一种MG53多聚体制备方法及其用途与流程

发明领域本发明涉及mg53多聚体或mg53突变体的多聚体以及它们的制备方法。同时本申请还涉及该mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病中的用途，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂等。与溃疡相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡。与肾损伤相关疾病选自一下疾病的一种或多种：肾病综合征，肾前性、肾性和肾后性的急性肾损伤，慢性肾衰竭。相比于mg53单体，mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在能更好地保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病的同时，还避免了同样具有心脏保护功效的mg53同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。并且相对于mg53单体，这种mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在溃疡，尤其是慢性溃疡和消化性溃疡，例如糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡的治疗中更加有效。发明背景mg53是骨骼肌特异性蛋白mitsugumin53，简称mg53或trim72。mg53是一种肌肉特异性tripartitemotiffamily(trim)家族蛋白。该家族蛋白常含三个特定基序结构，分别称为ring，b-box和卷曲结构域(coiledcoil结构域)。它们共同作用结合在细胞不再需要的蛋白质上，将这些蛋白质带上泛素标记以便降解。mg53也是细胞膜修复机制的重要组成部分。在医学应用方面，mg53治疗由细胞凋亡引起的心脏疾病的功效已被接受并且是本领域技术人员公知的。mg53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加mg53的含量保护心脏损伤。但是，mg53同时存在着不可忽视并被视为一大危害的负面效果，即增加含量的mg53在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说mg53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用。这种副作用是业内所关心的且不希望的，至今没有解决渠道。研究显示，在自然条件下和细胞内部mg53均是以单体存在，而对mg53多聚体的研究比较少。发明概述本发明提供mg53多聚体或mg53突变体的多聚体及它们的制备方法。这种mg53多聚体或mg53突变体的多聚体通过真核生物细胞表达。这种mg53多聚体或mg53突变体的多聚体主要由mg53二聚体的形式组成。研究发现，这种mg53多聚体或mg53突变体的多聚体可用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂等。与溃疡相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡等。特别地，申请人发现相比于mg53单体，mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在能更好地保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病的同时，还能避免具有心脏保护功效的mg53单体同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。并且，相比于mg53单体，mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡的治疗中更加有效。mg53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加mg53的含量保护心脏损伤。但之后发现，增加量的mg53的在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说mg53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。为促进mg53蛋白功能的优化，本申请进行大量的科研工作对mg53蛋白进行优化，其中一个目的是希望能在不引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用等前提下，使mg53蛋白保留心脏保护功能，但不伴随相应的副作用。本发明提供一种mg53多聚体，其中主要是mg53二聚体的形式组成。本发明还提供一种mg53突变体的多聚体，其特征在于，该mg53突变体的多聚体为mg53的n端的ring结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体；该7个半胱氨酸分别是在ring结构域的第14位点、第17位点、第29位点、第34位点、第37位点、第53位点、第56位点。优选地，这种mg53突变体的突变体的多聚体主要由mg53二聚体的形式组成。在一个实施方案中，在这种突变体的多聚体中，mg53的n端的ring结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变成非极性氨基酸，具体为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸。优选地，所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。更优选地，在这种mg53突变体的突变体的多聚体中，所述非极性氨基酸为丙氨酸，所述mg53突变体的多聚体选自mg53多聚体c14a、mg53多聚体c17a、mg53多聚体c29a、mg53多聚体c34a、mg53多聚体c37a、mg53多聚体c53a、mg53多聚体c56a中的任意一种。在另一个方面，本发明提供一种mg53突变体的多聚体，其中在mg53蛋白的coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为除苏氨酸和酪氨酸以外的氨基酸。在一个实施方案中，coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为非极性氨基酸。在一个实施方案中，在这种mg53突变体的多聚体中，coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为非极性氨基酸，所述的非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、或蛋氨酸。优选地，非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。最优选地，该非极性氨基酸为丙氨酸。在一个实施方案中，当mg53突变体的多聚体中非极性氨基酸为丙氨酸时，所述的mg53突变体选自选自mg53多聚体s150a、mg53多聚体s189a、mg53多聚体s211a中的任意一种或多种。在大多数胰岛素靶器官中，人们已经基本认清胰岛素信号网络的大致骨架结构，即ir/irss-pi3k-akt通路；然而，对于影响此信号途径的具体分子机制，人们的研究目前却刚刚起步。mg53能够有效地泛素化胰岛素受体(ir)和胰岛素受体底物1(irs1)，其中的mg53的ring结构域，特别是氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸，对于mg53催化ir和irs1泛素化是必需的(cn103965342a)。目前用于治疗溃疡，尤其是慢性皮肤溃疡的现有药物的效果都不太理想。尽管在一些文献，例如cn103275980a和cn101511181b中提示包含mg53的组合物有可能用于治疗溃疡。但现有技术中未进行mg53治疗溃疡的试验研究。本发明设计和优化了mg53的多个密码子序列和信号肽序列，通过基因合成、亚克隆，转染、表达和纯化产生了一种mg53多聚体(n≥2)，其中mg53主要以二聚体形式存在。申请人发现mg53多聚体对细胞膜修复的能力显著高于天然mg53蛋白(单体)，并且不会引起或者诱发脂代谢和糖代谢综合征。此外，本发明还提供了上述mg53突变体的多聚体，类似于mg53多聚体，这种mg53突变体的多聚体对细胞膜修复的能力显著高于天然mg53蛋白(单体)，并且不会引起或者诱发脂代谢和糖代谢综合征。在一个实施方案中，本发明提供的上述mg53多聚体或mg53突变体的多聚体相比于mg53单体，能更好地保护心脏，避免了同样具有心脏保护功效的mg53单体所带来的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。并且相比于mg53单体，这些mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡的治疗中取得了更加显著的效果。在一个实施方案中，mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的序列的属种包括灵长类动物、大鼠和小鼠。在一个实施方案中，本申请提供了一种制备mg53多聚体的方法，其包括以下步骤：a.将mg53基因连接到表达载体中获得mg53表达质粒，优选地在所述mg53基因连接到表达载体之前将所述mg53基因与信号肽连接；b.在真核细胞中表达在所述步骤a中连接获得的mg53表达质粒以产生mg53多聚体蛋白。在一个实施方案中，通过密码子优化野生型mg53基因获得mg53基因，这种mg53基因可用于本申请中的制备mg53多聚体的方法，从而更好地在真核细胞中表达mg53多聚体。在一个优选的实施方案中，经优化的mg53基因具有如seqidno:7所示的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，所述信号肽具有如seqidno:12所示的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，mg53表达质粒具有如seqidno:19所示的核苷酸序列。优选地mg53表达质粒编码的多肽具有如seqidno:25所示的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，上述制备mg53多聚体的方法还包括使用层析例如q-hp柱层析和monoq柱层析纯化在所述步骤b中产生的mg53多聚体蛋白。优选地，在q-hp柱层析中，结合液a为20mmtris，ph8.5，洗脱液b为20mmtris和1.0mnacl，ph8.5，任选地用a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液和/或洗脱液b洗脱，优选地用a和b的混合物中洗脱液b为20％(体积比)的溶液洗脱。在另一个优选的实施方案中，在monoq柱层析中，结合液a为20mm磷酸盐缓冲液(pb)，ph7.0，洗脱液b为20mm磷酸盐缓冲液(pb)和1.0mnacl，ph7.0,任选地用a和b的混合物中洗脱液b为10％(体积比)的溶液和/或a和b的混合物中洗脱液b为10％-30％(体积比)的梯度的溶液和/或洗脱液b洗脱。在一个实施方案中，使用真核细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(cho)、cos或hek293-f(hek293-freestyle)细胞等表达本申请的mg53多聚体。在一个实施方案中，在制备mg53多聚体的方法中，在将mg53基因连接到表达载体之前，将所述mg53基因连接到克隆载体中进行扩增，优选地在所述mg53基因与信号肽连接之后，将所述mg53基因连接到克隆载体中进行扩增。优选地，克隆载体是puc57、m13mp18/19(rf)载体、palter-1载体、palter-ex1载体、pgem-3z载体、pgem-3zf(+/-)载体、pgem-4z载体、pgem-5zf+/-载体或pgem-7zf+/-载体。在另一个实施方案中，将mg53基因与表达载体例如pgenht10、okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogene)或psport1(gibcobrl)等连接。在又一个方面，本发明提供了制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法，其包括以下步骤：a.对mg53基因进行突变，得到mg53突变体基因；b.将mg53突变体基因连接到表达载体中获得mg53突变体表达质粒，优选地在所述mg53突变体基因连接到表达载体之前将所述mg53突变体基因与信号肽连接；c.在真核细胞中表达在所述步骤b中连接获得的mg53突变体表达质粒以获得mg53突变体的多聚体蛋白。在一个实施方案中，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，其中所述mg53基因是通过密码子优化野生型mg53基因获得的，优选地所述经优化的mg53基因具有如seqidno:7所示的核苷酸序列。优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，所述信号肽具有如seqidno:12所示的核苷酸序列。在一个实施方案中，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，还包括使用层析例如q-hp柱层析和monoq柱层析纯化在所述步骤c中产生的mg53突变体的多聚体蛋白。优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，在所述q-hp柱层析中，结合液a：20mmtris，ph8.5，洗脱液b：20mmtris和1.0mnacl，ph8.5，任选地用a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液和/或洗脱液b洗脱。优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，在所述monoq柱层析中，结合液a为20mm磷酸盐缓冲液(pb)，ph7.0，洗脱液b为20mm磷酸盐缓冲液(pb)和1.0mnacl，ph7.0,任选地用a和b的混合物中洗脱液b为10％(体积比)的溶液和/或a和b的混合物中洗脱液b为10％-30％(体积比)的梯度的溶液和/或洗脱液b洗脱。在一个实施方案中，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，其中所述真核细胞为中国仓鼠卵巢细胞(cho)、cos或hek293-f(hek293-freestyle)细胞。在一个优选的实施方案中，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，将所述mg53突变体基因连接到所述表达载体之前，将所述mg53突变体基因连接到克隆载体中进行扩增，优选地在所述mg53突变体基因与信号肽连接之后，将所述mg53突变体基因连接到克隆载体中进行扩增。优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，所述表达载体是pgenht10，okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogene)或psport1(gibcobrl)。更优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，所述克隆载体是puc57、m13mp18/19(rf)载体、palter-1载体、palter-ex1载体、pgem-3z载体、pgem-3zf(+/-)载体、pgem-4z载体、pgem-5zf+/-载体或pgem-7zf+/-载体。在一个方面，本申请提供了包含mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的药物组合物。优选地，该药物组合物中包含可药用的赋形剂或载体。在另一个方面，本申请提供的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体可用于制备用于预防和/或治疗与细胞膜损伤相关疾病的药物组合物。在一个实施方案中，与细胞膜损伤相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤。在一个优选的实施方案中，与心肌细胞损伤相关的疾病包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂等。在一个优选的实施方案中，与溃疡相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡等。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的干粉制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的干粉制剂的方法包括以下步骤：(1)溶解辅料，并将其与mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体溶液混合，调整ph值至6.5-8.0，获得包含0.1-2.0mg/ml的蛋白质溶液；(2)通过过滤除菌和在合适的冷冻干燥条件下冷冻干燥所述包含0.5-2mg/ml的mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体溶液获得干粉制剂。在一个实施方案中，辅料包含选自以下的一种或多种：多羟基化合物、糖类、表面活性剂和聚合物。在一个优选的实施方案中，多羟基化合物包含选自以下的一种或多种：甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和聚乙二醇。在一个优选的实施方案中，糖类包含选自以下的一种或多种：蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘露糖和麦芽糖。在一个优选的实施方案中，表面活性剂包含选自以下的一种或多种：tween80、十二烷基硫酸钠。在一个优选的实施方案中，聚合物包含选自以下的一种或多种：聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮。在一个优选的实施方案中，辅料是甘露醇、组氨酸、蔗糖。更优选地，在包含0.5mg/ml蛋白质的溶液中包含50mg/ml甘露醇、25mg/ml蔗糖和25mg/ml组氨酸。在另一个优选的实施方案中，辅料是蔗糖、甘露醇和tween-80。在一个优选的实施方案中，合适的冷冻干燥条件为：(1)预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2pa,(2)90分钟升温至-6℃，保持10个小时，(3)1小时升温至15℃，保持5小时，(4)进一步干燥。