一种同步检测五种动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种同步检测五种动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法。

背景技术：

从核酸分子水平上对动物进行物种鉴定、物种起源和多样性评估以及对动物源性食品进行检验研究，是目前动物源性成分研究的最有效手段。分子生物学方法主要是利用DNA分析技术，根据基因组中的DNA序列来确定物种，并且对于经过热加工的食品仍能很好地区分动物来源。DNA的遗传信息量比蛋白质多，且DNA相对比较稳定，经高压灭菌处理的样品，仍能检测到大约300-400bp的DNA片段。与此同时，DNA作为分子生物学研究的基础，核酸的分离与纯化技术也进一步得到发展。近年来有不少关于动物全基因组DNA提取的研究和报道，由于不同的材料和提取方法的差异，提取的基因组DNA纯度和量也有所不同，如何选取合适的组织材料，利用恰当的方法来提取高质量的基因组DNA，是一个值得探讨的问题。DNA以其经热加工后良好的稳定性作为鉴定动物源性成分的重要依据，高质量、高纯度及结构完整的基因组DNA的获得是开展该方面研究工作的前提，是保证各质检机构检测工作得以顺利进行的必要条件。而以此为基础的PCR技术广泛被用来鉴定食品中的动物源性成分，在微生物和动物饲料检测中已得到成功应用，国内外已经运用该技术建立了鉴别多种动物源性成分的方法，显示出良好的应用前景，弥补了电泳技术、免疫学技术、光谱技术等常规检测方法灵敏度低、检测周期长、对深加工处理后的肉类产品鉴别可靠性低等诸多不足。目前，以检测DNA为基础的方法主要有：常规PCR-凝胶电泳法、多重PCR-凝胶电泳法、随机扩增多态性DNA分析(PCR-RAPD)、长度多态性分析(PCR-RFLP)、DNA条形码(DNA barcoding)、实时荧光PCR等。

针对动物源性食品中存在的问题，我国近些年也加强了肉类安全性的认识，制定了《传染病防治法》、《动物防疫法》、《食品卫生法》、《进出口商品检验法》等相关的法律法规。目前已颁布的国家标准、行业标准和地方标准的动物成分检测方法主要采用的是常规定性PCR法和实时荧光PCR法对单一动物源性的定性检测。其中，基于常规PCR-凝胶电泳法的动物成分定性分析标准有7项国家标准，4项行业标准和2项地方标准。基于实时荧光PCR法的动物成分定性分析标准有3项国家标准，7项行业标准和4项地方标准。

但是，目前已颁布的常规PCR-凝胶电泳法和实时荧光PCR法的标准方法，只能对动物源性肉及肉制品进行单一种的定性检测，而对于成分不明确或混合的加工制品，需要通过多次检测或多重检测试验才能确定，其周期长、工作量大、成本高。在未来的动物源性肉及肉制品的检测中，这类检测技术已经越来越不能胜任一次处理几种甚至十几种动物源制品的特殊需要，尤其是大数量的加工产品进入商品化生产时，需要更有效的、快速的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种同步检测五种动物源性成分的多重PCR引物体系及检测方法，利用该方法检测牛、猪、羊、鸡、鸭肉制品的真伪及鉴定是否有掺假时，灵敏度高，快速且特异性高，大大提高检测效率，节约时间，而且节省检测成本，特别适用于牛、猪、羊、鸡、鸭制品的快速防伪鉴定。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种同步检测五种动物源性成分的多重PCR引物体系，包括如下五对引物对：

