C22orf41在前列腺癌诊断标志物中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用与前列腺癌相关的C22orf41在前列腺癌诊断标志物中的应用。
背景技术：
：前列腺癌是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95％发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80％的病人首先发现远处转移病灶才发现前列腺癌。此时，病变已达晚期，预后不良。前列腺癌的临床诊断方式目前主要有血清前列腺特异性抗原(PSA)检测、直肠指检、直肠超声波检测、活组织病理检查等。PSA(ProstateSpecificAntigen)为前列腺组织特异性抗原，由前列腺的解剖结构可知PSA通过前列腺导管进入血液和尿液中，一些病例或生理情况下PSA会进入血液中去，如前列腺炎症、尿潴留、前列腺感染、前列腺增生和前列腺癌等，因此通过检测血清PSA水平来预测前列腺癌具有一定的假阳性率。从1991年开始，检测血清中PSA含量用于预测前列腺癌，含量高于4ng/mL认为是前列腺癌阳性，灵敏度79％，特异性20％-59％，平均灵敏度约33％，在浓度4-10ng/mL灰区部分，特异性是最低的，这时往往需要通过侵入性的穿刺活检进行确定，给患者带来极大痛苦及精神和经济负担。所以PSA并不能较好的作为诊断前列腺癌的标志物。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要通过医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。但以上的方法都存在局限性。例如直肠指检的局限性主要在4个方面：(1)患者前列腺肿块不大时，易漏诊；(2)部分患者前列腺癌肿大不明显，但已属于晚期，不易根治；(3)患者直肠有疾患时不能使用此检测；(4)医生经验不足时有漏诊或者误诊的可能。C22orf41(SynaptonemalComplexCentralElementProtein3，联会复合体中心元蛋白3)又名SYCE3是一种蛋白编码基因，位于22号染色体上。与SYCE3基因的相关报道较少，仅有研究表明，SYCE3在犏牛睾丸组织中极显著表达下调与同源染色体间、尤其是性染色体间的联会复合体数量减少有关。近年来的研究表明，mRNA与前列腺癌密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。技术实现要素：为了实现前列腺癌的早期诊断，个体化治疗，本发明的目的在于提供一种新的前列腺癌mRNA，以及该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一目的是前列腺癌相关mRNA在检测前列腺癌中的用途。为实现上述目的，本发明首先提供一种用于前列腺癌检测的mRNA标志物，所述标志物为C22orf41或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物；所述的C22orf41或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在前列腺癌生物学样品中表达下调。优选地，所述标志物包括如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列为C22orf41mRNA的一部分序列。进一步地，本发明提供了一种检测个体患有前列腺癌可能性的试剂盒，所述的试剂盒含有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。优选地，所述试剂盒包括SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的定量检测试剂；所述核苷酸序列定量检测试剂包括SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的引物。优选地，所述试剂盒包括10×Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂。优选地，所述试剂盒还包括人正常的前列腺组织或细胞的总RNA或DNA。进一步地，本发明提供了一种检测前列腺癌相关mRNA表达水平是否下调的方法。(1)检测待测样品中前列腺癌相关mRNA的表达水平，其中所述前列腺癌相关mRNA是C22orf41；(2)将待测细胞中前列腺癌相关mRNA的表达水平与对照相比较，从而确定前列腺癌表达水平是否下调。优选地，所述待测样品为细胞组织样本。优选地，所述的细胞组织样品包括前列腺癌组织和癌旁组织。优选地，所述的癌旁组织为正常组织。优选地，所述检测是通过基因芯片检测法、荧光定量PCR、蛋白质芯片检测法、免疫方法或抗原-抗体检测法进行。优选地，所述免疫方法为ELISA检测和/或胶体金检测。优选地，所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：包被C22orf41单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。所述胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市售的C22orf41单克隆抗体或多克隆抗体。更优选地，所述的胶体金检测试剂盒是采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。更优选地，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗C22orf41抗体、质控区(C)喷点有免疫球蛋白IgG。本发明的有益效果如下：本发明公开了一种与前列腺癌相关的C22orf41，并进一步证实该C22orf41或该mRNA的表达蛋白及其片段、类似物和衍生物在前列腺癌组织中表达下调。利用该mRNA检测前列腺癌不仅能够快速有效的做到早期诊断，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。附图说明图1前列腺癌组织及癌旁组织C22orf41cDNA表达情况；图2测序结果与C22orf41整个mRNA序列的比对结果；图3前列腺癌组织及癌旁组织C22orf41蛋白的表达情况。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。本发明的发明人对前列腺癌组织样本及癌旁组织样本的mRNA进行高通量转录组测序，通过生物信息学方法进行基因筛选，挑选出候选mRNAC22orf41，现有研究中并没有C22orf41和前列腺癌相关的报道，进一步，发明人进行了分子生物学方法验证，证实了C22orf41在前列腺癌细胞中表达下调。