LOC100130238作为检测前列腺癌的分子标记物及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及LOC100130238作为检测前列腺癌的分子标记物及其应用。
背景技术：
：前列腺癌是发生于男性前列腺组织中的恶性肿瘤，在全球范围内已经成为男性第二大类常见肿瘤，位于癌症相关死亡率第六位。在欧美等发达国家和地区，它是男性最常见的恶性肿瘤，其死亡率居各种癌症的第二位；在亚洲，其发病率低于西方国家，但近年来呈迅速上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。我国前列腺癌发病率也在逐年提高，已位于男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第三位，仅次于膀胱癌和肾癌。前列腺癌一般在50岁以后发病，95％发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80％的病人首先发现远处转移病灶才发现前列腺癌。此时，病变已达晚期，预后不良。所以，前列腺癌的早期诊断对前列腺癌病人的治疗有极为重大的意义。目前前列腺癌的临床诊断方式目前主要有前列腺直肠指检(DRE)、血清前列腺特异性抗原(PSA)检测、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检是前列腺癌诊断的经典技术，主要通过医生的食指触摸前列腺，以判断前列腺结节的大小和形状，从而判断是否患有前列腺癌。但直肠指检的局限性也很强：(1)患者前列腺肿块不大时，易漏诊；(2)部分患者前列腺癌肿大不明显，但已属于晚期；(3)患者直肠有疾患时不能使用此检测；(4)医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。前列腺超声波检测虽然操作简单直观、无损伤，但该方法容易与前列腺炎和前列腺肥大混同，已不再用于前列腺癌分期诊断。活组织病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但它是前列腺癌确诊的金标准，一般与其他方法技术连用。目前对前列腺癌的筛查诊断主要依靠血清PSA检测和前列腺穿刺病理活检相结合的方法。正常情况下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病状态时，PSA升高成为目前筛查前列腺癌最敏感的瘤标，但PSA增高也常见与非前列腺癌疾病，如前列腺炎症、前列腺增生等多重泌尿系统疾病有关，因此不易确诊，甚至可能导致疾病的误检、误诊或者病情的延误。此外，PSA增高确诊前列腺癌时，往往患者已经属于中后期，达不到早期诊断的目的。而穿刺活检的检出率与活体穿刺的次数、位置都有较大关系，不是非常稳定的诊断方案。因此，研究更有效的前列腺癌标记物对提高前列腺癌的早期诊断及为患者制定合理的个体化治疗方案，减少前列腺癌患者死亡率和改善生活质量有重要的意义，如果能有一种检测试剂盒，可以提高前列腺癌的检出率和准确率，对于前列腺癌的临床治疗有着重大的意义。LOC100130238属于lncRNA(longnon-codingRNA，长链非编码RNA)，是一类转录本长度超过200bp核苷酸的非编码RNA，近年研究发现它是一类具有重要生物学功能的RNA，参与基因组印记、染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程，在细胞分化和发育、基因转录和翻译、遗传和表观遗传等生命活动中均发挥重要的调控作用。近年来，越来越多的权威研究证实lncRNA在肿瘤的发生发展中起着抑制或促进肿瘤的作用，在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭转移能力等方面，均具有十分重要作用。目前己有较多lncRNAs被证实在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、结肠癌、膀胱癌等在内的人类多种肿瘤中存在差异表达并执行重要的调控功能。早期有效检测肿瘤的发生、发展及提高抗癌药物的疗效对于癌症的治疗尤为重要，发明新型肿瘤标志物作为诊断与治疗的靶点一直是肿瘤研究的热点。近年来的研究表明，lncRNA与前列腺癌密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。技术实现要素：为了实现前列腺癌的早期发现，早期干预，本发明的目的在于提供一种与前列腺癌相关的新的分子标记物。本发明的第二目的是提供一种治疗前列腺癌的制剂。本发明的第三目的是提供所述的制剂在制备预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物中的应用。本发明的第四目的是提供一种前列腺癌诊断试剂盒。本发明的第五目的是提供所述分子标记物在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗、监测及预后中的应用。为实现上述目的，本发明首先提供一种检测前列腺癌的分子标记物，所述分子标记物为LOC100130238，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。优选的，所述分子标记物LOC100130238包含如SEQIDNO:2所示的特异核苷酸序列。本发明经研究发现LOC100130238在前列腺癌生物学样品中表达上调，显示LOC100130238与前列腺癌的肿瘤发生、发展存在着密切的相关性。进一步地，本发明提供了一种治疗前列腺癌的制剂，所述制剂中含有抑制LOC100130238表达的试剂。进一步地，本发明提供了所述的制剂在制备预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物中的应用。