一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法与流程

本发明属于分子生物学
技术领域：
，涉及中药及中药材鉴定领域，特别涉及一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定方法。
背景技术：
：霍山石斛（Dendrobiumhuoshanense）是安徽省大别山区特有的、国家重点保护的名贵中草药，隶属于兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）。重唇石斛（Dendrobiumhercoglossum）为霍山石斛的同属近缘种，两者形态特征比较相近，制成枫斗后两者不易通过外形进行鉴别，导致在市场上重唇石斛成为霍山石斛的混淆品之一。由于霍山石斛与重唇石斛通过外形鉴别比较困难，采用传统的鉴定方法有一定的局限。因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保霍山石斛药材鉴定的准确性。栗丹等利用DNA条形码ITS序列对霍山石斛及其近缘物种进行了鉴定（栗丹，李振坚，毛萍，严雪锋，淳泽，马欣荣，基于ITS序列石斛材料的鉴定及系统进化分析，园艺学报，2012，39（8）：1539），但该方法需要进行测序，耗时较长，且使用大型仪器，不利于实现快速、现场检测。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定霍山石斛的引物对。一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定的操作步骤如下：（1）提取待测样品的DNA作为模板，采用引物对进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；所述引物对为：上游引物CP6s：5’-GCCCATAAATGGGTTTC-3’下游引物CP6a：5’-GCACATCCGAGCCTTA-3’；（2）琼脂糖凝胶电泳法检测PCR扩增产物若PCR扩增产物中含有275bp的DNA片段，则所述待测样品中含有霍山石斛；若PCR扩增产物中不含有275bp的DNA片段，则所述待测样品为非霍山石斛。进一步限定的比对鉴定技术方案如下：步骤（1）PCR扩增反应中，PCR反应体系的总体积25µL，其中0.5µL待测样品的DNA，1.0µL含量为10pmol的上游引物CP6s，1.0µL含量为10pmol的下游引物CP6a，2.5µL10×buffer缓冲液，1.5µL浓度为25mM的氯化镁（MgCl2）水溶液，0.5µL浓度为10mM的dNTPs，0.5µL浓度为5U/µL的TaqDNA聚合酶，无菌双蒸水补足至25µL；PCR扩增反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45个循环；72℃10min。步骤（2）的具体操作如下：取5µLPCR扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照；若PCR扩增产物中含有275bp的DNA片段，则所述待测样品中含有霍山石斛；若PCR扩增产物中未含有275bp的DNA片段，则所述待测样品为非霍山石斛。一种用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定的检测试剂盒，将PCR反应体系中的上游引物CP6s和下游引物CP6a分别单独包装；将除待测样品的DNA、上游引物CP6s和下游引物CP6a外的其它物质混合均匀单独包装；将以上分别单独包装的物质放置于同一个试剂盒内，组成一个检测试剂盒。进一步限定的检测试剂盒技术方案如下：根据进一步限定的比对鉴定操作技术方案所述的检测试剂盒，在每次检测时，需要从检测试剂盒中取用不同的物质，各种物质所取的量必须满足进一步限定的鉴定操作技术方案中PCR反应体系中各物质量的要求。实验证明，采用本发明所提供的引物，通过快速PCR方法实现了霍山石斛与重唇石斛之间的快速、准确鉴别，实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。附图说明图1为霍山石斛、重唇石斛及部分相似种的系统发育树。其中，谱系分支节点上方为BI树的后验概率PP和MP树的自举支持度BS，在斜线的左边为PP值，斜线的右边为BS值。图2为通用引物扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNAMarker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100bp）；1：霍山石斛；2：重唇石斛；3：：空白对照。图3为特异性PCR引物对SH-CP6（上下游引物分别为SH-CP6s和SH-CP6a）扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNAMarker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100bp）；1：用特异性PCR引物对SH-CP6扩增1个霍山石斛样本的结果；2：用特异性PCR引物对SH-CP6扩增1个重唇石斛的结果；3：空白对照。