(1)针对牛物种特异性基因设计引物对I：

正向引物：5’-GATTGGACTAGCATTAGCTGCAACC-3’；

反向引物：5’-CTTGAAGGCGTTTGAGGGGTAGTGAT-3’。

(2)针对猪物种特异性基因设计引物对II：

正向引物：5’-GCCTAAATCTCCCTCAATGGTA-3’；

反向引物：5’-ATGAAAGAGGCAATAGATTTTCG-3’；

(3)针对羊物种特异性基因设计引物对III：

正向引物：5’-CAATGAAAATAACCGTTCCTAAT-3’；

反向引物：5’-GTAAGGTTGTACTATGAGGATCGTG-3’；

(4)针对鸡物种特异性基因设计引物对IV：

正向引物：5’-AGCAATTCCTACATTGGACACA-3’；

反向引物：5’-GATGATAGTATACCTGCGATTGCA-3’；

(5)针对鸭物种特异性基因设计引物对V：

正向引物：5’-CACAATCTAGCCTGGACAC-3’；

反向引物：5’-TCGTCTTTAGTCTGGAGTT-3’；

本发明所述的一种同步检测五种动物源性成分的多重PCR检测方法，其包括如下步骤：

1)以待检样品总DNA为模板，利用所述的5重PCR引物体系进行多重PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；其中，所述样品总DNA模板为牛、猪、羊、鸡、鸭物种肉产品中的一种或一种以上；

2)结果判定：待检样品扩增出733bp条带的，判定为牛源性成分阳性；待检样品扩增出212bp条带的，判定为猪源性成分阳性；待检样品扩增出468bp条带的，判定为羊源性成分阳性；待检样品扩增出133bp条带的，判定为鸡源性成分阳性；待检样品扩增出292bp条带的，判定为鸭源性成分阳性。

进一步，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：

所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行90-100℃下预变性5-20min，90-100℃变性20-60s，50-60℃退火30-60s，70-74℃延伸60-150s，进行30-60次循环，70-74℃下延伸5-20min，最后在4-20℃下保持＞1min后结束。

优选的，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：

优选的，所述多重PCR扩增实验的特定PCR反应程序为：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束。

更优选的，所述多重PCR扩增实验的PCR反应体系包括：

针对动物源性成分的核酸扩增的所有检测方法中，其检测结果的特异性和灵敏性主要受到靶核酸序列来源的影响，因此，选择目标基因的靶序列是关键点。本发明的多重PCR体系在同一PCR体系与同一反应程序中可对五种动物源性成分进行高效扩增，这5种动物特异性引物的选择成为其关键。

本发明通过分析牛、猪、羊、鸡和鸭5种动物线粒体DNA中的遗传不保守区域基因，进行序列测定及比对后，根据各序列上的特异碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对即引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V，所设计的特异性引物对仅对相应的物种总DNA模板有扩增信号，对其它物种没有目的扩增信号，同时，五种扩增产物的片段大小不一，且能够通过电泳分开，非常适合牛、猪、羊、鸡、鸭的多重PCR检测。

在多重PCR反应体系中，退火温度过高会导致引物与模板不能稳定的结合，影响扩增效果。退火温度过低则导致引物与模板发生非特异性结合。本发明针对这5种动物设计的特异性引物对的熔解温度相近，将退火温度的梯度设置在引物理论熔解温度值上下5℃的范围内，且扩增产物长度之间相差在80bp以上，特异性高。

本发明设置了合适的引物浓度，各引物浓度在0.1-0.4体积份，在多重PCR反应体系中，当引物浓度较小时扩增产物的量随着引物浓度的增加而增加，当引物浓度到达一个饱和值时，扩增产物的量不再随着引物浓度的增加而增加，而是基本保持不变。当引物过多时，会导致引物与模板发生非特异性结合，以及引物之间形成二聚体，影响扩增效果。引物浓度的饱和值和模板的量有关(模板的量越大，引物的饱和值越高)，也和引物与模板的结合能力、引物之间形成二聚体的能力有关，引物与模板的结合能力越强、形成二聚体越少，饱和值就越低，反之越高。

