本发明涉及一种制备高含量霍山石斛多糖的方法。
背景技术：
石斛为兰科石斛属植物，是我国传统医药学中一种名贵药材，其有效成分主要为多糖和生物碱，其中，石斛的品质优劣在很大程度上取决于石斛中多糖的含量多少。而石斛中以霍山石斛最为著名，霍山石斛多糖的药理作用主要表现在免疫、强壮、抗衰老、抗肿瘤等作用。随着社会发展，人们对健康的关注越来越高，其需求量也会越来越大，但传统霍山石斛多糖的提取方法是用霍山石斛属植物的根、茎、叶等植物体提取所得，这种工艺所得的产品已经不能满足未来市场对霍山石斛精深加工的需求。虽然，随着科学技术的不断发展，出现了不少霍山石斛的加工方法，但效果甚微，因此研究重点又回归到从霍山石斛粗粉中尽可能多的将多糖成分提取出来这一观点上。因此开发一种高效、高产率的霍山石斛多糖类提取方法是十分有意义的。
随着植物细胞工程技术的发展，利用植物细胞增殖技术进行快速繁殖，并使用植物生长调节剂进行调节植株生长速度研究的越来越多。利用细胞工程技术生产霍山石斛多糖的技术，在国内外早有研究，也取得了诸多成果，但在生产过程中存在很多难题问题，如工艺复杂、生物量增速低、目标产物收率低、生产周期长等。寻求一种能够快速繁殖并短时间能使得霍山石斛能够生长至多糖含量最高水平的方法，具有重要意义及应用前景。因此开发一种制备高含量霍山石斛多糖类天然产物的方法是十分有意义的。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种制备高含量霍山石斛多糖的方法，所述方法能够大幅度缩短霍山石斛的细胞培养及植株成长周期，能在短时间内生长到多糖含量最高阶段，能大大提高霍山石斛多糖的产率，且工艺比较简单、稳定，环境友好，适合工业化生产。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
本发明涉及一种制备高含量霍山石斛多糖的方法，包括如下步骤：
（1）选择霍山石斛原球茎做外植体，经前处理，于无菌接种室中接种培养，再诱导增殖培养；
（2）继代生根培养，形成单株；
（3）形成单株后，在植株生长的不同阶段添加不同的生长调节剂，使得植株快速生长，达到预期效果。
优选地，所述步骤（1）中，所述前处理方法为：清洗霍山石斛原球茎并用酒精擦洗，剥去下部叶片及叶鞘，在0.1~0.15%升汞中浸泡5~10min，再在5~10%的次氯酸钠溶液中浸泡10~15min，再用蒸馏水清洗至无异味。
优选地，所述步骤（1）中，原球茎前处理后，将处理好的霍山石斛原球茎，除去外表皮，保留茎尖，并将其接种到培养基中，无菌培养10~20天。
优选地，所述步骤（1）中，诱导培养即将接种培养的茎尖进行诱导培养15~20天。
优选地，所述步骤（2）中，所述继代生根培养为将诱导生成的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至2~4cm，有4~6片叶及4~6条跟时，进行移栽。
优选地，所述步骤（3）中，使用的生长调节剂包括生长调节剂A，生长调节剂B，生长调节剂C；所述生长调节剂A包括吲哚丁酸、多效唑和复硝酚钠，移栽后5~7天使用；所述生长调节剂B多效唑、三碘苯甲酸和赤霉素，生长调节剂A使用后15~20天使用；所述生长调节剂C包括酶制剂、增甘膦及皮克斯，在生长调节剂B使用15~20天后使用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明所述制备方法能够大幅度缩短霍山石斛的细胞培养及植株成长周期，能在短时间内生长到多糖含量最高阶段，能大大提高霍山石斛多糖的产率，且工艺比较简单、稳定，环境友好，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：
本实施例涉及一种制备高含量霍山石斛多糖的方法，具体步骤如下：
（1）选择生长健壮、活力旺盛的霍山石斛原球茎做外植体，先用水清洗，再用酒精擦洗，剥去下部叶片及叶鞘，在0.12%升汞中浸泡8min，再在8%的次氯酸钠溶液中浸泡10min，再用蒸馏水清洗至无异味。将处理好的霍山石斛原球茎，出去外表皮，保留茎尖，并将其接种到培养基中，无菌培养15天。将接种培养的茎尖进行诱导培养15天。