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的水针制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的水针制剂的方法包含以下步骤：(1)用溶剂溶解冻干的mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，(2)调整ph值，并过滤，(3)封口并灭菌，从而制成包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的水针制剂。在一个实施方案中，溶剂是医学常用溶剂，优选水，例如注射用水或生理盐水。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的喷雾制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的喷雾制剂的方法包括以下步骤：(1)冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，(2)用溶剂溶解所述冻干的mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，以配制成包含50ng-100μg/mlmg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的喷雾制剂。在一个实施方案中，溶剂是医学常用溶剂，优选水，例如纯化水或生理盐水。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的凝胶制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的凝胶制剂的方法包括以下步骤：(1)冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，(2)用溶剂溶解所述冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，配制成凝胶溶剂。在一个实施方案中，溶剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或卡波姆、甘油、壳聚糖和尼泊金乙酯的混合物。在一个优选的实施方案中，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是在低温例如4-8℃保存的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的乳剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的乳剂的方法包括以下步骤：(1)冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，(2)用壳聚糖溶液溶解所述冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，加入乳剂基质和甘油，配制成乳剂。在一个优选的实施方案中，乳剂基质包含硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、tween-80、甘油和水等。具体地，本发明涉及以下方面：1.通过真核生物细胞表达的mitsugumin53(mg53)多聚体。2.项1的mg53多聚体，其主要由mg53二聚体形式组成。3.通过真核生物细胞表达的mitsugumin53(mg53)突变体的多聚体，其特征在于，该mg53突变体的多聚体为mg53的n端的ring结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体；该7个半胱氨酸分别是在ring结构域的第14位点、第17位点、第29位点、第34位点、第37位点、第53位点、第56位点。4.项3的mg53突变体的多聚体，其主要由mg53二聚体的形式组成。5.项3或4的mg53突变体的多聚体，其特征在于所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸。6.项5的mg53突变体的多聚体，其特征在于所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。7.项6的mg53突变体的多聚体，其特征在于所述非极性氨基酸为丙氨酸，所述mg53突变体的多聚体选自mg53多聚体c14a、mg53多聚体c17a、mg53多聚体c29a、mg53多聚体c34a、mg53多聚体c37a、mg53多聚体c53a、mg53多聚体c56a中的任意一种或多种。8.通过真核生物细胞表达的mitsugumin53(mg53)多聚体的突变体，其特征在于mg53的coiled-coil结构域中的丝氨酸位点突变为除苏氨酸和酪氨酸以外的氨基酸。9.项8的mg53突变体的多聚体，其主要由mg53二聚体的形式组成。10.项8或9的mg53突变体的多聚体，其特征在于，所述丝氨酸突变为非极性氨基酸。11.项10的mg53突变体的多聚体，其特征在于，所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸。12.项10或11的mg53突变体的多聚体，其特征在于，所述非极性氨基酸为丙氨酸，所述mg53突变体的多聚体为选自mg53多聚体s150a、mg53多聚体s189a、mg53多聚体s211a中的任意一种或多种。13.制备项1或2的mg53多聚体的方法，其包括以下步骤：a.将mg53基因连接到表达载体中获得mg53表达质粒，优选地在所述mg53基因连接到表达载体之前将所述mg53基因与信号肽连接；b.在真核细胞中表达在所述步骤a中连接获得的mg53表达质粒以产生mg53多聚体蛋白。14.项13的方法，其中所述mg53基因是通过密码子优化野生型mg53基因获得的，优选地所述经优化的mg53基因具有如seqidno:7所示的核苷酸序列。15.项13或14的方法，其中所述信号肽具有如seqidno:12所示的核苷酸序列。16.项13-16中之一的方法，其中所述mg53表达质粒具有如seqidno:19所示的核苷酸序列，或者所述mg53表达质粒编码的多肽具有如seqidno:25所示的氨基酸序列。17.项13-16中之一的方法，其还包括使用层析例如q-hp柱层析和monoq柱层析纯化在所述步骤b中产生的mg53多聚体蛋白。18.项17的方法，其中在所述q-hp柱层析中，结合液a：20mmtris，ph8.5，洗脱液b：20mmtris和1.0mnacl，ph8.5，任选地用a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液和/或洗脱液b洗脱。19.项17的方法，其中在所述monoq柱层析中，结合液a为20mm磷酸盐缓冲液(pb)，ph7.0，洗脱液b为20mm磷酸盐缓冲液(pb)和1.0mnacl，ph7.0,任选地用a和b的混合物中洗脱液b为10％(体积比)的溶液和/或a和b的混合物中洗脱液b为10％-30％(体积比)的梯度的溶液和/或洗脱液b洗脱。20.项13-19中之一的方法，其中所述真核细胞为中国仓鼠卵巢细胞(cho)、cos或hek293-f(hek293-freestyle)细胞。21.项13-20中之一的方法，其中将所述mg53基因连接到所述表达载体之前，将所述mg53基因连接到克隆载体中进行扩增，优选地在所述mg53基因与信号肽连接之后，将所述mg53基因连接到克隆载体中进行扩增。22.项13-21中之一的方法，其中所述表达载体是pgenht10，okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogene)或psport1(gibcobrl)。23.项21的方法，其中所述克隆载体是puc57、m13mp18/19(rf)载体、palter-1载体、palter-ex1载体、pgem-3z载体、pgem-3zf(+/-)载体、pgem-4z载体、pgem-5zf+/-载体或pgem-7zf+/-载体。24.制备项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的方法，其包括以下步骤：a.对mg53基因进行突变，得到mg53突变体基因；b.将mg53突变体基因连接到表达载体中获得mg53突变体表达质粒，优选地在所述mg53突变体基因连接到表达载体之前将所述mg53突变体基因与信号肽连接；c.在真核细胞中表达在所述步骤b中连接获得的mg53突变体表达质粒以获得mg53突变体的多聚体蛋白。25.项24的方法，其中所述mg53基因是通过密码子优化野生型mg53基因获得的，优选地所述经优化的mg53基因具有如seqidno:7所示的核苷酸序列。26.项24或25的方法，其中所述信号肽具有如seqidno:12所示的核苷酸序列。27.项24-26中之一的方法，其还包括使用层析例如q-hp柱层析和monoq柱层析纯化在所述步骤c中产生的mg53突变体的多聚体蛋白。28.项27的方法，其中在所述q-hp柱层析中，结合液a：20mmtris，ph8.5，洗脱液b：20mmtris和1.0mnacl，ph8.5，任选地用a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液和/或洗脱液b洗脱。29.项27的方法，其中在所述monoq柱层析中，结合液a为20mm磷酸盐缓冲液(pb)，ph7.0，洗脱液b为20mm磷酸盐缓冲液(pb)和1.0mnacl，ph7.0,任选地用a和b的混合物中洗脱液b为10％(体积比)的溶液和/或a和b的混合物中洗脱液b为10％-30％(体积比)的梯度的溶液和/或洗脱液b洗脱。30.项24-29中之一的方法，其中所述真核细胞为中国仓鼠卵巢细胞(cho)、cos或hek293-f(hek293-freestyle)细胞。31.项24-30中之一的方法，其中将所述mg53突变体基因连接到所述表达载体之前，将所述mg53突变体基因连接到克隆载体中进行扩增，优选地在所述mg53突变体基因与信号肽连接之后，将所述mg53突变体基因连接到克隆载体中进行扩增。32.项24-31中之一的方法，其中所述表达载体是pgenht10，okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogene)或psport1(gibcobrl)。33.项31的方法，其中所述克隆载体是puc57、m13mp18/19(rf)载体、palter-1载体、palter-ex1载体、pgem-3z载体、pgem-3zf(+/-)载体、pgem-4z载体、pgem-5zf+/-载体或pgem-7zf+/-载体。34.药物组合物，其包含项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体。35.项34中的药物组合物，其还包括可药用的赋形剂或载体。36.项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体在制备用于预防和/或治疗与细胞膜损伤相关疾病的药物组合物中的用途。37.项36的用途，其中所述与细胞膜损伤相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤。38.项37的用途，其中所述与心肌细胞损伤相关的疾病包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂，并且所述药物组合物不会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。39.项37中的用途，其中所述与溃疡相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡。40.项37中的用途，其中所述与肾损伤相关疾病包括选自一下疾病的一种或多种：肾病综合征，肾前性、肾性和肾后性的急性肾损伤，慢性肾衰竭。40.包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的干粉制剂。41.制备包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的干粉制剂的方法，其包括以下步骤：(1)溶解辅料，并将其与mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体溶液混合，调整ph值至6.5-8.0，获得包含0.1-2.0mg/ml的蛋白质溶液；(2)通过过滤除菌和在合适的冷冻干燥条件下冷冻干燥所述包含0.5-2mg/ml的mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体溶液获得干粉制剂。42.根据项41的方法，其中所述辅料包含选自以下的一种或多种：多羟基化合物、糖类、表面活性剂和聚合物。43.根据项42的方法，其中所述多羟基化合物包含选自以下的一种或多种：甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和聚乙二醇，所述糖类包含选自以下的一种或多种：蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘露糖和麦芽糖，所述表面活性剂包含选自以下的一种或多种：tween80、十二烷基硫酸钠，和/或所述聚合物包含选自以下的一种或多种：聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮。44.根据项41的方法，其中所述辅料为蔗糖、甘露醇和组氨酸。45.根据项41的方法，其中所述辅料为蔗糖、甘露醇和tween-80。46.根据项41的方法，其中所述合适的冷冻干燥条件为：(1)预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2pa,(2)90分钟升温至-6℃，保持10个小时，(3)1小时升温至15℃，保持5小时，和(4)进一步干燥。47.包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的水针制剂。48.制备包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的水针制剂的方法，其包括以下步骤：(1)用溶剂溶解冻干的mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体，(2)调整ph值，并过滤，(3)封口并灭菌，从而制成包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的水针制剂。49.项48的方法，其中所述溶剂是医学常用溶剂，优选水或生理盐水。50.包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的喷雾制剂。51.制备包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的喷雾制剂的方法，其包括以下步骤：(1)冻干mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体，(2)用溶剂溶解所述冻干的mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体，以配制成包含50ng-100μg/mlmg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的喷雾制剂。52.项51的方法，其中所述溶剂是医学常用溶剂，优选水或生理盐水。53.包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的凝胶制剂。54.制备包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的凝胶制剂的方法，其包括以下步骤：(1)冻干mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体，(2)用溶剂溶解所述冻干mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体，配制成凝胶溶剂。55.项54的方法，其中所述溶剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或卡波姆、甘油、壳聚糖的混合物。56.项55的方法，其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是在低温例如4-8℃保存的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。57.包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的乳剂。58.制备包含mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体的乳剂的方法，其包括以下步骤：(1)冻干mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体，(2)用壳聚糖溶液溶解所述冻干mg53单体或项1或2的mg53多聚体或项3-12中之一的mg53突变体的多聚体，加入乳剂基质和甘油，配制成乳剂。59.项58的方法，其中所述乳剂基质包含硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、tween-80、甘油和水。附图简述图1.mg53结构图。mg53从n端至c端分别为具有e3连接酶活性的ring结构域(也称作ring手指区域)、b-box结构域、coiled-coil结构域和spry结构域。图2.使用信号肽1进行的用于真核细胞cho表达的mg53密码子优化。使用信号肽1，构建了包含5种不同的经优化的mg53密码子质粒，分别为trim72-s1-1，trim72-s1-2,trim72-s1-3，trim72-s1-4,trim72-s1-5。同时还构建了包含天然mg53基因序列的质粒，trim72-s1-n。每种mg53质粒序列从n端至c端分别为hindiii–kozak序列—信号肽1---优化密码子序列或野生型密码子序列—终止密码子—ecori。图3.使用信号肽2进行的用于真核细胞cho表达的mg53密码子优化。使用信号肽2，构建了包含5种不同的经优化的mg53密码子质粒，分别为trim72-s2-1，trim72-s2-2,trim72-s2-3，trim72-s2-4,trim72-s2-5。同时还构建了包含天然mg53基因序列的质粒，trim72-s2-n。