人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及分子遗传学，具体涉及人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用。

背景技术：

短串联重复序列基因座(Short Tandem Repeat，STR)是目前普遍应用的遗传标记。其广泛存在于原核及真核生物基因组中，是一类由2～6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列。不同数目的核心序列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。STR标记与其他遗传标记物相比，STR基因座片段小、容易扩增，更适用于微量和降解检材，各基因座的扩增条件相近而能够复合扩增，因而具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，与以往RFLP等技术相比，STR复合扩增技术具有极大的优越性。

Y染色体STR遗传标记是指存在于人类Y染色体非重组区域的短串联重复序列。目前，以各种形式确认并命名的Y-STR基因座已有220多个，将已发现的Y染色体STR遗传标记与常染色体STR遗传标记相比，大多数Y染色体STR遗传标记具有复杂重复结构，含有两种或两种以上的不同重复单位，群体中个体的核心重复序列或重复次数不同，形成群体遗传多态性。Y染色体STR遗传标记具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征，将其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合，可进行法医学个体识别、亲子鉴定及DNA家谱构建等。

法医上将突变率高于1％的基因座称为快速突变基因座(Rapidly Mutating Y-STR)。快速突变基因座具有较高的相关男性区分能力，而且一般具有较高的多态性，但基因座突变率较高会干扰某些情况的Y-STR家系排查。

目前法医上利用Y-STR进行建库，主要功能是家系排查，缩小嫌疑人范围，而非认定嫌疑人。在中国，特别是农村，主要是家族聚居的方式，在Y-STR建库的实际操作过程中，往往只对一个大家族中一个或者几个成员进行采样建库，这样在花费较小的情况下就能利用Y-STR快速缩小侦查范围，然后通过比对常染色体STR，对嫌疑人进行认定。由于Y-STR建库采样的一个或几个人即代表了整个家系的Y-STR信息，这就存在一种不利的情况：嫌疑人属于此家系一员，但与建库对象Y-STR有3个或更多基因座分型不一致，此时容易将嫌疑人所属的真实家系排除。如果建库试剂盒中快速突变基因座较多，那么这种可能性会变得非常高。另一方面，由于Y-STR建库主要目的不是认定嫌疑人，不需要区分相关男性，因而快速突变基因座的优势在这里用处不大。所以，不建议在这种情况下使用快速突变率的基因座。然而，低突变率基因座往往多态性较低，不利于家系之间的区分。因此，需要基因座的数量要多，同时基因座的多态性要高，以保证Y-STR试剂盒具有足够高的整体多态性。

目前市场上主流的商品化试剂盒通常采用的是五色荧光检测技术。但随着Y-STR建库市场的扩大，现有的Y-STR试剂盒已无法满足目前市场的需求，市场急需一个的个体识别率更高，检测基因座数更多的Y-STR试剂盒。然而五色荧光技术对检测基因座数存在一定的限制，因此六色荧光检测技术的建立和应用，是STR荧光检测试剂盒的必然趋势。据此，我们在目前已广泛使用的五色荧光检测基础上，选择合适波长的不同种类第六色荧光进行测试，确定其稳定性和在基因分析仪上的可实现性，最终成功建立了国内第一个Y-STR六色荧光检测系统并在AGCU Database Y30中加以应用，使其突破技术瓶颈成为现市场上同时检测基因座数目最多的STR试剂盒，满足了市场对于Y-STR荧光检测试剂盒个体识别率的需求。

目前，市面上主流试剂盒有Plus、Y23、Goldeneye Y26、STRtyper27Y、AGCU Database Y24等荧光检测试剂盒(见表1)，基因座数量分别为17个、27个、23个、26个、27个、24个。法医学常用的的基因座数量较少，累积个体识别率较低，已被确认在某些特定的人群中具有非常低的多态性。Plus、STRtyper27Y、Y23、Goldeneye Y26分别含有7个、7个、2个和3个快速突变基因座。

