一种玉米烟嘧磺隆抗感分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种玉米烟嘧磺隆抗感分子标记及其应用。

背景技术：

玉米是我国重要的粮食作物之一。目前，我国人均耕地只有0.093公顷，随着生产粮食的土地和淡水资源的减少，粮食供应安全问题日益凸显。除草剂烟嘧磺隆在玉米的生产中，具有使用最广，安全最高，用量最少，价格低廉等优点，广受农民和育种家的喜爱。近年来发现，越来越多的玉米自交系和杂交种对烟嘧磺隆敏感，严重影响了正常的玉米育种和生产。

玉米烟嘧磺隆的敏感性受隐性单基因nsfy控制，其抗性受显性单基因nsfy控制。在传统育种中筛选玉米烟嘧磺隆抗性材料需要大规模的田间选择，工作量大，效率低，难以满足现在的需要。

技术实现要素：

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，结合长期研究与探索，提供了一种玉米烟嘧磺隆敏感、抗性的两个分子标记，两个标记的长度分别为为277bp和261bp，都位于玉米5号染色体nsfy基因内；通过分子标记的应用，可以检测玉米品种或自交系中是否具有烟嘧磺隆抗性基因，以加快玉米烟嘧磺隆抗性品种的选育进程。由于采用了专用的玉米烟嘧磺隆敏感和抗性的分子标记，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了玉米烟嘧磺隆抗性品种或自交系的选择效率和质量，开发了实效性分子标记，研制玉米烟嘧磺隆感性分子辅助育种体系，可以程序化应用于育种实践。

发明人提供的具体技术方案如下:

本发明所获得的玉米烟嘧磺隆敏感分子标记位于玉米烟嘧磺隆敏感基因nsfy内；其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述；

玉米烟嘧磺隆抗性分子标记位于玉米烟嘧磺隆抗性基因nsfy内；其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所述；

上述两个分子标记根据现有技术中基因nsfy中的SNP位点由本发明的发明人首次开发获得的；

获得上述两个分子标记后，可利用该分子标记检测玉米烟嘧磺隆品种或自交系中是否含有烟嘧磺隆抗性的基因nsfy，其具体步骤为：

(1)检测玉米烟嘧磺隆品种或自交系中是否含有烟嘧磺隆敏感基因nsfy：

利用特异性引物扩增目标植株的叶片DNA，获得295bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，之后利用AvaII专一酶酶切后检测是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所述的片段；

判定标准为：具有玉米烟嘧磺隆敏感的品种或自交系中出现如SEQ ID NO:1所述的277bp的电泳带；不具有玉米烟嘧磺隆敏感的品种或自交系中该片段不会切除，所以不会出现；

为了配合该分子标记，发明人设计了其特异性引物，其

正向引物序列：5′-GCGTGCTTCACGGAGCAGGAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)；

反向引物序列：5′-TGAGCACGCCGAGGGAGA-3′(如SEQ ID NO:4所示)。

(2)检测玉米烟嘧磺隆品种或自交系中是否含有烟嘧磺隆抗性的基因nsfy：

利用特异性引物扩增目标植株的叶片DNA，获得294bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，之后利用BclI专一酶酶切后检测是否含有核苷酸序列如SEQ ID NO:5所述的片段；

判定标准为：具有玉米烟嘧磺隆抗性的品种或自交系中出现如SEQ ID NO:5所述的261bp的电泳带；不具有玉米烟嘧磺隆抗性的品种或自交系中该片段不会切除，所以不会出现；

为了配合该分子标记，发明人设计了其特异性引物，其

正向引物序列：5′-CGTCGCCTTCCTCTTCTTGG-3′(如SEQ ID NO:7所示)；

反向引物序列：5′-ATGGACTCGAAGCGCGGGCGGTTGGCGATGATC-3′(如SEQ ID NO:8所示)。

通过特异性引物的扩增，以及对产物的酶切结果进行判定，即可判定该位点是否含有玉米烟嘧磺隆敏感、抗性基因，故而即可获知待测玉米品种或品系是否具有烟嘧磺隆敏感、抗性表型，从而可以更好的育种并应用于品种改良。