（2）继代生根培养，将诱导生成的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至2~4cm，有4~6片叶及4~6条根时，进行移栽。
（3）移栽后5~7天使用生长调节剂A包括吲哚丁酸12份、多效唑15份和复硝酚钠3份；生长调节剂A使用后15~20天使用生长调节剂B包括多效唑10份、三碘苯甲酸12份和赤霉素10份；在生长调节剂B使用15~20天后使用生长调节剂C包括酶制剂10份、增甘膦10份及皮克斯12份。
（4）培养所得的霍山石斛植株，按照常规方法制成霍山石斛粗粉，并取50g粗粉进行霍山石斛多糖提取，最后获得目标产物霍山石斛多糖9.66g，收率19.33%。
实施例2：
本实施例涉及一种制备高含量霍山石斛多糖的方法，具体步骤如下：
（1）选择生长健壮、活力旺盛的霍山石斛原球茎做外植体，先用水清洗，再用酒精擦洗，剥去下部叶片及叶鞘，在0.1%升汞中浸泡10min，再在5%的次氯酸钠溶液中浸泡15min，再用蒸馏水清洗至无异味。将处理好的霍山石斛原球茎，出去外表皮，保留茎尖，并将其接种到培养基中，无菌培养20天。将接种培养的茎尖进行诱导培养20天。
（2）继代生根培养，将诱导生成的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至2~4cm，有4~6片叶及4~6条根时，进行移栽。
（3）移栽后5~7天使用生长调节剂A包括吲哚丁酸10份、多效唑15份和复硝酚钠3份；生长调节剂A使用后15~20天使用生长调节剂B包括多效唑10份、三碘苯甲酸10份和赤霉素8份；在生长调节剂B使用15~20天后使用生长调节剂C包括酶制剂10份、增甘膦5份及皮克斯8份。
（4）培养所得的霍山石斛植株，按照常规方法制成霍山石斛粗粉，并取50g粗粉进行霍山石斛多糖提取，最后获得目标产物霍山石斛多糖9.61g，收率19.22%。
实施例3：
本实施例涉及一种制备高含量霍山石斛多糖的方法，具体步骤如下：
（1）选择生长健壮、活力旺盛的霍山石斛原球茎做外植体，先用水清洗，再用酒精擦洗，剥去下部叶片及叶鞘，在0.15%升汞中浸泡5min，再在10%的次氯酸钠溶液中浸泡10min，再用蒸馏水清洗至无异味。将处理好的霍山石斛原球茎，出去外表皮，保留茎尖，并将其接种到培养基中，无菌培养10天。将接种培养的茎尖进行诱导培养15天。
（2）继代生根培养，将诱导生成的不定芽接入生根培养基中培养，待苗生长至2~4cm，有4~6片叶及4~6条根时，进行移栽。
（3）移栽后5~7天使用生长调节剂A包括吲哚丁酸15份、多效唑20份和复硝酚钠5份；生长调节剂A使用后15~20天使用生长调节剂B包括多效唑15份、三碘苯甲酸15份和赤霉素15份；在生长调节剂B使用15~20天后使用生长调节剂C包括酶制剂15份、增甘膦15份及皮克斯15份。
（4）培养所得的霍山石斛植株，按照常规方法制成霍山石斛粗粉，并取50g粗粉进行霍山石斛多糖提取，最后获得目标产物霍山石斛多糖9.53g，收率19.06%。
对比例1
选取播种生长8个月的霍山石斛组培苗，将组培苗洗净沥干后杀青，再70℃干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用。取50g粗粉进行霍山石斛多糖提取，称量得到的霍山石斛多糖的重量为8.28g，收率为16.57%。
通过上述对比，可以很清楚的判定本发明所述的方法所培育出的霍山石斛中多糖含量明显高于常规生长环境下获得的霍山石斛植株中多糖的含量，本发明具有较好的应用前景。
本发明的制备高含量霍山石斛多糖的方法利用快速繁殖技术进行繁殖，再通过不同的植物生长调节剂的调节作用下，使得霍山石斛快速生长，在短时间内达到多糖含量最高值的一种方法，所述方法能够大幅度缩短霍山石斛的细胞培养及植株成长周期，能在短时间内生长到多糖含量最高阶段，能大大提高霍山石斛多糖的产率，且工艺比较简单、稳定，环境友好，适合工业化生产。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。