表1市面上主流Y-STR荧光检测试剂盒

技术实现要素：

解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，通过六色荧光检测体系检测，获得一种具有高分辨率、低突变率且能够满足Y-STR建库进行家系快速排查的需求，本发明提供一种人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用。

技术方案：

人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，所述试剂盒包含30对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为：DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a、DYS385b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643、DYS549、DYS557、DYS520。

优选的，所述30对STR基因座的特异性扩增引物的序列如下：DYS392、SEQ ID NO:1～2；DYS389I和DYS389II、SEQ ID NO:3～4；DYS447、SEQ ID NO:5～6；DYS438、SEQ ID NO:7～8；DYS527a和DYS527b、SEQ ID NO:9～10；DYS522、SEQ ID NO:11～12；DYS391、SEQ ID NO:13～14；DYS456、SEQ ID NO:15～16；DYS19、SEQ ID NO:17～18；DYS388、SEQ ID NO:19～20；DYS448、SEQ ID NO:21～22；DYS385a和DYS385b、SEQ ID NO:23～24；DYS481、SEQ ID NO:25～26；DYS437、SEQ ID NO:27～28；DYS390、SEQ ID NO:29～30；DYS460、SEQ ID NO:31～32；DYS533、SEQ ID NO:33～34；DYS458、SEQ ID NO:35～36；DYS393、SEQ ID NO:37～38；Y_GATA_H4、SEQ ID NO:39～40；DYS439、SEQ ID NO:41～42；DYS635、SEQ ID NO:43～44；DYS444、SEQ ID NO:45～46；DYS643、SEQ ID NO:47～48；DYS549、SEQ ID NO:49～50；DYS557、SEQ ID NO:51～52；DYS520、SEQ ID NO:53～54。

针对上述30个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性荧光标记引物，引物设计采用Oligo7软件，每条引物Tm值接近60℃。扩增产物长度在75-500bp之间，对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到峰形尖锐峰高正常的扩增峰。再经过复合扩增测试，不产生非特异扩增、引物二聚体，不发生其它相互作用或交叉反应。

优选的，所述30对STR基因座的特异性扩增引物的浓度如下：DYS392、0.06μM；DYS389I和DYS389II、0.07μM；DYS447、0.12μM；DYS438、0.07μM；DYS527a和DYS527b、0.11μM；DYS522、0.14μM；DYS391、0.07μM；DYS456、0.06μM；DYS19、0.15μM；DYS388、0.15μM；DYS448、0.09μM；DYS385a和DYS385b、0.12μM；DYS481 0.11μM；DYS437、0.07μM；DYS390、0.08μM；DYS460、0.12μM；DYS533、0.15μM；DYS458、0.17μM；DYS393、0.11μM；Y_GATA_H4、0.13μM；DYS439、0.14μM；DYS635、0.17μM；DYS444、0.18μM；DYS643、0.20μM；DYS549、0.17μM；DYS557、0.20μM；DYS520 0.18μM。具体如表2所示：

表2.AGCU Database Y30引物信息

优选的，所述30对STR基因座的特异性扩增引物分为五组：第一组，DYS392、DYS389I、DYS447、DYS389II、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522；第二组，DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a、DYS385b；第三组，DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458；第四组，DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643；第五组，DYS549，DYS557，DYS520；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。

将5组引物分别用蓝色、绿色、黄色、红色和紫色荧光素标记，蓝色标记可选择6-FAM或相近光谱的荧光素分子，绿色标记可选择HEX或相近光谱的荧光素分子，黄色标记可选择TAMRA或相近光谱的荧光素分子，红色标记可选择ROX或相近光谱的荧光素分子，紫色标记可选择VIG或相近光谱的荧光素分子。试剂盒设有内标，内标由一组大小固定且不同的DNA片段组成，内标用SIZ作为橙色荧光标记物。将5组30个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。得到的引物混合物可以用于上述30个基因座复合扩增。