本发明的C22orf41是在本发明之前的已知mRNA，其基本信息如下：Genbank登录号：NCBI参考序列:NM_001123225.2，来源于人类基因组。本发明还采用RT-PCR方法和基因芯片方法检测上述mRNA在前列腺癌组织和癌旁正常组织的表达，并验证了该mRNA在前列腺癌中表达下调。本文使用的术语“表达下调”指对应于所表达基因的序列，其中序列量的测量证明，与从正常个体或从通过前列腺癌分期确定与前列腺癌不同的已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的同一基因相比，所述基因在从患前列腺癌或通过前列腺癌分期确定的前列腺癌已鉴定疾病状态的个体中分离的生物学样品中的表达水平降低。根据本发明，“表达下调”是指通过本发明方法杂交强度测量的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的表达降低，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更低。实施例1高通量测序筛选差异表达基因1、取样取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院泌尿外科手术中获得组织标本27例，所有标本均经病理学检查证实，其中癌旁组织样本8例、前列腺癌标本19例，编号后置-80℃低温冰箱保存。2、对组织样本进行总RNA提取采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：①加入Trizol，室温保存5分钟；②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。3、RNA样品的质量分析RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。4、高通量测序测序平台为Illumina公司的HiSeq2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了GeneOntology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达C22orf41，该mRNA在前列腺癌组织样本中表达下调。实施例2RT-PCR验证前列腺癌组织及癌旁组织C22orf41表达情况1、材料20例前列腺癌组织样本及8例癌旁组织样取自北京协和医院2012至2015年期间泌尿外科手术中前列腺癌样本，对其进行分组及编号。所有样本均经过病理学检查证实。2、方法2.1对组织样本进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。2.2逆转录合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μL反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA。将获得的cDNA样品稀释10倍后保存在-20℃冰箱备用。2.3Real-TimePCR2.3.1仪器及分析方法用ABI7500型荧光定量PCR仪，采用2-ΔΔCt法进行数据相对定量分析。2.3.2引物设计采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001123225.2(C22orf41)，内参选GAPDH，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：表1引物序列2.3.3荧光定量PCR扩增25μL反应体系中按表2依次加入以下成分：表2RealTime反应体系组分加入量2×mix10μL上游引物(10uM)0.5μL下游引物(10uM)0.5μL模板2μL加入灭菌蒸馏水至25μL用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，货号4367659)分别对目的基因引物和内参基因引物进行扩增。实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，61℃45sec)×35个循环。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。反应结束后，取5ul的PCR产物进行2％琼脂糖电泳，用快速胶回收试剂盒(invitrogen公司)将大小为163bp的片段进行切胶回收并测序，结果用blast软件进行同源性分析。实验结果显示，实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较C22orf41在前列腺癌组织和癌旁组织中的表达水平。结果如图1显示：与癌旁组织相比，C22orf41在前列腺癌患组织中的表达水平仅为癌旁组织中的25％，证明该mRNA表达下调；RT-PCR产物经回收后，在ABI3730全自动测序仪上测序，该163bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。用blast软件将该序列与C22orf41整个mRNA序列进行比对，比对结果如图2显示，如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列为C22orf41基因的一部分序列，符合率为99％,其中发现c.56A>C和c.97U>G均为无义突变。实施例3WB方法检测前列腺癌组织中C22orf41的蛋白表达水平一、材料20例前列腺癌组织样本及配对癌旁前列腺冰冻组织样取自北京协和医院2012至2015年期间泌尿外科手术中前列腺癌样本，对其进行分组及编号。所有样本均经过病理学检查证实。二、方法(一)蛋白质样品制备及定量1、RIPA裂解液(Beyotime)进行蛋白质样品制备，操作步骤如下:将组织样本自冰箱取出，用滤纸擦拭组织上的PBS溶液，称取重量，并将组织置于机械组织匀浆器中，1:10组织比裂解液的重量体积比例加入相应体积的裂解液进行匀浆，10000-14000g离心3-5分钟，取上清液，按1:1加入样品缓冲液强力混匀后置于100度的水浴箱水浴加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中。2、利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量采用康为世纪微量BCA蛋白定量试剂盒(货号：CW2011)，具体步骤见其说明书。二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)1、蛋白质样品变性:a)根据BCA蛋白质浓度测定结果，每个凝胶加样孔中加入相同质量的总蛋白提取物。