每种mg53质粒序列从n端至c端分别为hindiii–kozak序列—信号肽2---优化密码子序列或野生型密码子序列—终止密码子—ecori。图4.用于真核细胞表达的mg53的密码子优化。在共有序列中大写字母表示的碱基为相同碱基，小写字母表示的碱基为不同碱基。比较用于真核细胞cho表达的野生型mg53和经优化的mg53核苷酸碱基。根据中国仓鼠卵巢细胞(cho)偏爱密码子将mg53进行密码子优化，中国仓鼠卵巢细胞(cho)密码子使用频率参考codonusagedatabase(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。在不改变氨基酸序列的基础上使用syntheticgenedesigner(http://www.evolvingcode.net/codon/sgd/index.php)，密码子采用最优密码子，然后参考mrna的二级结构进行局部调整，尤其二级结构较为密集的地方，使mrna的自由能尽可能高，从而易于翻译。图4a,野生型mg53序列和经优化的mg53序列1-4的核苷酸碱基的比较。图4b，野生型mg53序列和经优化的mg53序列5-9的核苷酸碱基的比较。左侧的数字1-9分别代表经优化的mg53核苷酸序列1-9。图5.用于原核细胞表达的mg53的密码子优化。在共有序列中大写字母表示的碱基为相同碱基，小写字母表示的碱基为不同碱基。比较野生型mg53和经优化的用于原核细胞表达的mg53核苷酸碱基。在不改变氨基酸序列的基础上根据大肠杆菌偏爱密码子对mg53进行密码子优化。密码子采用最优密码子，然后参考mrna的二级结构进行局部调整，尤其二级结构较为密集的地方，使mrna的自由能尽可能高，从而易于翻译。图6.在构建用于真核细胞cho表达的经优化的mg53和野生型mg53质粒时使用的克隆载体和表达载体。图6a.在真核细胞cho中表达mg53时使用的克隆载体puc57和表达载体pgenht10的图谱。puc57为4.3kb。pgenht10为12.6kb。由图谱可知，puc57和pgenht10均具有hindiii和ecori多克隆位点。图6b.在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达mg53时使用的表达载体pet-22b的图谱。pet-22b大小为5.5kb。由图谱可知，pet-22b具有ndei和xhoi多克隆位点。图7.使用信号肽1和2获得的装载到pgenht10中的mg53质粒。图7a,使用信号肽1获得的装载到pgenht10中的mg53质粒。这些质粒包含5种不同的用于真核细胞cho表达的经密码子优化的mg53序列。通过琼脂糖凝胶电泳(qc)验证，获得了这5种不同的经密码子优化的mg53质粒，分别为trim72-s1-1，trim72-s1-2,trim72-s1-3，trim72-s1-4,trim72-s1-5(在图中分别简称为s1-1，s1-2,s1-3，s1-4，s1-5)。同时，还获得了未经优化的野生型的mg53质粒trim72-s1-n(在图中简称为s1-n)。图7b,使用信号肽2获得的装载到pgenht10中的mg53质粒。这些质粒包含5种不同的经密码子优化的mg53序列。通过琼脂糖凝胶电泳(qc)验证，获得了这5种不同的用于真核细胞cho表达的经密码子优化的mg53质粒，分别为trim72-s2-1，trim72-s2-2,trim72-s2-3，trim72-s2-4，trim72-s2-5(在图中分别简称为s2-1，s2-2,s2-3，s2-4,s2-5)。同时，还获得了未经优化的野生型的mg53质粒trim72-s2-n(在图中简称为s2-n)。图8.将用于原核细胞大肠杆菌bl-21表达的经密码子优化的mg53序列(seqidno:26)和pet-22b质粒进行酶切的琼脂糖凝胶电泳图。图8a中，用noti单酶切pet-22b质粒的琼脂糖凝胶电泳图，结果验证pet-22b质粒大小正确，为5.5kb，其中mk是1kb标记(solarbio)。图8b，将用于原核细胞大肠杆菌bl-21表达的经密码子优化的mg53(seqidno:26)进行ndei和xhoi双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。mk是1kb标记(solarbio)，箭头代表用于原核细胞大肠杆菌bl-21表达的经密码子优化的mg53(seqidno:26)在酶切后的mg53片段，大小为1.47kb。图9.iptg诱导后，经密码子优化的mg53(seqidno:26)在原核细胞大肠杆菌bl-21中诱导表达的sds-page图。泳道1为诱导前总蛋白；泳道2-3为iptg诱导2h和4h后总蛋白表达谱，泳道4为mg53标准品(分子量53kd)，泳道5为蛋白质标记，泳道6为诱导前上清液蛋白，泳道7-8为iptg诱导2h和4h后上清蛋白表达谱，泳道9为诱导前包涵体，泳道10为诱导4h包涵体蛋白。由此图可以看出在5l的发酵体积下，mg53在上清液和包涵体均有表达。图10.用deae柱层析纯化在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白的层析图和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)图。图10a,用deae柱层析纯化在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白的层析图，其中的cond表示电导率，concb表示a和b的混合物中洗脱液b的浓度。图10b.用deae柱层析纯化在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白的sds-page图。其中的泳道1为离心过滤后样品，泳道2为穿透峰，即指目标蛋白已经被吸附到柱上后流出层析柱的样品，泳道3为a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液洗脱获得的样品，泳道4为蛋白质标记；泳道5为mg53标准品，泳道6为a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液洗脱获得的样品，泳道7为洗脱液b洗脱获得的样品。图11.用cm柱层析纯化在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白的层析图和sds-page图。图11a,用cm柱层析纯化在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白的层析图，其中的cond表示电导率，concb表示a和b的混合物中洗脱液b的浓度。将在deae柱层析纯化mg53蛋白的过程中，用ph8.0，a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液洗脱得到的洗脱峰用cm柱层析纯化得到此层析图。图11b，用cm柱层析纯化在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白的sds-page图。其中的泳道1为上样样品，泳道2为穿透峰，即目标蛋白已经被吸附到柱上后流出层析柱的样品，泳道3-4分别为a和b的混合物中洗脱液b为10％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰a、b，泳道5为蛋白质标记；泳道6-8分别为a和b的混合物中洗脱液b为20％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰a、b和c，泳道9为a和b的混合物中洗脱液b为30％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰，泳道10为洗脱液b洗脱获得的样品。图12.sds-page检测经优化的mg53密码子和野生型mg53在中国仓鼠卵巢细胞(cho)细胞中的瞬时表达。其中的p代表mg53标准品(原核细胞表达的经纯化的mg53蛋白)，分子量为53kd。各种不同的质粒以其缩写表示为s1-1，s1-2,s1-3，s1-4,s1-n,s2-1，s2-2,s2-3，s2-4和s2-n。nc为阴性对照。由图可知，在相同的优化密码子的情况下，对于mg53表达量的影响，信号肽2优于信号肽1，优化的mg53密码子序列6优于野生型和其他优化的mg53密码子。同时，质粒trim72-s2-1(简写为s2-1)获得了最高的上清滴度。因此，在真核细胞cho中，trim72-s2-1具有最高的表达产量。图13.通过非还原性sds-page和还原性sds-page检测在真核细胞cho中表达的mg53的形式。其中的m,蛋白质标记；p,阳性对照即mg53标准品；s1-1，s1-n,s2-2，s2-n,s2-1用于真核细胞cho表达的经密码子优化的mg53或野生型mg53在真核细胞cho中的表达；nc，阴性对照，上样缓冲液。n表示在非还原性sds-page中检测真核细胞cho中表达的mg53的形式，r表示在还原性sds-page中检测真核细胞cho中表达的mg53的形式。由图可知，通过在真核细胞cho表达，非还原状态下mg53主要以多聚体形式存在(主要包括mg53二聚体)，而在还原状态下(即其中二硫键被破坏的情况下)，mg53主要以单体形式存在。图14.用q-hp柱层析纯化在真核细胞cho中表达获得的mg53多聚体蛋白的sds-page图。在此图中，泳道1为蛋白质标记，泳道2为上样前样品，泳道3为穿透峰，泳道4为用结合液a和洗脱液b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液洗脱获得的样品，泳道5为用洗脱液b洗脱获得的样品。由图可知，通过q-hp柱层析纯化，去除了mg53多聚体中包含的部分杂质蛋白。图15.用monoq柱层析纯化在真核细胞cho中表达获得的mg53多聚体蛋白的sds-page图。将q-hp柱层析纯化得到的主要的洗脱峰(ph8.5，a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液，和洗脱液b洗脱得到的洗脱峰)进行monoq柱层析。其中a为上样样品，b为monoq柱层析的穿透峰，c，d和e为用a和b的混合物中洗脱液b为20％(体积比)的溶液洗脱获得了洗脱峰在还原性sds-page中的分子量；mk为蛋白质标记，f,g，h为对应的c，d，e在非还原性sds-page下的条带。由图可知，获得的mg53多聚体在非还原性状态下主要以mg53二聚体的形式存在，分子量分别为110kd和160kd左右，而在还原性状态下的mg53以单体形式存在。图16.在非还原性sds-page中检测在原核细胞大肠杆菌bl-21和真核细胞cho表达纯化获得的mg53蛋白的表达形式。在此图中，0泳道为蛋白质标记，1，2为在还原性sds-page中的mg53蛋白,其中1为trim72-s2-1在真核细胞cho表达纯化的mg53蛋白，2为经密码子优化的mg53(seqidno:26)在原核细胞大肠杆菌bl-21表达纯化的mg53蛋白，3，4为在非还原性sds-page中的mg53蛋白,其中3为trim72-s2-1在真核细胞cho中表达纯化的mg53多聚体，4为经密码子优化的mg53(seqidno:26)在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达纯化的mg53蛋白。因此，在真核细胞cho中mg53主要是以多聚体形式，主要是mg53二聚体的形式存在，在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53主要以单体形式存在。图17.ldh法检测mg53多聚体蛋白和mg53单体蛋白对293t细胞的机械损伤的修复作用。由图可知，mg53多聚体蛋白修复293t细胞的机械损伤的活性显著高于mg53单体蛋白。图18.相对于对照组,施用mg53多聚体蛋白的sd大鼠血糖在各个时间点均无显著差异，从而有效地避免了胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。图19.mg53多聚体蛋白促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖，有利于糖尿病足溃疡和腿部溃疡愈合。图20.相对于mg53单体蛋白，mg53多聚体蛋白更有效地治疗糖尿病足坏疽。图20a,糖尿病足坏疽病人治疗前。图20b,用mg53多聚体治疗糖尿病足坏疽病人治疗1月后的情况。发明详述本发明提供mg53多聚体或mg53突变体的多聚体及它们的制备方法。这些mg53多聚体或mg53突变体的多聚体可用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂等。与溃疡相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡等。肾损伤疾病选自一下疾病的一种或多种：肾病综合征，肾前性、肾性和肾后性的急性肾损伤，慢性肾衰竭。特别地，申请人发现相比于mg53单体即天然的mg53蛋白形式，mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在能更好地保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病的同时，还能避免具有心脏保护功效的mg53单体同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。并且，相对于mg53单体，mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡的治疗中更加有效。mg53mg53是trim家族(thesuperfamilyoftripartitemotif-containingproteins)中新发现的一个蛋白质。与其他家族成员不同，它只在骨骼肌和心肌表达。mg53蛋白是由公认具有e3连接酶活性的ring结构域(也可叫做ring手指区域)、b-box结构域、coiled-coil结构域和spry结构域组成(图1)。mg53的主要功能是细胞膜修复，理论上可用于治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。现有技术已经报道了mg53可用于修复伤口，不留疤痕。mg53与心脏保护心脏血液流动的堵塞导致急性心肌梗死，产生两种不同类型的心肌损伤，包括由于血流的初始损失引起的缺血性损伤和氧合血流恢复引起的再灌注损伤。尽管通过将代谢转变为无氧酵解和脂肪酸利用以及减少收缩性，心肌可耐受短暂暴露于局部缺血(约20分钟)，但是持续的局部缺血导致不可逆的心肌损伤，造成严重的肌细胞死亡和收缩量(contractilemass)的永久性损失。缺血性心脏的及时再灌注是保持心脏细胞活力的唯一途径。但是由于经活性氧类(ros)-诱导的氧化应激、线粒体通透性转变通道(mpep)的诱导、过度收缩和凋亡以及坏死的心肌细胞死亡，再灌注可能激发对心肌的进一步损伤，即缺血/再灌注(ir)损伤。初期的研究表明，在骨骼肌和心肌中mg53能够作为一种结构蛋白促进细胞膜损伤的修复，同时也能够调节细胞内小泡的转运和骨骼肌细胞再生；另外在心肌中，mg53还参与了缺血预适应过程，它将两条重要的缺血预适应(ipc)分子通路，即pi3k-akt-gsk3β通路和cav3通路联系起来，通过促进cav3和pi3k-p85的相互作用，来活化akt/gsk3β通路，对心脏缺血/再灌损伤产生保护作用，进而在心脏缺血预处理中发挥重要保护功能(cn101797375a)。因此，mg53具有细胞膜修复功能，参与保护心肌细胞和/或组织，避免由于心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、具有对心力衰竭的修复作用。mg53与胰岛素代谢胰岛素是糖与脂肪能量代谢过程中主要的调控激素。胰岛素首先与细胞表面胰岛素受体(insr)结合，激活其b亚基的蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase，ptk)。胰岛素受体底物蛋白(insuinreceptorsubstrate，irs)作为一种锚定蛋白(dockingprotein)，与含肉瘤同源区段2(srchomology2domain，sh2)结构域的信号分子结合激活已知至少两条信号途径结合：一条是通过irs激活磷脂酰肌醇3激酶(pi3k)途径，即ir/irss-pi3k-akt通路；另一条是通过grb2/sos和ras蛋白活化丝裂原激活蛋白激酶(miogenactivatedproteinkinase，mapk)途径。磷酯酰肌醇3激酶(pi3k)家族，是生长因子超家族信号传导过程中的重要分子，可被多种细胞因子和理化因素激活，是一类特异性地催化磷酯酰肌醇3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶。在以上两条途径中，胰岛素主要通过ir/irss-pi3k-akt途径介导代谢的调节。akt处于这一通路的中心环节，aktser磷酸化水平可以作为检测对糖代谢，胰岛素抵抗的关键标志物。随着科学技术的发展，人们已经认识到胰岛素抵抗是ii型糖尿病的主要特征和中心环节，胰岛素抵抗是指机体不能利用胰岛素有效地激活胰岛素受体信号通路(1，2)。正常情况下，如上所述，一旦胰岛素与胰岛素受体结合，会催化受体的两聚体化和自身磷酸化，使之充分激活，然后招募并磷酸化胰岛素受体底物(irss)(3)，进而导致细胞内广泛的下游信号通路被激活(4)。这些信号通路以协同的方式共同调控着细胞囊泡转运、蛋白质合成、酶的激活与失活以及基因表达等生物过程，从而最终对糖、脂肪和蛋白质这三大营养物质的代谢进行控制(4)。在ii型糖尿病中，由于胰岛素作用缺陷，导致糖、脂肪和蛋白质代谢异常，随病程延长，可致眼、肾、神经、心脏和血管等多系统进行性损害，引起功能衰竭，使患者的生活质量降低，寿命缩短，病死率增高。在我国，ii型糖尿病的发病日趋低龄化，给社会和经济发展带来沉重的负担，严重危害人民的生命健康。为此，一定要对其积极防治，而防治的关键就在于改善胰岛素抵抗。已知mg53基因表达的mg53蛋白仅在心脏和骨骼肌(全身最大的胰岛素靶器官)中表达(5)，推测mg53基因的表达很可能与胰岛素的功能有关。已经发现，mg53基因的表达与胰岛素抵抗之间存在的相互关系：在胰岛素抵抗的情况下，mg53的表达明显上调；mg53的过表达会导致胰岛素抵抗的发生；mg53缺陷显著抑制了高脂饮食诱导的各种病症、促进葡萄糖代谢并且增强胰岛素敏感性(cn101912617a)。此外，mg53能够有效地泛素化胰岛素受体(ir)和胰岛素受体底物1(irs1)。mg53的ring结构域，特别是氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸，对于mg53催化ir和irs1泛素化是必需的(cn103965342a)。mg53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加mg53的含量保护心脏损伤。