Y染色体STR基因座的扩增采用聚合酶链式反应，其扩增产物的检测采用毛细管电泳、聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳。聚合酶链式反应的扩增程序为：95℃2min；94℃30S、59℃1min、72℃1min，共29个循环；60℃30min。

优选的，所述试剂盒包括反应混合液、30对STR基因座的特异性扩增引物、30个基因座的等位基因、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH₂O和荧光分子量内标；其中反应混合液的组成为：MgCl₂ 7.5mM,Tris-HCl 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7.5mM，BSA 2g/L。具体成分如表3所示：

表3试剂盒成分

所述的人类Y染色体30个STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲权鉴定和DNA家谱构建中的应用。

优选的，所述应用的程序为将试剂盒内试剂与样品DNA装入PCR扩增管，置于热循环仪上，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃2min；94℃30s、59℃1min、72℃1min，共29个循环；60℃终延伸30min；4℃保温得到扩增产物，将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析基因测序仪上检测到的数据。

优选的，所述样品DNA包括利用Chelex法、磁珠提取法或有机抽提法中任意一种方法提取的人基因组DNA；或采用免提取的滤纸、FTA卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。所述检材的来源包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官。

有益效果：(1)本发明建立了六色STR荧光检测系统，能够提高试剂盒中基因座的检测数目，突破五色荧光系统的限制，提高了STR检测技术的可能性，为国内第一个采用六色荧光检测技术的Y-STR试剂盒；(2)本试剂盒采用全部低突变率基因座，更加适合Y-STR建库家系排查；(3)本试剂盒是包含30个Y染色体STR基因座的高度复合扩增系统，为市面基因座数量最多的Y-STR检测产品；(4)本试剂盒具有很强的检材适应性，即一种试剂盒可以扩增多种检材的样本，不同检材的样本包括：利用Chelex法、磁珠提取法或有机法抽提法中任意一种提取的人基因组DNA及滤纸、FTA卡、棉签、纱布等任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞；(5)本试剂盒通过设计特异性引物，具有较强的扩增特异性，男性样本无非特异性峰，女性样本无扩增；以及温度耐受性，温度耐受范围较广，为了保证不同质量的PCR扩增仪均能得到较好的扩增结果。

附图说明

图1为基因座排布示意图；

图2为Database Y30的30个基因座等位基因分型标准物：Allelic Ladder图；

图3为案件中嫌疑人现场检材Y-STR分型图(Database Y30)；

图4为案件中嫌疑人比对的某家系中男子Y-STR分型图(Database Y30)；

图5为案件中嫌疑人现场检材Y-STR分型图(Yfiler Plus)；

图6为案件中嫌疑人比对的某家系中男子Y-STR分型图(Yfiler Plus)；

图7为案件中嫌疑人现场检材Y-STR分型图；

图8为比对到的男性A样本Y-STR分型图；

图9为男性A所在家系的普遍Y-STR分型图；

图10为缺少双亲的亲权鉴定中叔叔的Y-STR分型图；

图11为缺少双亲的亲权鉴定中侄子的Y-STR分型图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 Y染色体STR基因座的筛选

通过对DYS549、DYS522、DYS389I/II、DYS439、DYS447、DYS392、DYS576、DYS19、DYS388、DYS391、DYS635、DYS460、DYS456、DYS533、DYS520、DYS438、DYS527a/b、DYS449、DYS709、DYS622、DYS481、DYS437、DYS390、DYS630、DYS448、Y_GATA_H4、DYS458、DYS607、DYS393、DYS552、DYS570、DYS385a/b、DYS593、DYS444、DYS643、DYS549、DYS557、DYS520、DYS443、DYS622、DYS587、DYS525共45个Y染色体短串联重复序列基因座及其等位基因遗传特征进行了深入的研究，筛选出30个Y染色体短串联重复序列基因座：DYS392、DYS389I/II、DYS447、DYS438、DYS527a/b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/b、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643、DYS549、DYS557、DYS520，这30个Y染色体短串联重复序列基因座在人群中具有较低的遗传多态性和良好的等位基因频率分布，复合本发明对于位点的要求。每个基因座相应信息见表4：