优选的，所述制剂制备的药物包括LOC100130238的siRNA。进一步地，本发明提供了一种前列腺癌诊断试剂盒，所述诊断试剂盒含有扩增如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的引物对。优选的，所述的前列腺癌诊断试剂盒，其特征在于包括定量PCR反应体系：(1)特异扩增如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列和对照GAPDH两对引物；检测如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的引物序列如下：上游引物序列：SEQIDNO:3下游引物序列：SEQIDNO:4对照GAPDH的引物序列如下：上游引物序列：SEQIDNO:5下游引物序列：SEQIDNO:6(2)SYBRGreen聚合酶链式反应体系，包括PCR缓冲液、SYBRGreen荧光染料、dNTPs等。进一步地，本发明提供了该分子标志物或诊断试剂盒在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗、监测及预后中的应用。优选的，所述应用是通过检测被试者组织样本中LOC100130238的含量，并与正常水平LOC100130238的含量相比较，以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗、监测及预后。本发明的有益效果如下：本发明公开了一种检测前列腺癌的分子标记物LOC100130238，并进一步证实LOC100130238在前列腺癌组织中表达上调。利用该分子标记物检测前列腺癌不仅能够快速有效的做到早期检测，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。附图说明图1本发明中实施例2中前列腺癌组织样本中LOC100130238表达上调；图2本发明中实施例4中LOC100130238-siRNA显著抑制前列腺癌细胞增殖。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。本发明的发明人对10例前列腺癌组织样本及对应癌旁组织样本进行高通量测序，结合生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选lncRNALOC100130238，现有研究中并没有LOC100130238和前列腺癌相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了LOC100130238在前列腺癌组织中表达上调，其相关制剂可用于治疗前列腺癌。本发明的LOC100130238是在本发明之前的已知lncRNA，其基本信息如下：Genbank登录号：GeneID:100130238，来源于人类基因组。本发明采用RT-PCR方法检测上述lncRNA在前列腺癌患者和正常人群中的表达，并验证了该lncRNA在前列腺癌患者中表达上调。荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。荧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。CCK-8法是一种新型的检测细胞增殖的方法。与MTT比色法不同的是它的检测原理为活细胞线粒体脱氢酶转化的黄色结晶为高度水溶性，不需要裂解细胞，可直接进行比色。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，参比波长为600-650nm。该方法已广泛用于细胞增殖测定、抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤药敏感试验。它的特点是操作简便，不需要放射性同位素和有机溶剂，检测灵敏度高，对细胞毒性小，重复性优于MTT法。本发明LOC100130238的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次扩增，然后再将多次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。实施例1高通量测序筛选差异表达基因1、取样选取10例新鲜前列腺癌组织及对应癌旁组织，取样来源于北京协和医院2012年10月到2015年12月期间行根治性前列腺切除并双侧盆腔淋巴结清扫术的前列腺癌病人，手术切除前列腺后在病理科医生的指导下立即取前列腺癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。2、对组织样本进行总RNA提取采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：①入1mLTrizol，室温保存5分钟；②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。3、RNA样品的质量分析RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。4、高通量测序测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOntology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达LOC100130238，LOC100130238在前列腺癌样本组织中表达上调。实施例2RT-PCR验证前列腺癌组织中LOC100130238表达情况1、材料选取10例前列腺癌患者，取样来源于北京协和医院2012年10月到2015年12月期间行根治性前列腺切除并双侧盆腔淋巴结清扫术的前列腺癌病人，手术切除前列腺后在病理科医生的指导下立即取前列腺癌及癌旁组织放入液氮，编号后置-80℃低温冰箱保存。