但随后发现，增加量的mg53的在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说mg53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。本领域均希望能在提高mg53蛋白在保护心脏方面的功能，但同时不引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。mg53与溃疡皮肤溃疡是由各种原因引起的局部组织缺损。患溃疡2周以上创面未愈合者，为慢性皮肤溃疡。慢性皮肤溃疡通常病程较长，治疗进展缓慢，对患者的机体和精神都带来很大的痛苦，并且对患者的生活质量造成很大的影响。糖尿病患者和下肢血管性疾病患者是慢性皮肤溃疡的高发人群。皮肤溃疡按不同的致病因素可分为创伤感染溃疡、压迫性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病足及腿部溃疡等。慢性皮肤溃疡治疗的主要方法是进行全身药物治疗(如使用抗生素和使用中药等)、创面的外科处理(如局部清创和抗感染用药等)及局部促进创面愈合措施。促进体表创面愈合的方法较多，如生长因子药物的使用，激光等物理疗法，局部使用中药外敷等，但这些治疗方法的临床疗效不尽人意。消化性溃疡是一种粘膜、粘膜肌层及粘膜下层的慢性溃烂，一般涉及胃溃疡和十二指肠溃疡，是一种多发病和常见病。目前，治疗消化性溃疡的药物主要包括降低胃酸的药物、根除幽门螺杆菌感染的药物和增强胃粘膜保护作用的药物。但是目前用于治疗溃疡，尤其是慢性皮肤溃疡的现有药物的效果都不太理想。尽管在一些文献，例如cn103275980a和cn101511181b中提示包含mg53的组合物有可能用于治疗溃疡，但现有技术中未进行mg53治疗溃疡的试验研究。肠漏肠漏症是肠道渗透性增加导致的病症，因此也与肠上皮细胞的损伤有关。在肠漏症患者中，用于控制营养物从肠道中释放的细胞被分解，导致肠道渗透的效率下降。在肠漏症患者中，消化过的食物的多数颗粒，通过肠壁进入血液循环。这些颗粒被人体视为传染性病原体，从而触发免疫系统的免疫应答，具体表现为白血细胞的增加、发炎、肿胀和精疲力竭。触发的免疫应答可能会导致更多的病理症状，例如溃疡、疼痛和痉挛等，从而有损机体的健康。许多情况会导致肠漏，例如一些肠道手术、衰老、某些类型的食物过敏、麸质过敏症和肠易激综合征等。目前，还没有办法彻底治愈肠漏症。已经发现，肠漏通常不是连续的，而是间歇性的突发症状。具体实施方式mg53只在骨骼肌和心肌表达。初期的研究表明，在骨骼肌和心肌中mg53能够作为一种结构蛋白促进细胞膜损伤的修复，同时也能够调节细胞内小泡的转运和骨骼肌细胞再生；并且在心肌中，mg53还通过介导caveolin-3与pi3k的结合，激活再灌注损伤救援通路(reperfusioninjurysalvagekinasepathway,riskpathway)，进而在心脏缺血预处理中发挥重要保护功能。mg53蛋白总共包含447个氨基酸，分子量为52.7kd。在自然条件下和细胞内部mg53均是以单体存在。对于mg53多聚体的研究比较少。经原核细胞表达的蛋白质，纯化过程无法排除大肠杆菌细胞壁带来的内毒素，热源等问题。与之相比，真核细胞表达的蛋白质，翻译后在真核细胞中有后期的加工和修饰，包括蛋白质空间结构折叠、糖基化等修饰。因此，真核细胞表达的蛋白质与原核表达的蛋白质的二级结构和蛋白质修饰、蛋白质活性都有差异，更能保持蛋白质的天然结构。本发明设计和优化了mg53的多个密码子序列和信号肽序列，通过基因合成、亚克隆、转染、在真核细胞中表达和纯化产生了一种mg53多聚体(n≥2)，其中mg53主要以二聚体的形成存在。这些mg53多聚体具有以下特征：1)相对于天然存在的mg53单体，细胞膜修复效率明显提高，2)相对于天然存在的mg53单体，细胞膜修复活性显著增强，3)相对于天然存在的mg53单体，分子构象、空间结构、甚至调控区域都发生了变化，4)相对于天然存在的mg53单体，能更有效地保护心脏，避免了同样具有心脏保护功效的mg53单体所带来的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用，5)相比于mg53单体，这些mg53多聚体还可以更有效地治疗溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡等。本发明还提供一种mg53突变体的多聚体，其特征在于，该mg53突变体的多聚体为mg53的n端的ring结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变为非极性氨基酸的突变体；该7个半胱氨酸分别是在ring结构域的第14位点、第17位点、第29位点、第34位点、第37位点、第53位点、第56位点。优选地，这种mg53突变体的多聚体主要由mg53二聚体的形式组成。在一个实施方案中，在这种突变体的多聚体中，mg53的n端的ring结构域7个半胱氨酸中的任一个或两个或两个以上的半胱氨酸突变成非极性氨基酸，具体为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸。优选地，所述非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。更优选地，在这种mg53突变体的多聚体中，所述非极性氨基酸为丙氨酸，所述mg53突变体的多聚体选自mg53多聚体c14a、mg53多聚体c17a、mg53多聚体c29a、mg53多聚体c34a、mg53多聚体c37a、mg53多聚体c53a、mg53多聚体c56a中的任意一种。在另一个方面，本发明提供一种mg53突变体的多聚体，其中在mg53蛋白的coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为除苏氨酸和酪氨酸以外的氨基酸。在一个实施方案中，coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为非极性氨基酸。在一个实施方案中，在这种mg53突变体的多聚体中，coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为非极性氨基酸，所述的非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、或蛋氨酸。优选地，非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。最优选地，该非极性氨基酸为丙氨酸。在一个实施方案中，当mg53突变体中非极性氨基酸为丙氨酸时，所述的mg53突变体选自选自mg53多聚体s150a、mg53多聚体s189a、mg53多聚体s211a中的任意一种或多种。与mg53多聚体类似，这种mg53突变体的多聚体也具有以下特征：1)相对于天然存在的mg53单体，细胞膜修复效率明显提高，2)相对于天然存在的mg53单体，细胞膜修复活性显著增强，3)相对于天然存在的mg53单体，分子构象、空间结构、甚至调控区域都发生了变化，4)相对于天然存在的mg53单体，能更有效地保护心脏，避免了同样具有心脏保护功效的mg53单体所带来的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用，5)相比于mg53单体，这种mg53突变体的多聚体还可以更有效地治疗溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡等。在一个实施方案中，本发明提供的上述mg53多聚体或mg53突变体的多聚体相比于mg53单体，能更好地保护心脏，避免了同样具有心脏保护功效的mg53单体同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。并且，相比于mg53单体，这种mg53多聚体或mg53突变体的多聚体还可以更有效地治疗溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡等。我们构建的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在细胞膜修复中的作用优于天然mg53单体，导致细胞膜损伤反应时间缩短，囊泡运输效率提高和修复效率提高。相比于天然mg53单体，本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体显著的细胞修复作用导致了更好的心脏保护作用和治疗溃疡的作用。在一个实施方案中，mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的序列的属种包括灵长类动物、大鼠和小鼠。mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的表达和纯化在另一个方面，本申请提供了一种制备mg53多聚体的方法，其包括以下步骤：a.将mg53基因连接到表达载体中获得mg53表达质粒，优选地在所述mg53基因连接到表达载体之前将所述mg53基因与信号肽连接；b.在真核细胞中表达在所述步骤a中连接获得的mg53表达质粒以产生mg53多聚体蛋白。同时，为促进mg53多聚体在真核细胞中的表达和方便其纯化，我们比较了两种信号肽，即信号肽1和信号肽2，以筛选适合于在真核细胞中高产量表达mg53多聚体的信号肽。在一个实施方案中，通过密码子优化野生型mg53基因获得mg53基因，这种mg53基因可用于本申请中的制备mg53多聚体的方法，从而更好地在真核细胞中表达mg53多聚体。在一个优选的实施方案中，经优化的mg53基因具有如seqidno:7所示的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，所述信号肽具有如seqidno:12所示的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，mg53表达质粒具有如seqidno:19所示的核苷酸序列。优选地mg53表达质粒编码的多肽具有如seqidno:25所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，在制备mg53多聚体的方法中，在将mg53基因连接到表达载体之前，将所述mg53基因连接到克隆载体中进行扩增，优选地在所述mg53基因与信号肽连接之后，将所述mg53基因连接到克隆载体中进行扩增。优选地，克隆载体是puc57、m13mp18/19(rf)载体、palter-1载体、palter-ex1载体、pgem-3z载体、pgem-3zf(+/-)载体、pgem-4z载体、pgem-5zf+/-载体或pgem-7zf+/-载体。在另一个实施方案中，将mg53基因与表达载体例如pgenht10、okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogene)或psport1(gibcobrl)等连接。另外，还可以使用层析例如q-hp柱层析和monoq柱层析纯化在所述步骤b中产生的mg53多聚体蛋白。利用本申请的方法制备的mg53多聚体能得到90％以上的纯度，适合用于直接制备药物组合物。在在又一个方面，本发明提供了制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法，其包括以下步骤：a.对mg53基因进行突变，得到mg53突变体基因；b.将mg53突变体基因连接到表达载体中获得mg53突变体表达质粒，优选地在所述mg53突变体基因连接到表达载体之前将所述mg53突变体基因与信号肽连接；c.在真核细胞中表达在所述步骤b中连接获得的mg53突变体表达质粒以获得mg53突变体的多聚体蛋白。在一个实施方案中，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，其中所述mg53基因是通过密码子优化野生型mg53基因获得的，优选地所述经优化的mg53基因具有如seqidno:7所示的核苷酸序列。优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，所述信号肽具有如seqidno:12所示的核苷酸序列。在一个实施方案中，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，还包括使用层析例如q-hp柱层析和monoq柱层析纯化在所述步骤c中产生的mg53突变体的多聚体蛋白。优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，在所述q-hp柱层析中，结合液a：20mmtris，ph8.5，洗脱液b：20mmtris和1.0mnacl，ph8.5，任选地用a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液和/或洗脱液b洗脱。优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，在所述monoq柱层析中，结合液a为20mm磷酸盐缓冲液(pb)，ph7.0，洗脱液b为20mm磷酸盐缓冲液(pb)和1.0mnacl，ph7.0,任选地用a和b的混合物中洗脱液b为10％(体积比)的溶液和/或a和b的混合物中洗脱液b为10％-30％(体积比)的梯度的溶液和/或洗脱液b洗脱。在一个实施方案中，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，其中所述真核细胞为中国仓鼠卵巢细胞(cho)、cos或hek293-f(hek293-freestyle)细胞。在一个优选的实施方案中，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，将所述mg53突变体基因连接到所述表达载体之前，将所述mg53突变体基因连接到克隆载体中进行扩增，优选地在所述mg53突变体基因与信号肽连接之后，将所述mg53突变体基因连接到克隆载体中进行扩增。优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，所述表达载体是pgenht10，okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogene)或psport1(gibcobrl)。更优选地，在制备本申请的mg53突变体的多聚体的方法中，所述克隆载体是puc57、m13mp18/19(rf)载体、palter-1载体、palter-ex1载体、pgem-3z载体、pgem-3zf(+/-)载体、pgem-4z载体、pgem-5zf+/-载体或pgem-7zf+/-载体。利用本申请的方法制备的mg53突变体的多聚体能得到很高的纯度，适合用于直接制备药物组合物。获得已知蛋白质的突变体的方法是本领域技术人员公知的。由于除突变mg53基因之外，制备mg53突变体的多聚体的方法和制备mg53多聚体的方法类似。以下以制备mg53多聚体的方法为例，详细地解释本发明。1.mg53多聚体质粒的构建本申请首次意外地发现，mg53基因在真核细胞中能够表达成主要由mg53二聚体组成的mg53多聚体。与之相比，在原核细胞中表达的mg53基因以mg53单体形式存在(图16)。密码子的优化密码子优化，指的是利用偏爱密码子(preferredcodons)，即避免利用率低的稀有密码子，简化基因转录后mrna的二级结构，去除不利于高效表达的模体(motif)，加入有利于高效表达的模体，调整gc含量等这些方法重新设计基因。基因合成的商业化大大推动了密码子优化的适用范围和影响力。基因的最优表达是通过对基因本身、载体、宿主系统、培养条件的系统性设计实现的。对基因和载体的设计优化主要关注以下几个重要方面：1)密码子偏好性不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mrna有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。若是在基因的同义密码子使用频率与表达宿主相匹配的情况下，蛋白的表达水平则会显著提高。匹配程度常用密码子适应指数(codonadaptionindex)来表示，通常情况下，cai≥0.80被认为是预测重组蛋白高效表达的标准。除了密码子的偏好性外，还需要考虑密码子的组合使用效率。亦即，在大部分情况下，仅用高频密码子的效果并不会最好，考虑到高频和次高频密码子的组合使用效果会更佳。2)mrna二级结构mrna二级结构是影响翻译过程的另一重要因素，复杂稳定的二级结构会阻碍翻译过程的顺利进行，特别是核糖体绑定位点(rbs)附近的二级结构。mrna二级结构在dna序列中主要表现为发卡结构(hairpin)，有效识别并尽可能的减少发卡结构是密码子优化的重要判断标准。3)影响表达的反式作用元件和限制性酶切位点的去除优化过程不仅需要考虑到对翻译有积极影响的元件/序列，还需要考虑到对转录和翻译有消极影响的元件/序列。任何对于转录和翻译有消极作用的反式作用元件需要通过密码子优化去除以消除转录和翻译过程中的多重障碍。限制性酶切位点需要根据克隆策略进行个性化排除，以免酶切位点产生冲突，影响构建表达载体的操作。4)gc含量at间存在2个氢键，gc间存在3个氢键，所以gc含量直接影响着dna序列的结合稳定性和退火温度。在启动子等保守区域gc含量相对较高。另外，gc含量也影响着mrna热力学稳定性及mrna二级结构。5)翻译起始与终止效率蛋白稳定性、mrna稳定性和翻译效率对蛋白产量和可溶性起主要作用。翻译过程分为起始、延伸和终止三个期。首先，起始阶段的顺利进行决定了蛋白质表达量从无到有。对于翻译的起始，原核mrna需要5’端非翻译前导序列中有一段叫shine-dalgarno序列的特异核糖体结合序列。在真核细胞，有效的起始依赖于围绕在起始密码子atg上下游的kozak序列(gccgccacc)。高效的延伸阶段决定了蛋白质能够积累的量。这个在前面的密码子偏好性及二级结构和反式作用元件等篇章已经详细讨论过。翻译终止是蛋白生命周期必须的一步，却最容易被忽略。科学研究表明终止效率对蛋白表达水平有很大的影响，更有效的翻译终止会促进蛋白表达。绝大多数生物都有偏爱的围绕终止密码子的序列框架，例如酵母和哺乳动物偏爱的终止密码子分别是uaa和uga，单子叶植物最常利用uga，而昆虫和大肠杆菌倾向于用uaa。为促进mg53多聚体在真核细胞中的表达和方便其纯化，我们对野生型mg53基因进行密码子优化。具体地，我们获得了9种经优化的mg53基因。在一个优选的实施方案中，根据中国仓鼠卵巢细胞(cho)偏爱密码子对mg53进行密码子优化，中国仓鼠卵巢细胞(cho)密码子使用频率参考codonusagedatabase(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。在不改变氨基酸序列的基础上使用syntheticgenedesigner(http://www.evolvingcode.net/codon/sgd/index.php)，密码子采用最优密码子，然后参考mrna的二级结构进行局部调整，尤其二级结构较为密集的地方，使mrna的自由能尽可能高，从而易于翻译(用于真核细胞表达的野生型mg53和经优化的mg53密码子的比较参见图4)。