表4.Database Y30基因座信息

实施例2六色荧光系统的建立

法医实验室采用的荧光检测技术，具有多色分析、快速和使用简便的特点。它的主要过程包括：激光轰击连接在DNA末端的荧光基团(染料)，荧光基团吸收激光能量，然后发出较低能量(较大波长)的光，用滤光片收集特定波长范围的发射光，用光电倍增管或电耦合装置用以收集和放大来自于荧光基团的信号，并将其转化为电信号，最终生成毛细管电泳中的峰图。多色荧光检测技术即是指用不同的荧光素标记引物，在各波长分别检测，从而达到检测复合扩增产物的目的。在考虑荧光素的物理性质和基因分析仪的仪器特性，选择合适波长的新荧光素—VIG；与现有五色荧光标记混合，组成新的六色检测体系，同时建立新的荧光基团分辨算法(matrix)。

实施例3 30个Y染色体STR基因座排布

根据以上30个基因座，设计了独特的基因座排布方式及化学荧光染料标记的方法：DYS392、DYS389I/II、DYS447、DYS438、DYS527a/b、DYS522为第一组，荧光染料标记物为6-FAM；DYS391、DYS456、DYS19、DYS388、DYS448、DYS385a/b为第二组，荧光染料标记物为HEX；DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458为第三组，荧光染料标记物为TAMRA；DYS393、Y_GATA_H4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643为第四组，荧光染料标记物为ROX；DYS549、DYS557、DYS520为第五组，荧光染料标记物为VIG，基因座排布如图1。

实施例4 30个Y染色体STR基因座特异性引物设计及不同引物浓度调试

随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同基因座引物之间的相互干扰也越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计大量的引物序列进行复杂的测试及摸索复扩系统中引物之间特异的浓度比例，最终保证了不降低试剂盒特异性及灵敏度的情况下复合更多的STR基因座。

(1)特异性引物设计

设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。

a.引物Tm值：由于算法不一样，不同软件设计的引物Tm值不尽相同，但需要尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。

b.引物间二聚体：尽可能避免两条引物3’末端之间有连续超过3个碱基互补配对。

c.引物与模板序列非特异结合：设计过程中尽量避免引物序列与模板序列非特异区域结合。

d.引物比对：引物序列需要利用NCBI进行blast比对，除了特异性引物结合区外，匹配区域越少越好。

(2)引物验证

首先，进行引物的单扩实验，排除有非特异、扩增效率低的引物；其次，进行单色小复扩实验，即将每一组引物分别单独混合测试，和单扩一样，需要排除产生非特异及扩增效率低的引物；最后，进行大复扩实验，即四组引物全部混合测试，在初步确定了各基因座复合扩增引物后，进行引物的初步组配，利用标准DNA以及其他实际DNA样本为模板，考察每个基因座引物的浓度及检测效率，考察非特异扩增产物，若存在，即通过调整引物序列的方式，对引物序列加以改进，最终引物序列及浓度见表2。

实施例5调整PCR反应混合液

PCR体系中，Mg²⁺浓度分别测试0.5mM、1.0mM、1.5mM 2.0mM、2.5mM、3.0mM 6个梯度，dNTPs浓度分别测试0.1mM、0.15mM、0.2mM、0.25mM、0.30mM、0.35mM 6个梯度，热启动Taq酶含量分别测试1.0U、1.5U、2.0U、2.5U、3.0U共5梯度，Tris-HCl浓度定10mM，KCl浓度定为40mM。通过设计正交实验，最终将Mg²⁺浓度定为2.0mM，dNTPs浓度定为0.25mM，热启动Taq酶含量2.0U，Tris-HCl浓度定10mM，KCl40mM，利用以上材料制备成反应混合液Reaction Mix，加入到PCR体系中。最终PCR体系各组成见表5。