按照每1微升蛋白样品加入0.25微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5x)。b)100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。c)冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。2、胶板制备:采用Bio-Rad公司的微型垂直板电泳装置制备0.75mm厚的凝胶，照说明书安装好玻璃板后，先在小烧杯中配制5mL10％的分离胶，配方如下：表3分离胶配方组分用量30％丙烯酰胺溶液1.7mLTris-HCl(1.5M，pH8.8)1.3mL10％SDS0.05mL10％AP0.05mLTEMED0.002mL灭菌ddH2O补充至5mL混匀后立即灌胶，然后加lmL蒸馏水覆盖，室温下放置约30min待胶聚合后，用蒸馏水洗2-3次，再用滤纸吸干。然后制备2mL5％的浓缩胶，配方如下：表4浓缩胶配方组分用量30％丙烯酰胺溶液0.33mLTris-HCl(1.0M，pH6.8)0.25mL10％SDS0.02mL10％AP0.02mLTEMED0.002mL灭菌ddH2O补充至2mL混匀后立即灌胶，插入样品梳，避免产生气泡，待胶凝固后，取出样品梳，后用蒸馏水和1x蛋白电泳缓冲液先后冲洗样品孔。三、上样及电泳将凝胶板装在电泳装置上，内槽中加满lx蛋白电泳缓冲液，外槽中lx蛋白电泳缓冲液应超过铂丝，按顺序上样。在末端泳道中加入蛋白质质量标准蛋白梯度。电泳时蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。四、蛋白质印迹1、按照上述方法先进行SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。2、预先用转印缓冲液浸泡NC膜、滤纸、海棉垫。SDS-PAGE结束后取出凝胶，去除浓缩胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒，然后置于转印缓冲液中浸泡15-30min。打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印缓冲液浸泡透的海棉垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海棉垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。在电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内(电转印液之前要放入冰箱内预冷)，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。3、封闭：用1xTBS漂洗一次。加入含5％的无脂奶粉TBS封闭缓冲液，置于振荡培养箱中进行封闭；4、一抗杂交：弃封闭液，加入用一抗稀释液稀释的一抗(Anti-C22orf41antibody-N-terminal(sc-86595))杂交溶液，置于4℃杂交过夜，第二天在振荡培养箱中进行杂交；5、回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次；6、弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗(GoatAnti-RabbitIgG,HRPConjugated(CW0103))杂交溶液，置于振荡培养箱中进行杂交；7、弃二抗溶液，用TBST洗膜3次；8、ECL化学发光及图像采集和分析：按照高灵敏度化学发光检测试剂盒(康为世纪货号CW0049B)，具体步骤参照说明书。9、以β-Actin作为内参进行数据标准化，以癌旁组织中C22orf41作为参照样本，观察实验组中C22orf41蛋白的相对表达水平情况，采用ImageJ分析软件对蛋白电泳条带灰度值进行定量,最后得到的数据进行配对样本t检验统计分析。五、实验结果结果如图3显示，在癌旁前列腺组织与前列腺癌组织中C22orf41蛋白的表达趋势与荧光定量PCR检测mRNA水平的表达趋势相符。即C22orf41蛋白表达量在前列腺癌组织中明显低于癌旁组织(p<0.001)，表达差异有统计学意义。实施例4前列腺癌检测试剂盒基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述的用于前列腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物对如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示，和特异扩增内参基因(GAPDH)的引物对如SEQIDNO:4和SEQIDNO:5所示；还包括SYBRGreen聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBRGreen荧光染料、dNTPs。所述PCR缓冲液的成分为25mMKCL，2.5mMMgCL2，200mM(NH4)2SO4。通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表3所示：表3PCR反应体系最佳反应条件为：95℃预变性5min，(95℃变性15sec，61℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40个循环，72℃延伸15min。取30例待检测前列腺癌病人的少量前列腺细胞，待检前列腺癌病人为北京协和医院泌尿科就诊前列腺癌患者。本研究的所有临床样本，均对患者进行知情告知并经本医院伦理委员会通过。使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从前列腺细胞中提取RNA，使用试剂盒中试剂，按照最佳反应体系与条件进行PCR反应，使用试剂盒中正常癌旁组织cDNA作为Real-TimePCR定量检测中的对照cDNA，检测组织样本的C22orf41相对正常癌旁组织表达量变化，分析检测结果，样本和对照间比较采用t检验，P<0.05为差异显著，判为检测样本阳性。检测结果显示，在30例待检测病人中，有24例病人的C22orf41在前列腺细胞表达水平仅为癌旁组织中的20-40％。经临床进一步检测，该24例病人确定患有前列腺癌，其他6例没有患有前列腺癌，临床检测结果与本发明制备的试剂盒检测结果一致。据此推断，本前列腺癌的诊断试剂盒可以明确区分出前列腺癌患者，并以此为临床提供诊断线索。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 2 3