综上所述，本发明人首次提供了一种玉米烟嘧磺隆抗感分子标记，该标记位于玉米5号染色体的nsfy基因上；通过该分子标记的应用，可以检测玉米品种或自交系中是否含有玉米烟嘧磺隆敏感、抗性基因，以加快玉米烟嘧磺隆抗性品种的选育进程，由于采用了专用的烟嘧磺隆敏感、抗性分子标记，不仅筛选快速精准，不受环境影响，选择目标明确，而且节约了生产成本，大大提高了玉米烟嘧磺隆抗性品种或品系的选择效率和质量。

附图说明

图1为利用本发明所述的分子标记和判定方法对玉米烟嘧磺隆敏感自交系和玉米烟嘧磺隆抗性自交系的酶切验证结果电泳灰度图，

图中可知，玉米烟嘧磺隆敏感自交系经过酶切后出现了277bp的电泳带，而玉米烟嘧磺隆抗性自交系则没有出现；

图2为利用本发明所述的分子标记和判定方法对玉米烟嘧磺隆敏感自交系和玉米烟嘧磺隆抗性自交系的酶切验证结果电泳灰度图，

图中可知，玉米烟嘧磺隆抗性自交系经过酶切后出现了261bp的电泳带，而玉米烟嘧磺隆敏感自交系则没有出现。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；

实施例1玉米烟嘧磺隆抗性相关分子标记的应用

1.玉米的叶片DNA提取

采用常规技术提取玉米叶片DNA；

2.目标产物扩增

正向引物序列：5′-CGTCGCCTTCCTCTTCTTGG-3′(如SEQ ID NO:7所示)；反向引物序列：5′-ATGGACTCGAAGCGCGGGCGGTTGGCGATGATC-3′(如SEQ ID NO:8所示)。

PCR扩增：其PCR扩增体系为20μL

扩增条件：

通过上述扩增即可获得294bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

PCR产物专一酶切：

酶切体系10μL:

专一酶BclI：0.3μL

PCR产物：3μL

10×NE buffer:0.7μL

DdH₂O:6μL

酶切反应条件：PCR扩增产物中添加0.3μL BclI专一酶(市场购得)，50℃水浴2h。然后将酶切体系放置65℃5min；

将上述扩增产物分别在8％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，扩增产物分子量大小为294bp，扩增产物酶切后，具有烟嘧磺隆抗性基因nsfy的品种或自交系中出现如SEQ ID NO:5所述的261bp的电泳带；不具有烟嘧磺隆抗性基因nsfy的品种或自交系中该片段未被切掉，无该片段；如图2所示。

实施例2玉米烟嘧磺隆敏感相关分子标记的应用

1.玉米的叶片DNA提取，

采用常规技术提取玉米叶片DNA；叶片分别来源于玉米烟嘧磺隆抗性自交系和玉米烟嘧磺隆敏感自交系；

2.目标产物扩增

正向引物序列：5′-GCGTGCTTCACGGAGCAGGAC-3′(如SEQ ID NO:3所示)；反向引物序列：5′-TGAGCACGCCGAGGGAGA-3′(如SEQ ID NO:4所示)。

PCR扩增：其PCR扩增体系为20μL

扩增条件：

通过上述扩增即可获得295bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

PCR产物专一酶切：

酶切体系10μL:

专一酶AvaII：0.3μL

PCR产物：3μL

10×NE buffer:0.7μL

DdH₂O:6μL

酶切反应条件：PCR扩增产物中添加0.3μL AvaII专一酶(市场购得)，37℃水浴2h。然后将酶切体系放置65℃5min。

将上述扩增产物分别在8％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，扩增产物分子量大小为295bp，扩增产物酶切后，具有烟嘧磺隆敏感基因nsfy的品种或品系中出现如SEQ ID NO:1所述的277bp的电泳带；不具有烟嘧磺隆敏感基因nsfy的品种或品系中该片段未被切掉，无该片段；如图1所示。