物CPSSR1s和下游引物CPSSR1a）对霍山石斛、广东石斛、罗河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、叠鞘石斛、美花石斛和黄花石斛进行检测，霍山石斛能够扩增出片段大小约为282 bp的目的条带。而广东石斛、罗河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、叠鞘石斛、美花石斛和黄花石斛均未扩增出目的条带。这表明该反应体系能将霍山石斛分别与广东石斛、罗河石斛、鼓槌石斛、球花石斛、聚石斛、叠鞘石斛、美花石斛和黄花石斛准确的鉴别出来。将大小约为282 bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。