图4为特异性PCR引物对SH-CP6（上下游引物分别为SH-CP6s和SH-CP6a）扩增凝胶电泳图。M：DNA分子标准（DNAMarker，从上到下依次为2000、1000、750、500、250和100bp）；1到7：霍山石斛DNA模板浓度依次为143ng/μl、71ng/μl、36ng/μl、18ng/μl、9ng/μl、4ng/μl和2ng/μl；8到14：重唇石斛DNA模板浓度依次为143ng/μl、71ng/μl、36ng/μl、18ng/μl、9ng/μl、4ng/μl和2ng/μl。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、用于鉴定霍山石斛的试剂盒的制备及使用方法一、用于鉴定霍山石斛的引物对的设计与合成从GenBank查找或通过本研究进行测序获得霍山石斛及混淆品的ITS序列，详见下表1。其中，本研究测序所得单倍型序列（包括Hap5，Hap6和Hap7）详见序列表中序列4至序列6所示。表1霍山石斛、重唇石斛及部分相似种的ITS序列编号样品名称样品数量单倍型GenBank登录号本研究所得序列编号1铁皮石斛Dendrobiumcatenatum1Hap1KP7435432铁皮石斛Dendrobiumcatenatum1Hap2KF1434393金钗石斛Dendrobiumnobile1Hap3EF6187324金钗石斛Dendrobiumnobile1Hap4JN3885795河南石斛Dendrobiumhenanense1Hap5IHN1H6河南石斛Dendrobiumhenanense6Hap6IHN1C;IHN1E;IHN1F;IHN1G;HNITS01;IHN1D7霍山石斛Dendrobiumhuoshanense3Hap7KF143476IHS1AIHS2D8霍山石斛Dendrobiumhuoshanense1Hap8JN3885679重唇石斛Dendrobiumhercoglossum1Hap9JN38857610重唇石斛Dendrobiumhercoglossum1Hap10EU84069311美花石斛Dendrobiumloddigesii1Hap11KF14348112美花石斛Dendrobiumloddigesii1Hap12HQ11422013菱唇石斛Dendrobiumleptocladum1Hap13AF52161214菱唇石斛Dendrobiumleptocladum1Hap14EU840697分别用贝叶斯法（Bayesianinference,BI）和简约法（maximumparsimony,MP）进行系统发育分析，构建BI和MP两种系统树。构建系统树时，用人面石斛Dendrobiummacrophyllum的1条ITS序列（GenBank登录号分别为AY239979）作为外群。其中BI树用MrBayesversion3.1.2软件构建，MP树用PAUP*version4.0beta10软件构建。构建BI树时，用MrModeltestversion2.3软件根据AIC（AkaikeInformationCriterion）检验标准选择数据的最适模型，所选最适模型是（GTR+G）。马尔科夫链的蒙特卡洛方法（MarkovChainsMonteCarlo,MCMC）设置为四条链并运行1000000代。为了确定其收敛情况，MCMC分别运行两次。每100代抽取一个样本，共形成20002个样本。经过分析得知，整个运行在100000代后达到平稳，这样，总共剩余的样本数为18002，用剩余样本重建系统树并估计其后验概率值。构建MP树时，设置自举重复次数bootstrapnreps为1000次，使用启发式搜索分析自举重复数据集，启发式搜索设置为由随机逐步添加法产生起始树，重复10次，采用TBR分支交换。通过BI法和MP法构建的系统发育树表明，2种方法构建的系统树主干一致（图1）。图1中各谱系分支的节点处标有BI树的后验概率（posteriorprobability,PP）值和MP树的自举支持度（Bootstrap,BS）。结果表明，霍山石斛所有序列的单倍型形成单系（PP=1.00,BS=96）。在确定霍山石斛为单系群的前提下，用软件ClustalX1.81对表1中所有ITS序列进行对位排序和比较，找到差异片段，设计霍山石斛检测特异性PCR引物，如下：SH-CP6s：5’-GCCCATAAATGGGTTTC-3’（序列1）；SH-CP6a：5’-GCACATCCGAGCCTTA-3’（序列2）。理论PCR产物长度为275bp（序列3）二、用于鉴定霍山石斛的试剂盒的组装将PCR反应体系中，将步骤一设计合成的上游引物CP6s和下游引物CP6a分别单独包装；将除待测样品的DNA、上游引物CP6s和下游引物CP6a外的其它物质混合均匀单独包装；将以上分别单独包装的物质放置于同一个试剂盒内，即得到本发明用于霍山石斛与重唇石斛的比对鉴定的检测试剂盒。三、鉴定待测样品中是否含有霍山石斛的方法采用步骤二的检测试剂盒按照包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有霍山石斛：1、PCR扩增从待测样品中提取基因组DNA作为模板，采用步骤一设计合成的上游引物CP6s和下游引物CP6a按照如下进行PCR扩增：PCR反应总体积25µL，包括以下试剂：0.5µL模板DNA，1.0µL10浓度pmol的上游引物CP6s（10pmol），1.0µL浓度pmol的下游引物CP6a（10pmol），2.5µL10×buffer缓冲液，1.5µL浓度为25mM的MgCl2水溶液，0.5µL浓度为10mM的dNTPs，0.5µLTaqDNA聚合酶（5U/µL），无菌双蒸水补足至25µL。