2、方法2.1对被试者组织样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。2.2逆转录合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。2.3、Real-TimePCR2.3.1仪器及分析方法用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△Ct法进行数据相对定量分析。2.3.2引物设计采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NR_024563.1(LOC100130238)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如表1所示：表1引物序列操作过程如下：(一)反应体系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，货号4367659)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，61℃45sec，72℃35sec)×40个循环。表2RealTime反应体系(二)引物筛选将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。(三)样品RealTime-PCR检测将各样品cDNA10倍稀释后取2μL作模板，分别对目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。(四)琼脂糖电泳上述反应结束后，取5μL的PCR产物进行2％琼脂糖电泳，用快速胶回收试剂盒(invitrogen公司)将大小为287bp的片段进行切胶回收并测序，结果用blast软件进行同源性分析。(五)实验结果实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较LOC100130238在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中LOC100130238在前列腺癌组织中的表达水平为对照组织的3.5倍，如图1所示。以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析LOC100130238在前列腺癌患者中表达上调的结果。RT-PCR产物经回收后，在ABI3730全自动测序仪上测序，该287bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。用VectorNTIadvance10软件(Invitrogen公司)将该序列与LOC100130238整个mRNA序列进行比对，比对结果显示，如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列为LOC100130238的一部分序列，符合率为100％。实施例3RNAi干扰LOC100130238表达一、材料(一)细胞来源市售前列腺癌PC-3细胞系(采购于上海博研生物科技有限公司)。(二)siRNA设计与合成依据在线设计软件siDirectversion2.0(http://design.rnai.jp/)，根据基因序列参照NCBI:NR_024563.1(LOC100130238)，设计相应的siRNA，具体序列见表3。设计后送往合成公司合成。表3siRNA序列列表二、实验方法细胞分组及转染1.细胞分组C组：空白对照组；C1组：转染脂质体组；C2组：转染非特异性的siRNA组；S1，S2，S3组：转染特异性的siRNA组。2.转染按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent提供的步骤进行。(1)将前列腺癌PC-3细胞系接种在6孔板上，这些用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70％；(2)准备siRNA-LipofectamineTM2000复合物:a.以250uLOpti-MEM稀释5μL的LipofectamineTM2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。b.实验各组分别取5uL20μM/LsiRNA加入250uLOpti-MEM中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；c.孵育5分钟后，将稀释的siRNA和LipofectamineTM2000混合后在室温下孵育20分钟。(3)在培养板中的每个孔中均匀加入细胞、培养基及siRNA-LipofectamineTM2000复合物。然后轻轻摇动培养板，使他们充分混合；(4)放置在37℃，CO2培养箱内孵育48小时，在荧光显微镜下观察细胞转染数量，检测转染效率；(5)转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值，细胞的转染效率均达到90％以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：转染效率＝发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量×100％3.应用Real-timePCR方法检测转染前后LOC100130238表达的变化(1)标准曲线的构建：选取在50mLPC-3细胞1瓶，提取RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的DNA模板十倍稀释，得到相当于104-101copies/μL的DNA模板，分别加入LOC100130238基因引物和内参引物，配制25μL反应体系，使用Real-timePCR扩增仪，进行PCR扩增反应。