本发明所述多重PCR检测方法用于单物种总DNA模板进行牛、猪、羊、鸡、鸭的物种检测，且所述多重PCR检测方法用于多物种混合总DNA模板进行牛和/或猪和/或羊和/或鸡和/或鸭的物种检测。所述多重PCR检测方法尤其适用于检测牛、猪、羊、鸡、鸭产品的真伪及掺假鉴定。

本发明还提供一种含有本发明所述多重PCR引物体系的牛猪羊鸡鸭动物源性成分检测的多重PCR检测试剂盒。

本发明所述多重PCR检测试剂盒可以将本发明所述PCR引物体系以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中，所述相关试剂可以为本发明中所述PCR反应体系中除了总DNA模板以外的其他试剂；也可以为其他适用的除样品总DNA模板外的试剂，如用于PCR反应的一些常规试剂，或由本领域技术人员经有限次实验得到的常规试剂的组合物等。此外本发明所述多重PCR检测试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。

本发明所述多重PCR试剂盒用于单物种总DNA模板进行牛、猪、羊、鸡、鸭的物种检测，且所述多重PCR试剂盒用于多物种混合总DNA模板进行牛和/或猪和/或羊和/或鸡和/或鸭的物种检测。所述试剂盒尤其适用于检测牛、猪、羊、鸡、鸭产品的真伪及掺假鉴定。

本发明的有益效果是：

1.本发明的多重PCR引物体系中的引物对均仅对各自物种的目标片段进行特异性扩增，不会扩增到其它区域且不会与其他物种起反应，因此，使用本发明的多重PCR引物体系可以一次性检测牛、猪、羊、鸡、鸭5个动物物种，从而有效的缩短检测时间。

2.利用本发明所述多重PCR检测方法，经一次PCR即可鉴别5种动物源性成分，不需要对每种动物源性成分分别进行确证检测，大大缩短了实验时间，加快了检出速度。本发明优化的特定PCR反应体系及反应程序，采用统一的PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的检测方式，尤其适用于牛、猪、羊、鸡、鸭制品的快速防伪鉴定。

3.本发明的多重PCR引物体系及PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较普通PCR更为快速、简便，可实现同时对5种动物源性成分的快速、准确、特异的检测和分析，从而有效的鉴定牛猪羊鸡鸭肉制品的真伪及掺假情况，为牛、猪、羊、鸡、鸭肉制品的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段。

4.本发明所述多重PCR引物体系配合相关试剂制成多重PCR试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，其应用前景极好。

附图说明

图1是本发明实施例1中多重PCR扩增体系中鸭物种引物的不同添加量所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1-3：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸡1.0μl，鸭1.0μl；4-6：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸡1.0μl，鸭0.8μl；7-9：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸡1.0μl，鸭0.6μl；10-12：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸡1.0μl，鸭0.4μl；13-15：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸡1.0μl，鸭0.2μl，M代表标准核酸分子量标签(1000为DNA标准分子量，自上向下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

图2是本发明实施例2中多重PCR扩增体系中鸡物种引物的不同添加量所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1-3：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡1.0μl；4-6：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.8μl；7-9：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl；10-12：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.4μl；13-15：牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.2μl，M代表标准核酸分子量标签(1000为DNA标准分子量，自上向下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

图3是本发明实施例3中多重PCR扩增体系中猪物种引物的不同添加量所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1-3：牛1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪1.0μl；4-6：牛1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.8μl；7-9：牛1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl；10-12：牛1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.4μl；13-15：牛1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.2μl，M代表标准核酸分子量标签(1000为DNA标准分子量，自上向下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

图4是本发明实施例4中多重PCR扩增体系中牛物种引物的不同添加量所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1-3：羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛1.0μl；4-6：羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛0.8μl；7-9：羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛0.6μl；10-12：羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛0.4μl；13-15：羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛0.2μl，M代表标准核酸分子量标签(1000为DNA标准分子量，自上向下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