同时，为促进mg53多聚体在真核细胞中的表达和方便其纯化，我们比较了两种信号肽，即信号肽1和信号肽2，以筛选适合于在真核细胞中高产量表达mg53多聚体的信号肽。在一个实施方案中，在mg53基因与使用的信号肽连接之后，将mg53基因连接到克隆载体中进行扩增。为了筛选最适合于在真核细胞中表达和纯化的mg53优化基因和信号肽，我们设计了以下基因序列：hindiii–kozak序列—信号肽1或2---mg53优化密码子序列或野生型序列(序列1-9或天然mg53序列)—终止密码子—ecori。具体的序列见下表在mg53多聚体的构建中信号肽和密码子序列的优化表1.在mg53多聚体的构建中信号肽和密码子序列的优化基因名称使用的信号肽使用的mg53序列trim72-s1-1信号肽1优化的序列1trim72-s1-2信号肽1优化的序列2trim72-s1-3信号肽1优化的序列3trim72-s1-4信号肽1优化的序列4trim72-s1-5信号肽1优化的序列5trim72-s1-n信号肽1mg53天然序列trim72-s2-1信号肽2优化的序列6trim72-s2-2信号肽2优化的序列7trim72-s2-3信号肽2优化的序列8trim72-s2-4信号肽2优化的序列9trim72-s2-5信号肽2优化的序列5trim72-s2-n信号肽2mg53天然序列基因序列的克隆：根据上述设计的基因序列，进行基因合成。将合成的基因连接到对应的克隆载体中。包含了目的基因序列的克隆载体在转化到感受态细胞后，在合适的抗生素抗性条件下培养，会得到可见的菌落。挑选其中的单菌落，通过测序获得具有正确基因序列的质粒。合适的克隆载体是本领域已知的。常用的克隆载体有m13mp18/19(rf)载体、palter-1载体、palter-ex1载体、pgem-3z载体、pgem-3zf(+/-)载体、pgem-4z载体、pgem-5zf+/-载体或pgem-7zf+/-载体等。对使用的克隆载体没有限制，只需要其可用于扩增本申请的目的基因序列。在一个优选的实施方案中，使用克隆载体puc57、m13mp18/19(rf)载体、palter-1载体、palter-ex1载体、pgem-3z载体、pgem-3zf(+/-)载体、pgem-4z载体、pgem-5zf+/-载体或pgem-7zf+/-载体。图6a中显示了puc57的质粒图谱。将基因序列连接至表达载体中：将具有正确基因序列的质粒酶切后，连接到表达载体中。同样进行与上述克隆类似的转化和菌落筛选。经过测序分析和处理后筛选得到目的菌落。最后培养目的菌落并进行质粒抽提。抽提的质粒通过ecori和hindiii双酶切验证(图7)，将验证正确的质粒用于细胞转染表达mg53多聚体。优选的表达载体是本领域已知的，例如okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pcdm8、pet-22b、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogene)或psport1(gibcobrl)。在一个优选的实施方案中，使用表达载体pgenht10质粒。pgenht10质粒大小为12.6kb，图6a中显示了pgenht10质粒图谱。由图谱可知，pgenht10具有ecori和hindiii多克隆位点。2.mg53多聚体蛋白的表达表达蛋白质的方法是本领域技术人员公知的。为了表达mg53多聚体蛋白，例如可将mg53多聚体基因装载到合适的表达载体。通过表达载体在合适的宿主细胞进行表达。宿主细胞是真核细胞。优选地真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于，中国仓鼠卵巢细胞(cho)、cos或hek293-f(hek293-freestyle)细胞；或真菌细胞例如啤酒糖酵母(saccharomycescerevisiae)；或昆虫细胞例如sf9。优选的表达载体是本领域已知的，例如okayama-bergcdna表达载体pcdv1(pharmacia)、pcdm8、prc/cmv、pcdna1、pcdna3(invitrogene)或psport1(gibcobrl)。典型的融合表达载体的其他实例为pgex(pharmaciabiotechinc；smith,d.b.和johnson,k.s.(1988)gene67:31-40)、pmal(newenglandbiolabs，beverly，ma)和prit5(pharmacia，piscataway，nj)，其中谷胱甘肽s-转移酶(gst)、麦芽糖e结合蛋白和蛋白a分别与重组靶蛋白融合。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子尤其为ptrc(amann1988，gene69：301-315)和pet11d(studier1999，methodsinenzymology185，60-89)。ptrc载体的靶基因表达是基于通过宿主rna聚合酶进行的杂合trp-lac融合启动子的转录。来自pet11d载体的靶基因表达是基于t7gn10-lac融合启动子的转录，其由共表达的病毒rna聚合酶(t7gn1)介导。来自定居的λ-原噬菌体的病毒聚合酶由宿主菌株bl21(de3)或hms174(de3)提供，所述λ-原噬菌体携带了受lacuv5启动子转录控制的t7gn1基因。适用于原核生物的其它载体为技术人员所知，这类载体是例如大肠杆菌中的plg338、pacyc184、pbr系列如pbr322、puc系列如puc18或puc19、m113mp系列、pkc30、prep4、phs1、phs2、pplc236、pmbl24、plg200、pur290、pin-iii113-b1、λgt11或pbdci，链霉菌属中的pij101、pij364、pij702或pij361，芽孢杆菌属中的pub110、pc194或pbd214，棒杆菌属中的psa77或paj667。用于酿酒酵母中表达的载体的实例包括pyepsec1(baldari1987，emboj.6：229-234)、pmfa(kurjan1982，cell30：933-943)、pjry88(schultz1987，gene54：113-123)和pyes2(invitrogencorporation，sandiego，ca)。适用于其它真菌(如丝状真菌)的载体和载体的构建方法，包含在vandenhondel,c.a.m.j.j.,&punt,p.j.(1991)“genetransfersystemsandvectordevelopmentforfilamentousfungi,in:appliedmoleculargeneticsoffungi,j.f.peberdy等人编著，第1-28页，cambridgeuniversitypress:cambridge中，或者在moregenemanipulationsinfungi(j.w.bennet&l.l.lasure编著，第396-428页:academicpress:sandiego)中详细描述的那些载体和载体的构建方法。其它合适的酵母载体是，例如pag-1、yep6、yep13或pemblye23。在一个优选的实施方案中，使用表达载体pgenht10。在一个优选的实施方案中，在中国仓鼠卵巢细胞(cho)、cos或hek293-f(hek293-freestyle)细胞中表达mg53多聚体蛋白。更优选地，表达条件是在5％co2，37℃培养箱中培养6天-14天。转染后第6天，收集以上构建的各种质粒转染的上清液进行酶联免疫吸附测定(elisa)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测，发现trim72-s2-1(核苷酸和氨基酸序列分别对应于seqidno:19和seqidno:25)的表达量最高。同时在表达量方面，信号肽2(seqidno:12)优于信号肽1，优化的序列6(seqidno:7)为最佳密码子优化序列。因此，在一个优选的实施方案中，经优化的mg53基因具有如seqidno:7所示的核苷酸序列。在另一个优选的实施方案中，信号肽具有如seqidno:12所示的核苷酸序列。在又一个优选的实施方案中，所述mg53表达质粒具有如seqidno:19所示的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，mg53表达质粒编码的多肽具有如seqidno:25所示的氨基酸序列。3.mg53多聚体蛋白的聚体形式的检测为了检测mg53在真核细胞中的表达状态，我们挑选了高表达的质粒进行了蛋白质印迹(westernblot)的检测。申请人发现，非还原状态下mg53主要以多聚体形式存在(主要是mg53二聚体的形式存在)，在还原状态下(破坏了二硫键)，mg53主要以单体形式存在(图13)。根据上述实验，申请人发现在表达量方面，信号肽2优于信号肽1，优化的序列6为用于真核细胞表达的最佳密码子优化序列。因此，我们选择表达量最高的trim72-s2-1进行后续的实验，以获得表达产量最高的mg53多聚体。4.mg53多聚体蛋白的纯化如图12所示，通过用经优化的mg53表达质粒，例如trim72-s2-1转染真核细胞在细胞上清液中可以表达mg53多聚体。然而，在细胞上清液中，除mg53多聚体蛋白之外，还存在许多的杂质蛋白。因此，需要对表达的mg53多聚体蛋白进行纯化，以用于后续的功能研究或用于制备药物组合物。纯化蛋白质的方法是本领域技术人员公知的，并且可以单独地或者组合地使用。此类方法是例如，使用微生物衍生蛋白质的亲和层析(例如a蛋白或g蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子(氨乙基树脂)和混合模式的交换层析)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他sh配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析(例如用苯基-琼脂糖、氮杂嗜砂(aza-arenophilic)树脂或间-氨基苯硼酸(m-aminophenylboronicacid)、金属螯合亲和层析(例如用ni(ii)-和cu(ii)-亲和物质)、大小排阻层析，以及预制的电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(vijayalakshmi,m.a.,appl.biochem.biotech.75(1998)93-102)。在一个优选的实施方案中，使用层析例如q-hp柱层析和monoq柱层析纯化产生的mg53多聚体蛋白。本申请中采用q-hp柱层析和monoq柱层析组合纯化能得到90％以上纯度的mg53多聚体蛋白(参见图14-15)。这种纯化的mg53多聚体蛋白可用于制备干粉制剂、喷雾制剂或凝胶制剂、药物组合物或进行各种功能实验。在一个实施方案中，通过q-hp柱层析初步纯化在真核细胞中表达的包含mg53多聚体蛋白的细胞上清液，以去除部分杂质蛋白。在一个优选的实施方案中，在q-hp柱层析中，结合液a为20mmtris，ph8.5，洗脱液b为20mmtris和1.0mnacl，ph8.5，任选地用a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液和/或洗脱液b洗脱。在一个实施方案中，利用geaktapure150m全自动层析系统进行q-hp柱层析纯化。优选地，在q-hp柱层析中，结合液a为20mmtris，ph8.5，洗脱液b为20mmtris和1.0mnacl，ph8.5，任选地用a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液和/或洗脱液b洗脱。在进行q-hp柱层析纯化后，去除了mg53多聚体蛋白中包含的部分杂质蛋白(图14)。为了进一步提高mg53多聚体蛋白的纯度，在一个实施方案中，将q-hp柱层析纯化得到的主要的洗脱峰(ph8.5，a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液，和洗脱液b洗脱得到的洗脱峰)进行monoq柱层析。在一个优选的实施方案中，在monoq柱层析中，结合液a为20mm磷酸盐缓冲液(pb)，ph7.0，洗脱液b为20mm磷酸盐缓冲液(pb)和1.0mnacl，ph7.0,任选地用a和b的混合物中洗脱液b为10％(体积比)的溶液和/或a和b的混合物中洗脱液b为10％-30％(体积比)的梯度的溶液和/或洗脱液b洗脱，优选地用a和b的混合物中洗脱液b为20％(体积比)的溶液洗脱。。q-hp柱层析纯化得到的主要的洗脱峰在进行monoq柱层析纯化后，得到的mg53多聚体蛋白能达到90％以上的纯度(图15)。在一个实施方案中，通过q-hp柱层析和monoq柱层析纯化后的mg53多聚体蛋白可用于制备干粉制剂和/或喷雾制剂和/或凝胶制剂。在另一个实施方案中，通过q-hp柱层析和monoq柱层析纯化后的mg53多聚体蛋白可用于制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物组合物，或用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病的药物组合物。5.mg53蛋白在原核细胞例如大肠杆菌中的表达为了比较mg53在真核和原核细胞的表达形式，我们在原核细胞中表达了mg53蛋白。同样地，我们对野生型mg53基因进行了优化。在不改变氨基酸序列的基础上根据大肠杆菌偏爱密码子对mg53进行密码子优化。密码子采用最优密码子，然后参考mrna的二级结构进行局部调整，尤其二级结构较为密集的地方，使mrna的自由能尽可能高，从而易于翻译。将经优化的用于原核细胞表达的mg53序列(seqidno:26)构建到表达载体pet-22b中，并且在大肠杆菌中表达mg53蛋白，表达条件是在有氧条件下,37℃培养至od约为6.5时，加入0.5mmiptg在28℃诱导表达4h。之后，使用层析例如deae柱层析和cm柱层析(参见图10-11)纯化在原核细胞中表达的经密码子优化的mg53(seqidno:26)。本申请中采用deae柱层析和cm柱层析组合纯化能得到纯度非常高的在原核细胞中表达的mg53蛋白(参见图10-11)。这种纯化的mg53蛋白可用于制备干粉制剂、喷雾制剂或凝胶制剂、药物组合物或进行各种功能实验。在一个实施方案中，通过deae柱层析初步纯化诱导表达后的包含mg53蛋白的细菌上清液，以收集在原核细胞中表达的mg53蛋白。在一个优选的实施方案中，在deae柱层析中，结合液a为20mmtris，ph8.0，洗脱液b为20mmtris和1.0mnacl，ph8.0，任选地用a和b的混合物中洗脱液b为5％的溶液和/或洗脱液b洗脱。在一个实施方案中，利用geaktapure150m全自动层析系统进行deae柱层析纯化。在进行deae柱层析纯化后，得到的在原核细胞中表达的mg53蛋白能达到的80％的纯度。为了进一步提高在原核细胞中表达的mg53蛋白的纯度，在一个实施方案中，将deae柱层析纯化得到的主要的洗脱峰(ph8.0，a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液洗脱得到的洗脱峰)进行cm柱层析。在一个优选的实施方案中，在cm柱层析中，结合液a为20mm磷酸盐缓冲液(pb)，ph6.0，洗脱液b为20mm磷酸盐缓冲液(pb)和1.0mnacl，ph6.0,任选地用a和b的混合物中洗脱液b为10％的溶液和/或a和b的混合物中洗脱液b为10％-30％的梯度的溶液和/或洗脱液b洗脱。deae柱层析纯化得到的主要的洗脱峰在进行cm柱层析纯化后，得到的在原核细胞中表达的mg53蛋白能达到85％以上的纯度。6.mg53在真核细胞和原核细胞中的表达形式我们通过非还原性聚丙烯凝胶电泳比较了mg53在真核细胞和原核细胞中的表达形式。出乎意料地，在原核细胞中表达的mg53蛋白以单体形式存在，在真核细胞中表达的mg53蛋白以多聚体形式，主要是二聚体的形式存在(图16)。因此，通过在真核细胞中表达mg53基因，我们成功地表达了本申请的mg53多聚体。包含mg53多聚体或mg53突变体的多聚体蛋白的药物组合物在一个方面，本申请提供了包含本发明的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体蛋白的药物组合物。将本发明的药物组合物与合适的载体、赋形剂及提供改善的转移、递送、耐受等的其他试剂一起配制。多种适合的制剂可以在所有药剂师已知的处方中发现：remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,easton,pa。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有小泡(诸如lipofectintm)的脂质(阳离子的或阴离子的)、dna缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、和含有碳蜡的半固体混合物。还参见powell等人，compendiumofexcipientsforparenteralformulationspda(1998)jpharmscitechnol52:238-311。向患者施用的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体蛋白的剂量可以根据患者的年龄和尺寸、目标疾病、状况、施用途径等而变化。通常根据体重或体表面积计算优选的剂量。根据病症的严重性，可以调整治疗的频率和持续时间。施用mg53多聚体蛋白或mg53突变体的多聚体蛋白的有效剂量和时间表可以根据经验来确定；例如，可以通过定期评估监测患者病程，并相应地调整剂量。此外，可以使用本领域中众所周知的方法进行剂量的种间类推(例如,mordenti等,1991,pharmaceut.res.8:1351)。多种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如，脂质体中封装、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见，例如,wu等,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)。导入的方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何常规途径施用，例如通过输注或团注、通过上皮或皮肤粘膜(例如，口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)施用，并可以与其他生物学上有活性的试剂一同施用。施用可以是全身性的或局部的。