本发明涉及单核苷多态性rs1800796位点在检测ATDH易感性中的应用。
背景技术：
结核病(Tuberculosis，TB)是当今全球关注的三大传染病之一，为全球公共卫生日益严峻的挑战和负担。我国结核病患者数量居世界第二位，儿童是结核病易感人群。
由异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RMP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)等一线抗结核药物引起的药物性肝毒性反应(antituberculosis drug-induced hepatotoxicity，ATDH)是部分结核病患儿抗结核治疗中断以及失败的重要原因。因此，进行ATDH遗传易感性研究，对于调整用药方案，消除结核病、降低死亡率、保障人民健康以及推动首都经济、卫生事业健康持续发展有重要科学价值和社会效益。
技术实现要素：
本发明的目的是提供单核苷多态性rs1800796位点在检测ATDH易感性中的应用。
本发明首先保护用于检测rs1800796SNP位点的核苷酸的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为评价或辅助评价待测者患药物性肝毒性反应的风险性。
所述待测者为结核患者。所述结核患者具体可为肺结核患者、结核性脑膜炎患者、血行播散型结核患者、腹腔结核患者、淋巴结结核患者或其他结核患者。
所述待测者具体可为儿童。所述儿童具体可为小于17岁的儿童。所述儿童具体可为汉族儿童。
所述用于检测rs1800796SNP位点的核苷酸的物质具体可为由引物F1和引物R1组成的特异引物对。
G等位基因为风险基因。携带G等位基因的待测者患药物性肝毒性反应的风险性高于不携带G等位基因的待测者。GG基因型的待测者或CG基因型的待测者患药物性肝毒性反应的风险性高于CC基因型的待测者。
本发明还保护一种产品，含有用于检测rs1800796SNP位点的核苷酸的物质；所述产品的功能为评价或辅助评价待测者患药物性肝毒性反应的风险性。
所述待测者为结核患者。所述结核患者具体可为肺结核患者、结核性脑膜炎患者、血行播散型结核患者、腹腔结核患者、淋巴结结核患者或其他结核患者。
所述待测者具体可为儿童。所述儿童具体可为小于17岁的儿童。所述儿童具体可为汉族儿童。
所述用于检测rs1800796SNP位点的核苷酸的物质具体可为由引物F1和引物R1组成的特异引物对。
所述产品还可包括记载有如下判断标准(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)的载体：
(Ⅰ)G等位基因为风险基因；
(Ⅱ)携带G等位基因的待测者患药物性肝毒性反应的风险性高于不携带G等位基因的待测者；
(Ⅲ)GG基因型的待测者或CG基因型的待测者患药物性肝毒性反应的风险性高于CC基因型的待测者。
本发明还保护由引物F1和引物R1组成的特异引物对。
本发明还保护所述特异引物对在制备用于评价或辅助评价待测者患药物性肝毒性反应的风险性的产品中的应用。
所述待测者为结核患者。所述结核患者具体可为肺结核患者、结核性脑膜炎患者、血行播散型结核患者、腹腔结核患者、淋巴结结核患者或其他结核患者。
所述待测者具体可为儿童。所述儿童具体可为小于17岁的儿童。所述儿童具体可为汉族儿童。
G等位基因为风险基因。携带G等位基因的待测者患药物性肝毒性反应的风险性高于不携带G等位基因的待测者。GG基因型的待测者或CG基因型的待测者患药物性肝毒性反应的风险性高于CC基因型的待测者。
本发明还保护一种用于评价或辅助评价待测者患药物性肝毒性反应的风险性的产品，含有所述特异引物对。
所述待测者为结核患者。所述结核患者具体可为肺结核患者、结核性脑膜炎患者、血行播散型结核患者、腹腔结核患者、淋巴结结核患者或其他结核患者。
所述待测者具体可为儿童。所述儿童具体可为小于17岁的儿童。所述儿童具体可为汉族儿童。
所述用于检测rs1800796SNP位点的核苷酸的物质具体可为由引物F1和引物R1组成的特异引物对。
所述产品还可包括记载有如下判断标准(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)的载体：
(Ⅰ)G等位基因为风险基因；
(Ⅱ)携带G等位基因的待测者患药物性肝毒性反应的风险性高于不携带G等位基因的待测者；
(Ⅲ)GG基因型的待测者或CG基因型的待测者患药物性肝毒性反应的风险性高于CC基因型的待测者。