图5是本发明实施例5中多重PCR扩增体系中羊物种引物不同添加量所得琼脂糖凝胶电泳图；其中，1-3：羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛1.0μl；4-6：羊1.2μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛1.0μl；7-9：羊1.4μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛1.0μl；10-12：羊1.6μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛1.0μl；13-15：羊1.8μl，鸭0.6μl，鸡0.6μl，猪0.6μl，牛1.0μl，M代表标准核酸分子量标签(1000为DNA标准分子量，自上向下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图进一步详细描述本发明的技术方案。

实施例1

在鸭物种的不同引物添加量下，以牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品等量混合后，稀释到最终DNA浓度为0.5ng/μl，作为样品模板，用牛、猪、羊、鸡、鸭的特异性引物的多重PCR体系和反应条件，分别扩增牛猪羊鸡鸭的基因组，每个反应重复3次。具体步骤如下：

1)等量混合总DNA样品的处理：将牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品按照等量混合后，稀释到最终DNA浓度为0.5ng/μl，作为样品模板，并将引物稀释至10μmol/L；

2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系50μl/管。双蒸水28-29.6μl，l0×PCR反应缓冲液5μl，2.5mM的dNTPs 4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，总DNA模板1μl，10μM引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V的正向引物和反向引物，牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸡1.0μl，鸭1.0μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl，其中Taq酶为常规Taq酶(参见Tiangen公司的Taq酶说明书)。

3)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。

4)2wt％琼脂糖凝胶电泳：将3)中所得PCR反应产物进行2wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。所得凝胶成像结果如图1所示。

由图1可知，在一定的多重PCR体系和扩增条件中，变化不同鸭物种的引物添加量，当鸭的用量为0.4-0.8μl时(0.08-0.16体积份)，均能从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，验证了不同鸭物种的不同引物添加量的PCR体系和扩增条件中各物种特异性引物的有效性和特异性。

实施例2

在鸡物种的不同引物添加量下，以牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品等量混合后，稀释到最终DNA浓度为50ng/μl，作为样品模板，用牛、猪、羊、鸡、鸭的特异性引物的多重PCR体系和反应条件，分别扩增牛猪羊鸡鸭的基因组，每个反应重复3次。具体步骤如下：

(1)等量混合总DNA样品的处理：将牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品按照等量混合后，稀释到最终DNA浓度为50ng/μl，作为样品模板，并将引物稀释至10μmol/L；

(2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系50μl/管。双蒸水28.8-30.4μl，l0×PCR反应缓冲液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，总DNA模板1μl，10μM引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V的正向引物和反向引物，牛1.0μl，猪1.0μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，鸡1.0μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl，其中Taq酶为常规Taq酶(参见Tiangen公司的Taq酶说明书)。

(3)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸90s，进行45次循环，72℃下延伸l0min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。

(4)2wt％琼脂糖凝胶电泳：将3)中所得PCR反应产物进行2wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。所得凝胶成像结果如图2所示。

由图2可知，在一定的多重PCR体系和扩增条件中，变化不同鸡物种的引物添加量，当鸡的用量为0.2-1.0μl时(0.04-0.20体积份)均能从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，验证了不同鸡物种的不同引物添加量的PCR体系和扩增条件中各物种特异性引物的有效性和特异性。

实施例3

在猪物种的不同引物添加量下，以牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品等量混合后，稀释到最终DNA浓度为100ng/μl，作为样品模板，用牛、猪、羊、鸡、鸭的特异性引物的多重PCR体系和反应条件，分别扩增牛猪羊鸡鸭的基因组，每个反应重复3次。具体步骤如下：

(1)等量混合总DNA样品的处理：将牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品按照等量混合后，稀释到最终DNA浓度为100ng/μl，作为样品模板，并将引物稀释至10μmol/L；

(2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系50μl/管。双蒸水29.6-31.2μl，l0×PCR反应缓冲液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，总DNA模板1μl，10μM引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V的正向引物和反向引物牛1.0μl，鸡0.6μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，猪1.0μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl，其中Taq酶为常规Taq酶(参见Tiangen公司的Taq酶说明书)。