mg53多聚体蛋白或mg53突变体的多聚体蛋白在制备用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病的药物组合物中的用途如上所述，mg53具有细胞膜修复功能，可用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。其中，与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂等。同时，与溃疡相关疾病包括选自以下疾病的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡等。申请人发现相比于天然mg53，mg53多聚体或mg53突变体的多聚体具有更强的细胞膜修复能力和保护心肌缺血再灌注损伤能力，同时避免了天然mg53导致的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。并且相比于天然mg53，mg53多聚体或mg53突变体的多聚体可更有效地治疗与溃疡相关疾病。因此，相对于天然mg53，本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体具有更优异的预防或治疗上述与细胞膜损伤相关疾病的功能。相比于天然mg53,本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体具有更强的细胞膜修复能力mg53蛋白参与保护心肌细胞和/或组织，避免心血管疾病、心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、具有对心力衰竭的修复作用。申请人发现，相比于天然mg53，本申请提供的mg53多聚体具有更强的对机械损伤的293t细胞的细胞膜的修复作用(参见实施例8，图17)。类似地，相比于天然mg53，本申请提供的mg53突变体的多聚体也具有更强的对机械损伤的293t细胞的细胞膜的修复作用。mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在制备用于预防和/或治疗与心肌细胞损伤相关疾病的药物组合物中的用途由于很多文献报道了mg53对心脏缺血/再灌损伤具有保护作用，我们对本申请的mg53多聚体在心脏缺血/再灌损伤中的作用进行了研究。结果显示，相比于mg53天然蛋白(单体)，本申请的mg53多聚体能够减少的心肌缺血梗死区面积更大，在心肌缺血前或再灌前施用能更有效地保护心肌缺血/再灌注损伤(参见实施例9)。本申请的mg53突变体的多聚体也有相似的作用，相比于mg53天然蛋白(单体)，本申请的mg53突变体的多聚体能更有效地保护心肌缺血/再灌注损伤。因此，在另一个方面，本申请提供的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体可用于制备用于预防和/或治疗与心肌细胞损伤相关疾病的药物。在一个优选的实施方案中，与心肌细胞损伤相关的疾病包括选自以下疾病的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂。mg53多聚体或mg53突变体的多聚体不引起胰岛素抵抗等副作用如上所述，mg53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加mg53的含量保护心脏损伤。但之后发现，增加量的mg53的在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。因此，mg53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。本领域均希望能保留mg53蛋白在保护心脏方面的功能，但同时不引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。对此，申请人还研究了mg53多聚体是否类似于天然mg53单体蛋白，也导致胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。特别地，申请人发现相比于天然mg53单体蛋白，mg53多聚体具有更强的细胞膜修复能力和保护心肌缺血再灌注损伤能力，同时避免了天然mg53导致的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。申请人发现，相比于野生型mg53,本申请的mg53多聚体不会导致血糖的升高(参见实施例10，图18)。类似于mg53多聚体，相比于天然mg53单体蛋白，本申请的mg53突变体的多聚体具有更强的细胞膜修复能力和保护心肌缺血再灌注损伤能力，同时避免了天然mg53导致的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。由此可知，本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在行使心脏保护功能的同时，不会导致胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。mg53多聚体或mg53突变体的多聚体在制备用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病中的药物组合物中的用途如上所述，皮肤溃疡是由各种原因引起的局部组织缺损。患溃疡2周以上创面未愈合者，为慢性皮肤溃疡。慢性皮肤溃疡通常病程较长，治疗进展缓慢，对患者的机体和精神都带来很大的痛苦，对患者的生活质量造成很大的影响。糖尿病患者和下肢血管性疾病患者是慢性皮肤溃疡的高发人群。皮肤溃疡按不同的致病因素可分为创伤感染溃疡、压迫性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病足及腿部溃疡等。慢性皮肤溃疡治疗的主要方法是进行全身药物治疗(如使用抗生素和使用中药等)、创面的外科处理(如局部清创和抗感染用药等)及局部促进创面愈合措施。促进体表创面愈合的方法较多，如生长因子药物的使用，激光等物理疗法，局部使用中药外敷等，但现有的治疗方法的临床疗效不尽人意。糖尿病足坏疽的病因复杂，其可以由营养不良、动脉粥样硬化和外伤引起。糖尿病血管病变虽然广泛，但病理发展缓慢，有利于与侧支循环的形成，若能在坏疽形成早期进行积极治疗，促进血管和表皮细胞的新生，能有效缓解或者治愈坏疽。目前所使用的局部药物，如庆大霉素，能抑制局部细菌滋生，但是不能很好促进伤口愈合，而且中药生肌作用周期长，效果欠佳。表皮生长因子虽然有一定的效果，但是很多患者使用，临床表现仍然无效。目前用于治疗溃疡，尤其是慢性皮肤溃疡的现有药物的效果都不太理想。尽管在一些文献，例如cn103275980a和cn101511181b中提示包含mg53的组合物有可能用于治疗溃疡，但现有技术中未进行mg53治疗溃疡的试验研究。申请人发现，相比于mg53单体，本申请提供的mg53多聚体对溃疡尤其是慢性溃疡和消化性溃疡具有更显著的治疗效果(图19-20)。例如，mg53多聚体具有以下作用：1)能有效地促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖，有利于糖尿病足溃疡和腿部溃疡愈合；2)相比于mg53单体，更有效地促进糖尿病足溃疡伤口愈合；2)相比于mg53单体，更有效地促进慢性胃溃疡伤口愈合；3)相比于mg53单体，更有效地治疗人糖尿病足部溃疡和坏疽。类似于mg53多聚体，本申请提供的mg53突变体的多聚体对溃疡尤其是慢性溃疡和消化性溃疡例如糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡具有更显著的治疗效果。因此，本申请提供的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体可用于制备用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病中的药物组合物。在一个优选的实施方案中，与溃疡相关疾病是慢性溃疡和消化性溃疡。在一个优选的实施方案中，慢性溃疡和消化性溃疡包括选自以下疾病的一种或多种：糖尿病足溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病腿部溃疡、糖尿病足坏疽和慢性胃溃疡等。此外，本申请提供的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体可用于制备用于预防和/或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等的药物组合物。mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的干粉制剂、喷雾制剂、凝聚制剂和乳剂的制备本申请还提供了mg53单体(例如在原核细胞中表达的mg53单体蛋白)或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的干粉制剂、喷雾制剂、凝聚制剂和乳剂。同时，还提供了这些制剂的制备方法。这些蛋白质制剂形式可以更方便地运输和保存。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的干粉制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的干粉制剂的方法包括以下步骤：(1)溶解辅料，并将其与mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体溶液混合，调整ph值至6.5-8.0，获得包含0.1-2.0mg/ml的蛋白质溶液；(2)通过过滤除菌和在合适的冷冻干燥条件下冷冻干燥所述包含0.5-2mg/ml的mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体溶液获得干粉制剂。本领域已知使蛋白质溶液稳定的常用辅料。具体有以下几类：1.多羟基化合物作用机理：使蛋白质表面形成一层水膜，保护蛋白质不受外部疏水基团的侵扰，从而达到保护溶液中蛋白质的目的。具体辅料例如：甘油，甘露醇，山梨醇，肌醇，聚乙二醇。2.糖类作用机理：阻止蛋白质二级结构的改变，对多肽链的伸展和聚集起保护作用。具体辅料例如：蔗糖，葡萄糖，乳糖，海藻糖，甘露糖，麦芽糖等。3.表面活性剂作用机理：离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)可影响蛋白质的变性；但是非离子型表面活性剂(如tween80)可防止蛋白质吸附于表面，因而能抑制蛋白质的凝聚和沉淀。具体辅料例如：tween80，十二烷基硫酸钠。4.聚合物作用机理：防止蛋白质或其他辅料结晶析出，限制分子的扩散具体辅料：聚乙二醇，聚乙烯比咯烷酮。因此，这些常用辅料可用作制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的干粉制剂的辅料。在一个实施方案中，辅料包含选自以下的一种或多种：多羟基化合物、糖类、表面活性剂和聚合物。在一个优选的实施方案中，多羟基化合物包含选自以下的一种或多种：甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和聚乙二醇。在一个优选的实施方案中，糖类包含选自以下的一种或多种：蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘露糖和麦芽糖。在一个优选的实施方案中，表面活性剂包含选自以下的一种或多种：tween80、十二烷基硫酸钠。在一个优选的实施方案中，聚合物包含选自以下的一种或多种：聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮。在一个优选的实施方案中，辅料是甘露醇、组氨酸、蔗糖。更优选地，在包含0.5mg/ml蛋白质的溶液中包含50mg/ml甘露醇、25mg/ml蔗糖和25mg/ml组氨酸。在另一个优选的实施方案中，辅料是蔗糖、甘露醇和tween-80。在一个优选的实施方案中，合适的冷冻干燥条件为：(1)预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2pa,(2)90分钟升温至-6℃，保持10个小时，(3)1小时升温至15℃，保持5小时，(4)进一步干燥。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的水针制剂及其制备方法。水针制剂，指已经溶解了药物的注射液。它是注射剂的一种，一般都装在容器例如安瓿瓶中，使用时，敲开容器进行静脉或者肌肉注射。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的水针制剂的方法包含以下步骤：(1)用溶剂溶解冻干的mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，(2)调整ph值，并过滤，(3)封口并灭菌，从而制成包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的水针制剂。在一个实施方案中，溶剂是医学常用溶剂，优选水，例如注射用水或生理盐水。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的喷雾制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的喷雾制剂的方法包括以下步骤：(1)冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，(2)用溶剂溶解所述冻干的mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，以配制成包含50ng-100μg/mlmg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的喷雾制剂。在一个实施方案中，溶剂是医学常用溶剂，优选水，例如纯化水或生理盐水。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的凝胶制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的凝胶制剂的方法包括以下步骤：(1)冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，(2)用溶剂溶解所述冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，配制成凝胶溶剂。在一个实施方案中，溶剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或卡波姆、甘油、壳聚糖和尼泊金乙酯的混合物。在一个优选的实施方案中，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是在低温例如4-8℃保存的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。在一个方面，本申请提供了包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的乳剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体的乳剂的方法包括以下步骤：(1)冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，(2)用壳聚糖溶液溶解所述冻干mg53单体或本申请的mg53多聚体或mg53突变体的多聚体，加入乳剂基质和甘油，配制成乳剂。在一个优选的实施方案中，乳剂基质包含硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、tween-80、甘油和水等。本申请使用的序列信息如下：seqidno:1.mg53天然密码子序列seqidno:2.用于真核细胞表达的mg53密码子优化序列1seqidno:3.用于真核细胞表达的mg53密码子优化序列2seqidno:4.用于真核细胞表达的mg53密码子优化序列3seqidno:5.用于真核细胞表达的mg53密码子优化序列4seqidno:6.用于真核细胞表达的mg53密码子优化序列5seqidno:7.用于真核细胞表达的mg53密码子优化序列6seqidno:8.用于真核细胞表达的mg53密码子优化序列7seqidno:9.用于真核细胞表达的mg53密码子优化序列8seqidno:10.用于真核细胞表达的mg53密码子优化序列9seqidno:11.信号肽1seqidno:12.信号肽2seqidno:13.trim72-s1-1的核苷酸序列seqidno:14.trim72-s1-2的核苷酸序列seqidno:15.trim72-s1-3的核苷酸序列seqidno:16.trim72-s1-4的核苷酸序列seqidno:17.trim72-s1-5的核苷酸序列seqidno:18.trim72-s1-n的核苷酸序列seqidno:19.trim72-s2-1的核苷酸序列seqidno:20.trim72-s2-2的核苷酸序列seqidno:21.trim72-s2-3的核苷酸序列seqidno:22.trim72-s2-4的核苷酸序列seqidno:23.trim72-s2-5的核苷酸序列seqidno:24.trim72-s2-n的核苷酸序列seqidno:25.trim72-s2-1的氨基酸序列seqidno:26.用于原核细胞表达的mg53密码子优化序列。实施例提供了以下实施例，以帮助理解本发明，在所附权利要求中给出了本发明的真正的范围。应当理解，在不背离本发明精神的情况下，可以对给出的方法进行修改。实施例1：用于表达mg53多聚体的mg53基因的优化和信号肽的选择以下是在构建mg53质粒中使用的试剂及其来源：实验试剂：pbo酶来源：genscript批号：c20041502taq酶来源：genscript批号：c20091508dntp来源：genscript批号：c51081507t4dna连接酶来源：thermoscientific批号：00309971重组酶(cloneezenzyme)来源：genscript批号：10/15/2015感受态细胞来源：genscript批号：20150921实验用水来源：ddh2o批号：10/13/2015内切酶ecori-hf来源：neb批号：0101504内切酶hindiii-hf来源：neb批号：0061504下表中列出了在构建mg53质粒中使用的设备及其来源表2.在构建mg53质粒中使用的设备及其来源1.1用于真核细胞cho表达的经密码子优化的mg53质粒的构建1.11野生型mg53质粒的密码子优化为促进mg53多聚体在真核细胞cho中的表达和方便其纯化，我们对野生型mg53基因进行密码子优化。具体地，我们获得了9种经优化的mg53基因。1.mg53基因优化，合成以及mg53亚克隆和质粒的制备：根据中国仓鼠卵巢细胞(cho)偏爱密码子将mg53进行密码子优化，中国仓鼠卵巢细胞(cho)密码子使用频率参考codonusagedatabase(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。