本发明还保护rs1800796SNP位点作为标志物在开发或设计或制备评价或辅助评价待测者患药物性肝毒性反应风险性的产品中的应用。
以上任一所述rs1800796SNP位点为如下(a1)或(a2)：
(a1)人基因组DNA中序列3所示核苷酸的第134位；
(a2)以待测人的基因组DNA为模板，采用特异引物对扩增得到的扩增产物的自5’末端第134位核苷酸；所述特异引物对由引物F1和引物R1组成。
所述引物F1为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物R1为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。
本发明的发明人开发了rs1800796SNP位点并将该位点与多种疾病进行了关联分析，发现rs1800796SNP位点的G等位基因为结核病患儿抗结核药物治疗过程中ATDH发生的风险因素，rs1800796SNP的多态性与ATDH具有很高的相关性。因此，通过检测该位点的核苷酸种类，判断该位点的基因型可用于检测抗结核治疗后ATDH易感性或患有ATDH的风险，基因型为GG的个体与CC个体相比，更容易发生ATDH或发生ATDH风险高。本发明所提供的应用和产品在诊断并治疗结核病，从而在合理预防结核病方面具有重要意义和价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。ULN代表正常值上限(upper limits of normal)。
研究对象：2005-2014年在首都医科大学附属北京儿童医院住院治疗的结核病患儿230例(均是在患儿和家长知情同意的前提下)。230例患儿中，肺结核患儿123例，结核性脑膜炎患儿40例，血行播散型结核患儿47例，腹腔结核患儿14例，淋巴结结核患儿4例，其他结核患儿2例。230例研究对象的年龄范围是0.17-16.42岁，中位数是5.38岁，四分位数是1.60岁，四分之三位数是10.00岁。230例研究对象均为中国汉族儿童。
结核病患儿的纳入标准：①临床诊断为结核病；②以标准化疗剂量及方案接受抗结核化疗时间超过2周；③中国，汉族，年龄在0-16岁间；④基础肝肾功能正常。满足①至④四项者即可纳入结核病患儿。
结核病诊断标准：根据美国胸科协会制定的《成人和儿童结核病诊断和分级标准》和中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的《儿童肺结核的临床诊断标准和治疗方案(试行)》进行结核病诊断。结核病临床诊断标准具体如下：①活动性结核病接触史；②PPD试验阳性；③抗结核治疗有效；④排除其他疾病；满足①至④中的任意2项，并具有典型临床症状和影像学证据，临床诊断为结核病。
ATDH判断标准：满足以下4项中任意1项即可诊断为ATDH：
①血清ALT含量>(2×ULN)；ALT代表丙氨酸氨基转移酶；血清ALT相应的ULN＝40IU/L；
②血清DBil含量>(2×ULN)；DBil代表直接胆红素；血清DBil相应的ULN＝6.8μmol/L；
③血清AST含量、血清ALP含量和血清Tbil含量均>(1×ULN)，且其中n1项>(2×ULN)，n1≥1；AST代表天门冬氨酸氨基转移酶，ALP代表碱性磷酸酶，Tbil代表总胆红素；血清AST相应的ULN＝40IU/L，血清ALP相应的ULN＝220IU/L，血清Tbil相应的ULN＝19.0μmol/L；
④满足标准a和标准b；
标准a：血清ALT含量、血清DBil含量、血清AST含量、血清ALP含量和血清Tbil含量，上述5项中的n2项>(1×ULN)，n2≥1；血清ALT相应的ULN＝40IU/L，血清DBil相应的ULN＝6.8μmol/L，血清AST相应的ULN＝40IU/L，血清ALP相应的ULN＝220IU/L，血清Tbil相应的ULN＝19.0μmol/L；
标准b：具有如下任意一种或多种肝毒性疑似症状：皮肤巩膜黄染、肝区不适、恶心、呕吐、厌食、发热、皮疹、瘙痒等肝毒性疑似症状。
ATDH入组标准：①ATDH发生在抗结核化疗开始后；②排除外病毒感染、新生儿黄疸、肝肾基础疾病及其他疾病引起的ATDH；③抗结核化疗药物减量或停用后，ATDH症状减轻；④排除其他药物致ATDH的可能性。满足①至④四项者即可诊断为ATDH。
对照组入组标准：抗结核化疗后，肝功能仍正常者。
基于上述标准，将230例结核病患儿分成ATDH组和对照组，ATDH组41例，对照组189例。
实施例1、rs1800796的单核苷酸多态性与儿童ATDH相关(病例-对照分析)
一、鉴定各个研究对象基于各个SNP位点的基因型