PCR反应液配制完后，轻轻震荡混匀，将PCR管放入PCR仪中，进行PCR扩增，具体反应条件如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，45个循环；72℃10min。2、PCR产物检测采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物，具体如下：取5µL扩增产物，采用2%的琼脂糖凝胶，在电压80-90V下电泳30分钟，凝胶成像系统下观察并拍照。根据目的条带的大小，按照如下方法确定待测样品中是否含有霍山石斛：若获得大小约为275bp的目的条带（序列3），则所述待测样品中含有霍山石斛；若没有获得大小为275bp的目的条带（序列3），则所述待测样品中不含有霍山石斛。实施例2、采用实施例1制备的试剂盒鉴定霍山石斛的特异性分析待测样品：霍山石斛（采自于安徽）和重唇石斛（采自于广西）。均符合中国植物志和相关文献的鉴别特征描述。通过鉴定，各样品的实物与名称相符，质量符合标准。一、从待测样品中提取基因组DNA分别取约50mg干燥样品（当然也可采用100mg新鲜样品进行基因组DNA提取），用CTAB法提取总DNA。具体如下：将无霉变的干燥药材置于粉碎机中研磨粉碎，过40目筛。将粉末转移到2.0mL的微量离心管中，加入900µL已灭菌的CTAB提取液（配方：2%(2g/100ml)CTAB，100mmol/LTris-HClpH=8.0，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl）、0.02gPVP40000、10µLβ-巯基乙醇充分振荡混匀，65℃水浴1.5h-2h，期间轻摇2-3次。结束后取出冷却至室温，加入900µL氯仿-异戊醇（体积比24：1），充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入等体积氯仿-异戊醇（体积比24：1），充分振荡混匀，12000g离心10min。取上清，加入2/3体积预冷的异丙醇溶液，-20℃放置0.5h以上。取出，12000g离心10min，弃上清，沉淀用70%（体积分数）乙醇洗涤两次，37℃挥干乙醇，用适量灭菌水溶解，-20℃保存。用通用引物TY1s和TY1a检测以上提取的霍山石斛和重唇石斛的基因组DNA质量。TY1s：5’-GATGGATGAACCCTCAAATC-3’；TY1a：5’-GGCAGCCAACGAGAAGA-3’。反应总体系为25µL，包括DNA模板0.5µL（5-50ng），上游引物TY1s1µL（10pmol），下游引物TY1a1µL（10pmol），10×PCRBuffer2.5µL，MgCl2（25mM）1.5µL，dNTPs（10mM）0.5µL，TaqDNA聚合酶（5U/µL）0.5µL，ddH2O补足至25µL。通用引物PCR反应条件为：95℃5min、35个循环（每个循环包括95℃30s，55℃30s，72℃30s）、72℃10min。结果发现所有样品均能扩增出DNA条带（图2）。二、PCR扩增以步骤一从待测样品中提取的基因组DNA为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对（上游引物CP6s和下游引物CP6a）进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。结果如图3所示，从图中可以看出：利用本发明的引物对（上游引物CP6s和下游引物CP6a）对霍山石斛和重唇石斛进行检测，霍山石斛能够扩增出片段大小约为275bp的目的条带。而重唇石斛未扩增出目的条带。这表明该反应体系能将霍山石斛与重唇石斛准确的鉴别出来。将大小约为275bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。实施例3、采用实施例1制备的试剂盒鉴定霍山石斛的灵敏度分析待测样品：霍山石斛（采自于安徽）。通过鉴定，样品实物与名称相符，质量符合标准。一、从待测样品中提取基因组DNA分别取约50mg干燥样品（当然也可采用100mg新鲜样品进行基因组DNA提取），用CTAB法提取总DNA。具体操作参见实施例2步骤一。二、PCR扩增将步骤一从霍山石斛中提取的基因组DNA进行倍比稀释，得到基因组DNA浓度分别为143ng/μl、71ng/μl、36ng/μl、18ng/μl、9ng/μl、4ng/μl和2ng/μl的系列稀释液，以系列稀释液分别为模板，采用实施例1步骤一设计的引物对（上游引物CP6s和下游引物CP6a）进行PCR扩增。具体的反应体系和反应条件同实施例1步骤三1。实验同时设置以双蒸水为模板作为阴性对照。实验重复三次。反应结束后，按照实施例1中步骤三2的方法对待测样品进行鉴定。结果如图4所示，从图中可以看出：利用本发明的引物对（上游引物CP6s和下游引物CP6a）对霍山石斛进行检测，当模板浓度为36ng/μl时仍能够检测到大小约为275bp清晰的目的条带。将大小约为275bp的目的条带回收测序，其序列正为序列表中序列3。当前第1页1 2 3