在不改变氨基酸序列的基础上使用syntheticgenedesigner(http://www.evolvingcode.net/codon/sgd/index.php)，密码子采用最优密码子，然后参考mrna的二级结构进行局部调整，尤其二级结构较为密集的地方，使mrna的自由能尽可能高，从而易于翻译。同时，为促进mg53多聚体在真核细胞cho中的表达和方便其纯化，我们比较了两种信号肽，即信号肽1和信号肽2，以筛选适合于在真核细胞cho中高产量表达mg53多聚体的信号肽。为了筛选最适合于在真核细胞cho中表达和纯化的mg53优化基因和信号肽，我们设计了以下基因序列：hindiii–kozak序列—信号肽1或2---mg53优化密码子序列或野生型序列(序列1-9或天然mg53序列)—终止密码子—ecori。kozak序列为gccgccacc。详细的克隆方案和优化的基因序列如下：表1.在mg53多聚体的构建中信号肽和密码子序列的优化mg53天然密码子序列：atgtcggctgcgcccggcctcctgcaccaggagctgtcctgcccgctgtgcctgcagctgttcgacgcgcccgtgacagccgagtgcggccacagtttctgccgcgcctgcctaggccgcgtggccggggagccggcggcggatggcaccgttctctgcccctgctgccaggcccccacgcggccgcaggcactcagcaccaacctgcagctggcgcgcctggtggaggggctggcccaggtgccgcagggccactgcgaggagcacctggacccgctgagcatctactgcgagcaggaccgcgcgctggtgtgcggagtgtgcgcctcactcggctcgcaccgcggtcatcgcctcctgcctgccgccgaggcccacgcacgcctcaagacacagctgccacagcagaaactgcagctgcaggaggcatgcatgcgcaaggagaagagtgtggctgtgctggagcatcagctggtggaggtggaggagacagtgcgtcagttccggggggccgtgggggagcagctgggcaagatgcgggtgttcctggctgcactggagggctccttggaccgcgaggcagagcgtgtacggggtgaggcaggggtcgccttgcgccgggagctggggagcctgaactcttacctggagcagctgcggcagatggagaaggtcctggaggaggtggcggacaagccgcagactgagttcctcatgaaatactgcctggtgaccagcaggctgcagaagatcctggcagagtctcccccacccgcccgtctggacatccagctgccaattatctcagatgacttcaaattccaggtgtggaggaagatgttccgggctctgatgccagcgctggaggagctgacctttgacccgagctctgcgcacccgagcctggtggtgtcttcctctggccgccgcgtggagtgctcggagcagaaggcgccgccggccggggaggacccgcgccagttcgacaaggcggtggcggtggtggcgcaccagcagctctccgagggcgagcactactgggaggtggatgttggcgacaagccgcgctgggcgctgggcgtgatcgcggccgaggccccccgccgcgggcgcctgcacgcggtgccctcgcagggcctgtggctgctggggctgcgcgagggcaagatcctggaggcacacgtggaggccaaggagccgcgcgctctgcgcagccccgagaggcggcccacgcgcattggcctttacctgagcttcggcgacggcgtcctctccttctacgatgccagcgacgccgacgcgctcgtgccgctttttgccttccacgagcgcctgcccaggcccgtgtaccccttcttcgacgtgtgctggcacgacaagggcaagaatgcccagccgctgctgctcgtgggtcccgaaggcgccgaggcctga采用信号肽1的mg53优化序列：hindiii–kozak序列—信号肽1---mg53优化密码子序列或天然mg53序列(序列1-5或天然mg53序列)—终止密码子—ecori其中trim-si-n中使用的是mg53的天然序列(见图2)。采用信号肽2的mg53优化序列：hindiii–kozak序列—信号肽2---mg53优化密码子序列或天然mg53序列(序列6-9和5或天然mg53序列)—终止密码子—ecori其中trim-s2-n中使用的是mg53的天然序列(见图3)。根据上述设计的基因序列，委托金斯瑞生物科技公司进行全基因合成。用于真核细胞cho表达的野生型mg53和经优化的mg53密码子的比较可见于图4。1.12用于真核细胞cho表达的经密码子优化的mg53的克隆将合成的用于真核细胞cho表达的经密码子优化的mg53基因连接到对应的克隆载体puc57。使用puc57质粒作为载体进行经密码子优化的mg53和野生型mg53质粒的克隆。puc57质粒大小为4.3kb，图6a中显示了puc57的质粒图谱。由图谱可知，puc57质粒具有ecori和hindiii多克隆位点。puc57质粒购买自金斯瑞生物科技公司。同时将puc57质粒和合成的经优化的mg53序列进行ecori和hindiii双酶切，然后参照上海生工胶回收试剂盒(货号sk8131100bp-10kb)说明书回收酶切后的mg53序列和puc57质粒。胶回收步骤如下：1)从琼脂糖胶中割下5.5kb和1.47kb左右的目的片段，称重约为0.2g；2)加入3倍的bufferb2,50℃水浴5min溶胶；。3)将溶胶液移入吸附柱，8,000×g离心30秒，倒掉收集管中液体；4)加入500ulwashsolution9,000×g离心30秒，倒掉收集管中液体；5)空吸附柱于9,000×g离心1min；6)将吸附柱放于一个灭菌的1.5ml离心管中，加入50ulelutionbuffer,室温静置1min,保存待用。用t4连接酶连接酶切后的经优化的mg53和puc57。之后将连接产物转化感受态细胞xl10-gold。最后，通过测序鉴定构建的用于真核细胞cho表达的经密码子优化的mg53和野生型mg53质粒。具体地，将mg53质粒涂布在氨苄青霉素抗性lb平板后第二天挑选单菌落，摇菌，提取质粒送北京三博远志生物公司进行测序。结果证明得到的质粒是经优化的mg53和野生型mg53质粒。至此完成了经优化的mg53和野生型mg53基因序列的克隆。1.13用于原核细胞大肠杆菌表达的mg53的密码子优化为了更好地在原核细胞如大肠杆菌中表达mg53蛋白，我们对mg53进行了密码子优化。根据大肠杆菌偏爱密码子将mg53进行密码子优化，大肠杆菌密码子使用频率参考codonusagedatabase(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。在不改变氨基酸序列的基础上使用syntheticgenedesigner(http://www.evolvingcode.net/codon/sgd/index.php)，密码子采用最优密码子，然后参考mrna的二级结构进行局部调整，尤其二级结构较为密集的地方，使mrna的自由能尽可能高，从而易于翻译。详细的克隆方案和优化的基因序列如下：ndei----密码子优化序列—xhoimg53天然密码子序列(seqidno:1)：atgtcggctgcgcccggcctcctgcaccaggagctgtcctgcccgctgtgcctgcagctgttcgacgcgcccgtgacagccgagtgcggccacagtttctgccgcgcctgcctaggccgcgtggccggggagccggcggcggatggcaccgttctctgcccctgctgccaggcccccacgcggccgcaggcactcagcaccaacctgcagctggcgcgcctggtggaggggctggcccaggtgccgcagggccactgcgaggagcacctggacccgctgagcatctactgcgagcaggaccgcgcgctggtgtgcggagtgtgcgcctcactcggctcgcaccgcggtcatcgcctcctgcctgccgccgaggcccacgcacgcctcaagacacagctgccacagcagaaactgcagctgcaggaggcatgcatgcgcaaggagaagagtgtggctgtgctggagcatcagctggtggaggtggaggagacagtgcgtcagttccggggggccgtgggggagcagctgggcaagatgcgggtgttcctggctgcactggagggctccttggaccgcgaggcagagcgtgtacggggtgaggcaggggtcgccttgcgccgggagctggggagcctgaactcttacctggagcagctgcggcagatggagaaggtcctggaggaggtggcggacaagccgcagactgagttcctcatgaaatactgcctggtgaccagcaggctgcagaagatcctggcagagtctcccccacccgcccgtctggacatccagctgccaattatctcagatgacttcaaattccaggtgtggaggaagatgttccgggctctgatgccagcgctggaggagctgacctttgacccgagctctgcgcacccgagcctggtggtgtcttcctctggccgccgcgtggagtgctcggagcagaaggcgccgccggccggggaggacccgcgccagttcgacaaggcggtggcggtggtggcgcaccagcagctctccgagggcgagcactactgggaggtggatgttggcgacaagccgcgctgggcgctgggcgtgatcgcggccgaggccccccgccgcgggcgcctgcacgcggtgccctcgcagggcctgtggctgctggggctgcgcgagggcaagatcctggaggcacacgtggaggccaaggagccgcgcgctctgcgcagccccgagaggcggcccacgcgcattggcctttacctgagcttcggcgacggcgtcctctccttctacgatgccagcgacgccgacgcgctcgtgccgctttttgccttccacgagcgcctgcccaggcccgtgtaccccttcttcgacgtgtgctggcacgacaagggcaagaatgcccagccgctgctgctcgtgggtcccgaaggcgccgaggcctga用于原核细胞表达的mg53密码子优化序列(seqidno:26)：atgagcgcagcaccgggtctgctgcatcaagaactgagctgtccgctgtgtctgcagctgtttgatgcaccggttaccgcagaatgtggtcatagcttttgtcgtgcatgtctgggtcgtgttgccggtgaaccggcagcagatggcaccgttctgtgtccgtgttgtcaggcaccgacccgtccgcaggcactgagcaccaatctgcagctggcacgtctggttgaaggtctggcacaggttccgcagggtcattgtgaagaacatctggacccgctgagcatttattgtgaacaggatcgtgcactggtttgtggtgtttgtgcaagcctgggtagccatcgtggtcatcgtctgctgcctgcagccgaagcacatgcacgtctgaaaacccagctgccgcagcagaaactgcagctgcaagaagcatgtatgcgtaaagaaaaaagcgttgcagttctggaacatcagctggttgaagttgaagaaaccgttcgtcagtttcgtggtgcagttggtgaacagctgggtaaaatgcgtgtttttctggcagcactggaaggtagcctggatcgtgaagcagaacgtgttcgtggtgaagccggtgttgcactgcgtcgtgaactgggtagcctgaatagctatctggaacagctgcgtcagatggaaaaagttctggaagaagttgcagataaaccgcagaccgaatttctgatgaaatattgtctggttaccagccgtctgcagaaaattctggcagaaagtccgcctccggcacgtctggatattcagctgccgattattagtgatgattttaaatttcaggtgtggcgcaaaatgtttcgtgcactgatgcctgcactggaagaactgacctttgatccgagcagcgcacatccgagcctggttgttagctctagcggtcgtcgtgttgaatgtagcgaacagaaagcacctccggcaggcgaagatccgcgtcagtttgataaagcagttgcagttgttgcccatcagcagctgagcgaaggtgaacattattgggaagttgatgttggtgataaaccgcgttgggcactgggtgttattgcagcggaagcaccgcgtcgtggtcgtctgcatgcagttccgagccagggtctgtggctgctgggtctgcgtgaaggtaaaattctggaagcccatgttgaagcaaaagaaccgcgtgcactgcgtagtccggaacgtcgtccgacccgtattggtctgtatctgagctttggtgatggtgttctgagcttttatgatgcaagtgatgcagatgcattagtaccgctgtttgcatttcatgaacgtctgcctcgtccggtttatccgttttttgatgtttgctggcatgataaaggcaaaaatgcacagccgctgctgctggttggtccggaaggtgcagaagcataa根据上述mg53密码子优化序列，委托南京金斯瑞生物公司进行用于原核细胞表达的经密码子优化后mg53序列(seqidno:26)_全合成。野生型mg53和经优化的用于原核细胞表达的mg53密码子的比较可见于图5。1.14将用于真核细胞cho表达的经密码子优化的mg53和野生型mg53基因序列连接至真核表达载体pgenht10中pgenht10质粒大小为12.6kb，图6a中显示了pgenht10质粒图谱。由图谱可知，pgenht10具有ecori和hindiii多克隆位点。将具有正确用于真核细胞cho表达的经密码子优化的mg53的质粒以及表达载体pgenht10用ecori和hindiii双酶切。pgenht10载体购买自金斯瑞生物科技公司。之后回收经酶切的mg53序列和pgenht10质粒。用t4连接酶连接经酶切的mg53(包括用于真核细胞cho表达的经优化的mg53和野生型mg53)和pgenht10。同样进行与上述克隆类似的转化和菌落筛选。经过测序分析和处理后筛选得到目的菌落。最后培养目的菌落并进行质粒抽提。抽提的质粒通过ecori和hindiii双酶切验证(图7)，将验证正确的质粒用于细胞转染表达mg53多聚体。1.15将用于原核细胞大肠杆菌bl-21表达的经密码子优化的mg53(seqidno:26)连接至原核表达载体pet-22b质粒中使用pet-22b质粒作为原核表达载体进行经密码子优化的mg53(seqidno:26)质粒的构建。pet-22b质粒大小为5.5kb，图6b中显示了pet-22b质粒图谱。由图谱可知，pet-22b具有ndei和xhoi多克隆位点。pet-22b质粒购买自novagen公司，购买后转化到bl-21感受态细胞中，涂平板(氨苄青霉素抗性)，挑选单克隆，按照天根质粒提取说明书步骤提取质粒。用noti单酶切pet-22b质粒，之后进行0.8％琼脂糖凝胶，验证pet-22b质粒的大小正确，为5.5kb(图8a)。同时将pet-22b质粒和合成的用于原核细胞大肠杆菌bl-21表达的经密码子优化的mg53(seqidno:26)序列进行ndei和xhoi双酶切，然后如上所述回收酶切后的用于原核细胞大肠杆菌bl-21表达的经密码子优化的mg53(seqidno:26)序列和pet-22b质粒(图8)。用t4连接酶连接酶切后的经密码子优化的mg53(seqidno:26)和pet-22b，将连接产物进行转化和菌落筛选，并对筛选到的菌落进行ndei和xhoi双酶切和测序分析，确定是否是经密码子优化的mg53(seqidno:26)序列。将构建好的质粒送北京三博远志生物公司进行测序，结果证明得到的质粒是经密码子优化的mg53(seqidno:26)序列质粒。至此完成了用于在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的经密码子优化的mg53(seqidno:26)的构建。实施例2：经优化的mg53质粒和野生型mg53在真核细胞cho中的表达和纯化以及经密码子优化的mg53(seqidno:26)在原核细胞大肠杆菌bl-21中的表达2.1经密码子优化的mg53(seqidno:26)在原核细胞大肠杆菌bl-21中的表达我们检测了经密码子优化的mg53(seqidno:26)在原核细胞大肠杆菌bl-21中的表达情况。表达时使用的培养基如下：1)摇床培养基(400ml)：lb培养基(胰蛋白胨2％；酵母粉1％；氯化钠2％；100μg/mlamp1％)；2)发酵培养基(5l)：(胰蛋白胨12％；酵母粉24％；甘油4ml/l；磷酸氢二钾16.4％；磷酸二氢钾2.32％；100μg/mlamp1％)。3)补料培养基：50％甘油。补料培养基用于补充发酵后期菌体所需要的碳源和能源。在发酵过程的中后期，在发酵培养基中的碳源和能源消耗完后使用补料培养基补充菌体所需要的碳源和能源。根据以下步骤在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达经密码子优化的mg53(seqidno:26)：1)活化用于原核细胞大肠杆菌bl-21表达的经密码子优化的mg53(seqidno:26)的菌种以0.2％接种量将经密码子优化的mg53(seqidno:26)质粒接种到摇床培养基，在160rpm，36℃过夜培养至od约0.6左右。之后将所得到的菌液接种至发酵罐。2)经密码子优化的mg53(seqidno:26)的表达在发酵罐中以以下条件培养经密码子优化的mg53(seqidno:26)菌液：转速300rpm，培养温度37℃，起始空气流量2l/min，维持溶氧量(do)在20％以上，ph7.0左右。