各个研究对象分别进行如下操作：
1、抽取外周静脉血，提取基因组DNA。
2、检测研究对象基于rs1800796SNP位点的基因型，具体步骤如下：
(1)以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增。
F1(上游引物；序列1)：5’-CTAAGTGGGCTGAAGCAGGTGAA-3’；
R1(下游引物；序列2)：5’-CAAGCCTGGGATTATGAAGAAGG-3’。
PCR扩增的反应体系的组成如下(50μl)：基因组DNA 0.50ng、上游引物30pmol、下游引物30pmol、2×TaqPlantinum PCR MasterMix25μl和去离子水。2×TaqPlantinum PCR MasterMix购自天根生化科技(北京)有限公司，货号KT204。
PCR扩增的反应条件：94℃变性3min；94℃30s、57℃30s、72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。
(2)将步骤(1)PCR扩增产物进行测序。
rs1800796SNP位点为人基因组DNA中序列3所示核苷酸的第134位，为C/G多态。各个研究对象的PCR扩增产物均如序列表的序列3所示。基于rs1800796SNP位点，研究对象的基因型为CC基因型、GG基因型或CG基因型。
3、检测研究对象基于rs10242595SNP位点的基因型，具体步骤如下：
(1)以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增。
F2(上游引物；序列4)：5’-GAGTGGTGCGTGGTGTAGGGTCT-3’；
R2(下游引物；序列5)：5’-CCTCTGGCAATGTATGCTTATCT-3’。
PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应条件同步骤2的(1)。
(2)将步骤(1)PCR扩增产物进行测序。
rs10242595SNP位点为人基因组DNA中序列6所示核苷酸的第137位，为A/G多态。各个研究对象的PCR扩增产物均如序列表的序列6所示。基于rs10242595SNP位点，研究对象的基因型为AA基因型、GG基因型或AG基因型。
4、检测研究对象基于rs12531874SNP位点的基因型，具体步骤如下：
(1)以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增。
F3(上游引物；序列7)：5’-ATTTCCTCTGTACCTTAGGCTTTT-3’；
R3(下游引物；序列8)：5’-TGTGGGCTCCTGTAACATTTCTT-3’。
PCR扩增的反应体系和PCR扩增的反应条件同步骤2的(1)。
(2)将步骤(1)PCR扩增产物进行测序。
rs12531874SNP位点为人基因组DNA中序列9所示核苷酸的第193位，为G/A多态。各个研究对象的PCR扩增产物均如序列表的序列9所示。基于rs12531874SNP位点，研究对象的基因型为GG基因型、AA基因型或GA基因型。
二、与ATDH的相关性分析
使用在线Shesis软件(http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm)对各个SNP位点进行等位基因频率和基因型频率的统计、哈温平衡(HWE)遗传学分析、针对等位基因和基因型分别进行ATDH组和对照组的卡方检测和odds ratio(优势比)的计算，上述3个SNP位点中，rs1800796SNP位点为与ATDH显著相关的SNP位点,rs10242595SNP位点和rs12531874SNP位点为与ATDH不相关的SNP。ATDH组患儿rs1800796SNP位点的G等位基因所占比例相对对照组患儿显著增加(46.3％vs.26.5％,P＝1.86×10-3)，即rs1800796SNP位点的G等位基因为儿童ATDH易感的风险因素。
ATDH组和对照组中，基于上述3个SNP位点的等位基因频率结果和相关性分析结果见表1。人为二倍体，因此等位基因数量为患儿数量的2倍。
表1
OR(95％CI)表示odds ratio(95％的置信区间)；
aP值由哈温平衡(HWE)分析获得，当P值﹤0.05时，提示纳入研究人群存在偏倚。
bP值由表示统计学意义，经过Bonferroni矫正，当P﹤0.05表示比较的样本有显著差异。
ATDH组和对照组中，基于上述3个SNP位点的基因型患者的个数和频率见表2。
表2