表5：

实施例6调整PCR反应程序

本试剂盒因为需要满足不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测试不同的扩增程序，保证不同检材在较宽的温度范围内均能得到正确的DNA分型。首先，循环数测试：分别测试了28个循环，29个循环，30个循环，31个循环，最佳循环为29。其次，退火温度测试：分别测试了56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，62℃，最佳温度为59度。最终扩增程序为：

95℃2min；

94℃30S,59℃1min,72℃1min 29循环；

60℃30min；

4℃延伸。

本试剂盒检测扩增产物的方法为采用毛细管遗传分析仪或凝胶电泳进行测定。

实施例7本试剂盒在Y染色体家系排查中的应用

(1)收集案件中的血斑：样本由某公安局提供。

(2)样本DNA提取：采用法庭科学DNA实验室检验规范【GA-T383-2002】中硅珠法提取方法。

(3)样本检测结果数据比对：现场嫌疑人样本、比对到某家系的某男子，分别使用Database Y30和Yfiler Plus进行分型，扩增图谱分别见图3、4、5、6，分型结果比对如表6。

表6：

首先使用AGCU Database Y30进行分型和排查，现场嫌疑人样本比对到某家系，此家系中男性A分型与嫌疑人30个基因座分型完全一致。对此家系男性成员加做常染色体分型，进行比对。破案后，证实犯罪嫌疑人确实与此男子为同一个家系。事后，用Yfiler Plus重新进行分型和排查，犯罪嫌疑人和男性A有三个基因座分型不一致，DYS576、DYS627、DYS570。此案例中，如果使用Yfiler Plus进行家系排查，因为嫌疑人与男性A有三个基因座分型不一致，很可能将此家系排除。由此可以看出，在Y-STR家系排除的应用中，试剂盒中Y染色体快速突变的基因座数量过多，将嫌疑人所在的家系误排除的风险较大，Database Y30因为30个基因座全部为低突变率基因座，更加适合男性家系排查。

实施例8本试剂盒在Y染色体家系排查中的应用

(1)收集案件中的血斑：样本由某公安局提供。

(2)样本DNA提取：采用法庭科学DNA实验室检验规范【GA-T383-2002】中硅珠法提取方法。

(3)样本检测结果数据比对：现场嫌疑人样本、比对中的家系中的男性A、比对中的家系扩增图谱分别见图7、8、9，分型结果比对如表7所示。

表7：

先使用AGCU Database Y30建立的Y-STR数据库对嫌疑人进行家系排查，将嫌疑人范围缩小到某家系中上，在比对过程中发现该家系中仅有男性A与现场嫌疑人样本的VIG色一个位点分型一致，DYS557。因此优先对该男性实施抓捕，成功在其潜逃前捕获。事后对该家系男性加做常染色体分型，证实犯罪嫌疑人样本与男性A分型一致，男性A对犯罪事实供认不讳。此案例中如果AGCU Database Y30未采用六色荧光系统，检测位点中将不包含DYS557在内的VIG色三个位点，是公安局需对该家系所有成员加做常染色体分型才能确定犯罪嫌疑人，这样减缓了办案速率、增大了办案成本。因此，试剂盒需要尽可能包含更多位点来提升个体识别率，而六色荧光系统为试剂盒包含更多位点的先决条件。

实施例9本试剂盒在亲权鉴定中的应用

(1)收集口腔脱落细胞：样本由某司法鉴定中提供。

(2)样本DNA提取：采用法庭科学DNA实验室检验规范【GA-T383-2002】中硅珠法提取方法。

(3)样本检测结果数据比对：叔叔和侄子扩增图谱分别见图10和11，分型结果比对如表8所示。

表8：

结果显示：叔、侄30个Y-STR的检测结果完全一致，说明他们属于同一个男性家族。但是Y染色体检测的特殊性，并不能确定他们之间叔侄关系，需要进一步对常染色体，甚至更多家庭成员进行检测。所以，本发明提供的试剂盒在亲子鉴定中一般作为常染色体鉴定结果的补充与佐证。