(3)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性50s，64℃退火50s，72℃延伸90s，进行45次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。

(4)2wt％琼脂糖凝胶电泳：将3)中所得PCR反应产物进行2wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。所得凝胶成像结果如图3所示。

由图3可知，在一定的多重PCR体系和扩增条件中，变化不同猪物种的引物添加量，当猪的用量为0.4-0.8μl时(0.08-0.16体积份)均能从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，验证了不同猪物种的不同引物添加量的PCR体系和扩增条件中各物种特异性引物的有效性和特异性。

实施例4

在牛物种的不同引物添加量下，以牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品等量混合后，稀释到最终DNA浓度为150ng/μl，作为样品模板，用牛、猪、羊、鸡、鸭的特异性引物的多重PCR体系和反应条件，分别扩增牛猪羊鸡鸭的基因组，每个反应重复3次。具体步骤如下：

(1)等量混合总DNA样品的处理：将牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品按照等量混合后，稀释到最终DNA浓度为150ng/μl，作为样品模板，并将引物稀释至10μmol/L；

(2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系50μl/管。双蒸水30.4-32μl，l0×PCR反应缓冲液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，总DNA模板1μl，10μM引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V的正向引物和反向引物，猪0.6μl，鸡0.6μl，羊1.0μl，鸭0.6μl，牛1.0μl、0.8μl、0.6μl、0.4μl、0.2μl，其中Taq酶为常规Taq酶(参见Tiangen公司的Taq酶说明书)。

(3)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，58℃退火35s，72℃延伸90s，进行50次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。

(4)2wt％琼脂糖凝胶电泳：将3)中所得PCR反应产物进行2wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。所得凝胶成像结果如图4所示。

由图4可知，在一定的多重PCR体系和扩增条件中，变化不同牛物种的引物添加量，当牛的用量为0.4-1.0μl时(0.08-0.20体积份)均能从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，验证了不同牛物种的不同引物添加量的PCR体系和扩增条件中各物种特异性引物的有效性和特异性。

实施例5

在羊物种的不同引物添加量下，以牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品等量混合后，稀释到最终DNA浓度为200ng/μl，作为样品模板，用牛、猪、羊、鸡、鸭的特异性引物的多重PCR体系和反应条件，分别扩增牛猪羊鸡鸭的基因组，每个反应重复3次。具体步骤如下：

(1)等量混合总DNA样品的处理：将牛、猪、羊、鸡、鸭5种动物的总DNA样品按照等量混合后，稀释到最终DNA浓度为200ng/μl，作为样品模板，并将引物稀释至10μmol/L；

(2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系50μl/管。双蒸水29.6-31.2μl，l0×PCR反应缓冲液5μl，2.5mM的dNTPs4μl，2.5U/μl的Taq酶2μl，总DNA模板1μl，10μM引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV、引物对V的正向引物和反向引物，猪0.6μl，鸡0.6μl，牛0.6μl，鸭0.6μl，羊1.0μl、1.2μl、1.4μl、1.6μl、1.8μl，其中Taq酶为常规Taq酶(参见Tiangen公司的Taq酶说明书)。

(3)PCR反应程序的制定：依次进行95℃下预变性10min，94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸90s，进行35次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物。

(4)2wt％琼脂糖凝胶电泳：将3)中所得PCR反应产物进行2wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入溴化乙锭(EB)进行染色，然后再120V下电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。所得凝胶成像结果如图5所示。

由图5可知，在一定的多重PCR体系和扩增条件中，变化不同羊物种的引物添加量，当羊的用量为1.0-1.8μl时(0.20-0.36体积份)均能从总DNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带，验证了不同羊物种的不同引物添加量的PCR体系和扩增条件中各物种特异性引物的有效性和特异性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。