得到LOC100130238和内参的标准曲线。(2)Real-timePCR方法检测转染前后LOC100130238基因表达的变化：提取各组细胞的RNA，测定RNA浓度和纯度，进行逆转录反应，每组DNA模板同时进行LOC100130238和内参的Real-timePCR反应，实验重复三次。(3)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。三、实验结果分别3条LOC100130238的siRNA及对照siRNA转染第一代前列腺癌细胞，结果显示在大量前列腺癌细胞内发现绿色荧光，证明前列腺癌细胞内已经得到了siRNA的转染，然后在荧光镜和光镜下观察前列腺癌细胞数量，进行转染效率的检测，结果显示转染率均达到90％以上。Real-timePCR结果显示，转染非特异性的siRNA组对前列腺癌PC-3细胞中LOC100130238表达无明显抑制作用，和空白对照组无统计学差异，转染的3个LOC100130238siRNA组都对前列腺癌细胞中LOC100130238表达起到一定抑制作用抑制率为46％，其中LOC100130238-siRNA2和LOC100130238-siRNA3抑制效果最明显，抑制率达55％和68％。实施例4CCK-8法检测前列腺癌细胞的增殖情况细胞的siRNA转染(以六孔板为例)，转染方法同实施例3。二、细胞增殖实验1.细胞消化后重悬，接种于96孔板中，每孔加入约1×104细胞。2.按照实验分组：空白对照组、前列腺癌细胞加非特异性的siRNA组、前列腺癌细胞加LOC100130238-siRNA3组，每组6个重复。3.实验条件为37℃，5％CO2及100％湿度。4.接种0h、24h、48h后，每孔分别加入10ulCKK-8试剂，并在细胞培养箱中继续孵育2小时。5.将酶标仪波长设定为570nm，检测每个孔的光吸收值(OD)，参比波长630nm(600-650nm)。7.以各孔光吸收值减去空白孔光吸收值的平均值作为实际光吸收值，取平均值，以0h、24h、48h时间点光吸收值作曲线，反映细胞的增殖情况。三、实验结果如图2所示，siRNA-NC表示前列腺癌细胞加非特异性的siRNA实验组细胞增殖的情况，si-LOC100130238表示前列腺癌细胞加LOC100130238-siRNA3实验组细胞增殖的情况，两者对比可以看出LOC100130238-siRNA3显著抑制前列腺癌细胞的增殖，可用于前列腺癌药物的制备。实施例5试剂盒的制备基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的用于检测前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增LOC100130238的引物对如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，和特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；还包括SYBRGreen聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBRGreen荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4；还包括前列腺正常组织cDNA：作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表3所示：表3PCR反应体系组分加入量SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5μL上游引物(10μM)1.0μL下游引物(10μM)1.0μL模板cDNA2.0μL加入灭菌蒸馏水至25μL最佳反应条件为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，61℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。实施例6本前列腺癌的诊断试剂盒的应用1、病例选取20例待筛查的前列腺癌患者，取样来源于北京协和医院2012年10月到2015年12月期间泌尿科治疗的病人。获取所有研究对象的前列腺癌组织样本，编号后置-80℃低温冰箱保存。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。2、方法使用常规方法或使用特定的试剂盒提取RNA，反转录成cDNA，用实施例5中的试剂盒进行检测反应。以试剂盒中前列腺正常组织cDNA作为QPCR定量检测中的对照cDNA，检测组织样本中的LOC100130238相对前列腺正常组织表达量变化。3、结果通过溶解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCt法进行相对定量，样本和对照间比较采用t检验，P<0.05为差异显著。结果显示，待筛查的20例前列腺癌患者的组织样本中有8例患者组织样本中LOC100130238的表达量和前列腺癌正常组织表达量无显著差异；有12例患者组织样本中LOC100130238的表达量是前列腺癌正常组织表达量的1倍以上，其中有9例患者组织样本中LOC100130238的表达量是前列腺癌正常组织表达量的3倍以上。经临床进一步检测，20例待筛查的患者中确诊9例前列腺癌，这9例前列腺癌患者与本发明制备的试剂盒检测结果一致。据此推断，本前列腺癌的诊断试剂盒可以明确区分出前列腺癌患者，并以此为临床提供诊断线索。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3