当菌液的od值达到约为6.5左右，降温至28℃；加入0.5mmiptg诱导4h。3)使用sds聚丙烯酰胺凝胶(sdspage)电泳检测mg53蛋白在原核细胞大肠杆菌bl-21中的表达制备sds-page上样的样品：取诱导前菌液，诱导后2h和4h的菌液，并通过离心分离，得到菌体沉淀。用20～40μlpbs(ph＝8.0)重悬，加入等体积的2×sds上样缓冲液，煮沸加热5min；进行sds聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳分离；考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果。结果如图9所示。由sds-page可知，在5l的发酵体积下，mg53蛋白在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达水平较高，在诱导表达后的细菌上清液和细菌细胞(包涵体)中均有很高程度的表达。2.2在原核细胞大肠杆菌bl21中表达的mg53蛋白的纯化由上可知，经密码子优化的mg53(seqidno:26)在大肠杆菌bl-21细菌上清液和细菌细胞中均有很高程度的表达。但无论在上清液和细菌细胞中，除mg53蛋白之外，还存在许多的杂质蛋白。因此，需要对表达的mg53蛋白进行纯化，以用于后续的功能研究。2.21通过deae柱层析纯化在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白首先用deae柱层析纯化在在原核细胞大肠杆菌bl-21中诱导表达后的mg53蛋白细菌上清液。利用geaktapure150m全自动层析系统进行deae柱层析进行初步纯化，以收集在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白。在deae柱层析中使用的试剂和装置：层析柱：体积50ml(预装柱26*20cm)层析缓冲液：结合液a：20mmtris，ph8.0洗脱液b：20mmtris+1.0mnacl，ph8.0通过以下步骤进行deae柱层析纯化：制备样品：取上述诱导表达后的mg53蛋白菌体189g于1900ml结合液a中混匀。每杯加入结合液a370ml、在8℃以10000rpm离心15min，一共离心5次，取上清液制备样品；deae柱层析：样品用0.45um滤膜过滤后上样，上样流速2ml/min。用a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液、洗脱液b洗脱，获得了a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液ph8.0的洗脱峰分别为380ml和190ml；sds-page如上所述对deae柱层析获得的洗脱峰进行聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳，以鉴定deae柱层析后在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白的纯度。如图10所示，通过deae柱层析纯化，去除了大部分的杂质蛋白，得到的在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白能达到80％的纯度。2.22通过cm柱层析纯化在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白为了进一步提高mg53蛋白的纯度，将deae柱层析纯化得到的主要的洗脱峰(ph8.0，a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液洗脱得到的洗脱峰)进行cm柱层析。在cm柱层析中使用的试剂和装置：层析柱：体积25ml(预装柱26*20cm)层析缓冲液：结合液a：20mm磷酸盐缓冲液(pb)，ph6.0洗脱液b：20mm磷酸盐缓冲液(pb)+1.0mnacl，ph6.0通过以下步骤进行cm柱层析纯化：cm柱层析：将在deae柱层析纯化中获得的ph8.0、a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液洗脱峰合并后上样，以8ml/min的流速进行上样和/或洗脱。以a和b的混合物中洗脱液b为10％的溶液冲洗，之后以a和b的混合物中洗脱液b为10％-30％的梯度的溶液洗脱6个柱体积(6cv)共300ml，最后用洗脱液b洗脱。用a和b的混合物中洗脱液b为20％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰a、b的体积分别为42ml和51ml。sds-page如上所述对cm柱层析获得的洗脱峰进行聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳，以鉴定cm柱层析后原核细胞表达的mg53蛋白的纯度。如图11所示，通过cm柱层析进一步纯化，在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白的纯度进一步提高，能达到85％的纯度。将从原核细胞表达的经纯化的mg53蛋白作为mg53标准品，用作真核细胞表达的mg53多聚体的阳性对照。通过deae柱层析和cm柱层析纯化后的在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白可用于制备干粉制剂和/或喷雾制剂和/或凝胶制剂，也可用于制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物组合物，或用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病的药物组合物。2.3经优化的mg53和野生型mg53在中国仓鼠卵巢细胞(cho)细胞中的表达为了表达mg53蛋白，我们在真核细胞例cho中表达构建的经优化的mg53和野生型mg53质粒。2.31所使用的实验耗材15ml离心管(corning，cat#：430790，lot#：13215601)100mm×20mm培养皿(10cmdish)(corning，cat#：430167，lot#：10315601)1ml移液管(corning，cat#：4485,lot#：04415014)5ml移液管(corning，cat#：4487,lot#：31614013)10ml移液管(corning，cat#：4488,lot#：16114013)500ml滤器(corning，cat#：431097,lot#：06315002)125ml摇瓶(corning,cat#：431143,lot#：02115001)6孔板(corning,cat#：3516,lot#：0411560103)电转杯(bio-rad,cat#：165-2088,lot#：14038996)96孔酶标板(corning，cat#：9018，lot#：20512006)国产1.5mlep管(海门市三和建华玻塑仪器厂)国产15mlep管(海门市三和建华玻塑仪器厂)国产50ml尖底离心管(海门市三和建华玻塑仪器厂)2.32实验试剂cdcho(gibco,cat#：10743-029,lot#：1663125)opti-memi(gibco,cat#：31985,lot#：1627186)l-谷氨酰胺200mm溶液(l-glutamine200mmsolution)(hyclone,cat#：sh30034.02,lot#：azm197309)抗凝剂(anti-clumpingagent)(invitrogen,cat#：0010057dglot#：1676315)elisa试剂(cusabio，cat#：csb-el024511hu)bsa(上海泽衡)0.1％pbst：1000mlpbs+1mltween-205×上样缓冲液(5×loadingbuffer)(以下简称r):0.1gsds,0.78gdtt,0.05g溴酚蓝,5.0ml甘油,2.5ml1mol/ltris-hclph6.8，加去离子水定容到10ml5×上样缓冲液(5×loadingbuffer(以下简称n):0.1gsds,0.05g溴酚蓝,5.0ml甘油,2.5ml1mol/ltris-hclph6.8，加去离子水定容到10ml10×mops:104.6gmops,60.6gtris,10gsds,3gedta，加去离子水定容至1l10×pbs:320gnacl,8gkcl,8gkh2po4,61.536gna2hpo4.12h2o,ph7～7.2，加去离子水定容至4l抽滤1×pbs：100ml10×pbs加去离子水定容至1000ml预制胶：4～12％凝胶(genscript,cat#:m41212)page-masterproteinstandard(forsds-page)(genscript,cat#:m00516)easywestern蛋白质标记(easywesternproteinmarker)(genscript，cat#:mm0908)转膜液(transbuffer)：150ml无水乙醇,200ml5×transbuffer，加去离子水定容至1l0.1％pbst：1000ml1×pbs加入1mltween-20山羊抗兔igg(goatantirabbitigg)(h&l)[hrp](多克隆)(genscript，cat#:a00098)ecl蛋白质印迹底物(eclwesternblottingsubstrate)(a、b液)(promega，cat#:w1015)x光常温手显浓缩液(南京蓝格光影系统有限公司，cat#:ig-ⅱ)蓝格ig-1a液变温快速定影液(南京蓝格光影系统有限公司，cat#:ig-1a2.33实验设备离心机(eppendorf,5804r)生物安全柜(thermoscientific,formaclassii,a2)电动助吸器(drummond,easypet3)4℃冰箱(haier,bc-117fc)-20℃冰箱(haier,bd-226w)显微镜(上海光学仪器,37xc)电转仪(drummond,pipet-aid)移液器(eppendorf,20-200μl,100-1000μl)细胞培养摇床(vwr,3500)二氧化碳培养箱(thermo,3111)洗板机(北京拓普,型号：dem-3)酶标仪(moleculardevecies,型号:m2)漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号:vortex-5)电热恒温水槽(上海精宏，型号:dk-420)干浴恒温器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号:gl-1800)转移电泳仪(南达生物技术开发公司，型号:dyy-7b)垂直电泳槽(bio-rad，cat.no.165-8004)小型转印槽(bio-rad，cat.no.170-3930)cdcho(gibco,cat#：10743-029,lot#：1663125)opti-memi(gibco,cat#：31985,lot#：1627186)l-谷氨酰胺200mm溶液(l-glutamine200mmsolution)(hyclone,cat#：sh30034.02,lot#：azm197309)抗凝剂(anti-clumpingagent)(invitrogen,cat#：0010057dglot#：1676315)2.34实验细胞准备细胞解冻在10cm细胞盘(dish)内添加9mlcho培养基(cdcho+6mml-glutamine+anti-clumpingagent(200x))。将冻存细胞从液氮中取出，快速放入37℃水浴进行溶解，将细胞转移到10cm细胞盘中，放入37℃，5％co2的培养箱中培养24小时后，细胞计数：1.22x106细胞/ml，活力96％。细胞培养将细胞悬液转移至15ml离心管进行离心(700rpm，5min)。用新鲜生长培养基opti-memi将细胞重悬到125ml摇瓶内生长。当细胞密度为3.0x105细胞/ml，体积为20ml，将细胞置于37℃，5％co2的培养箱中培养，转速为120rpm。48小时后，按体积30ml，密度3.0x105细胞/ml进行传代，每48小时传代一次。转染前一天细胞扩增至400ml，密度为5.0x105细胞/ml。2.35电转染转染前进行细胞计数，计数结果为1.24x106细胞/ml，活力99.2％。转染需要的细胞总数为1x107细胞，根据计算将8.5ml细胞悬液转移到15ml无菌离心管中，共28管，室温800rmp离心5min。弃上清，用5mlopti-memi培养基重悬清洗细胞一次。室温800rmp离心5min，弃上清。每一组电转染：用0.76mlopti-memi重悬细胞，电转质粒为40μg。将每一组混合物加入到电转杯中，设置电击参数如下：电压:240v，时间30msec，脉冲:指数式衰减(exponentialdecay)。电击结束后，将电转杯放置4℃共5min。进行两组(a组，b组)平行试验，每组14个转染。在此过程中，准备一个10cm细胞盘，添加7ml生长培养基。将电转杯中的细胞转移到10cm细胞盘中，在5％co2，37℃培养箱中培养。转染后第2天吸取2ml细胞悬液到6孔板继续培养，剩余细胞悬液用于建立稳定细胞株的细胞池(cellpool)的筛选。2.36中国仓鼠卵巢细胞(cho)表达评估检测转染后第6天，收集转染的cho细胞上清液，并使用elisa试剂(cusabio，cat#：csb-el024511hu)按照说明书对上清液elisa检测，检测结果如下。表3.经优化的mg53和野生型mg53在cho细胞上清液中的表达trim72s1-n,trim72s1-5分别与trim72s2-n、trim72s2-5信号序列不同，密码子序列一致。从结果中可看出，对于在cho细胞中的表达产量，使用的信号肽2导致的mg53的表达量高于信号肽1。同时在9种密码子中，经优化的序列6导致的mg53的表达量最高。因此，信号肽2为最优信号肽，序列6为最佳密码子优化序列。此外，我们还对转染的cho细胞上清液进行聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳，以检测其中的mg53的表达情况。如图12所示，使用trim72-s2-1获得的mg53的表达产量最高。同时在表达量方面，信号肽2优于信号肽1，优化的序列6为最佳密码子优化序列。2.37mg53在真核细胞cho中的表达状态为了检测mg53在真核细胞cho中的表达状态，我们挑选了高表达的mg53质粒进行了westernblot(蛋白质印迹)的检测。试验流程如下1)处理样品首先将不同质粒转染cho细胞后获得的上清液(样品)振荡混匀，用5×上样缓冲液5×r和5×上样缓冲液5×n分别处理样品，即5×r(n)与样品的体积比＝1:4，按比例振荡混匀,放入95℃度干浴恒温器中加热7min，之后取出放入ep管架冷却待用。阳性对照用1×pbs稀释20倍，即样品与1×pbs的体积比＝1：19。2)点样从4℃中取出预制胶(4～12％)装入电泳槽中，内槽要加满mops缓冲溶液，外槽要与内槽形成液面差。拔掉胶孔上的梳子，通过用20ul～200ul的移液器吹打将胶孔中的储存缓冲液变为mops。将处理后的样品按照顺序加入到胶孔里，蛋白质标记(mark)上样量为1.8μl，阳性对照mg53标准品上样量为3μl，各种样品上样量为30μl。3)电泳设置电泳仪的电压60v，运行50min，之后以70v运行40min，最后以90v运行60min。4)转印首先预先配制转膜液，然后将聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)放入无水乙醇中浸泡30s，再放入转膜液中平衡。用剥胶板取出胶。打开转印夹，以黑面为底面，先放置海绵垫，铺上三层滤纸，用玻璃棒将滤纸中的气泡赶走，再将胶放入滤纸上面。用玻璃棒赶出胶和滤纸间的气泡。从转膜液中取出膜铺到胶上，pvdf膜与胶相接触的地方不能有气泡，否则会影响实验结果。再铺上三层滤纸并赶走滤纸中的气泡；最后放置海绵垫，合拢转印夹。将转印夹放入槽内，接好正负极，放入冰槽，插上电源，设置参数90v转印2h。5)封闭标记转印好的膜的正反面(与胶相接触的一面为正面)。取出膜放入膜盒中，用pbst清洗2次，每次5min。加入预先配好的5％牛奶，室温封闭1h。6)用检测抗体温育封闭结束后用pbst清洗4次，每次5min。用5％牛奶按照1:1000比例稀释检测抗体，在室温下用检测抗体温育膜约10min，之后在4℃中温育过夜。7)用hrp抗体温育从4℃中取出膜，恢复室温，用pbst清洗膜4次，每次5min。之后加入配好的hrp抗体，即山羊抗兔-hrp(goatantirabbit-hrpcat.no.:a00098，使用比例1:5000)室温下温育膜2h。hrp抗体温育结束之后，用pbst清洗膜4次，每次5min。8)曝光配制曝光底物(promegaa：promegab＝1:1)每张膜需要2ml。将清洗后的pvdf膜正面朝上，放置在曝光夹中，擦去多余的pbst。配制好的曝光底物和pvdf膜带入暗房中，用移液器将2ml曝光底物均匀地滴加在pvdf膜上。待曝光底物扩散至整张膜后，擦去多余的曝光底物，盖上塑胶膜后放置感光胶片。依据荧光强弱，选择合适的压片时间。等待合适的压片时间后，将感光胶片放置显影液中，待条带出现，将感光胶片取出放置在定影液中至胶片通透为止。9)实验结果根据图16，申请人发现，非还原状态下在真核细胞cho中表达的mg53主要以多聚体形式存在(主要是二聚体)，在还原状态下(破坏了二硫键的情况下)，mg53主要以单体形式存在。因此，通过在真核细胞cho中表达，我们成功地获得了mg53多聚体。2.4mg53多聚体的纯化如图12所示，通过用mg53基因，例如trim72-s2-1转染真核细胞cho可以在细胞上清液中表达mg53多聚体。然而，在细胞上清液中，除mg53多聚体蛋白之外，还存在许多的杂质蛋白。因此，需要对表达的mg53多聚体蛋白进行纯化，以用于后续的功能研究或用于制备药物组合物。2.41通过q-hp柱层析纯化mg53多聚体首先用通过q-hp离子交换柱初步纯化在真核细胞cho中表达的包含mg53多聚体蛋白的细胞上清液，以去除部分杂质蛋白。利用geaktapure150m全自动层析系统进行q-hp进行初步纯化，以收集mg53多聚体蛋白。在q-hp层析中使用的试剂和装置：层析柱：体积50ml(预装柱26*20cm)层析缓冲液：结合液a：20mmtris，ph8.5洗脱液b：20mmtris+1.0mnacl，ph8.5通过以下步骤进行q-hp柱层析纯化：制备样品：取在真核细胞cho中表达的包含mg53多聚体蛋白的细胞上清液，在8℃以10000rpm离心15min，一共离心5次，取上清液制备样品。q-hp柱层析：用0.45um滤膜过滤样品后上样，上样流速2ml/min。用结合液a和洗脱液b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液、洗脱液b洗脱，获得了组分c和d(对应于泳道4和5)(图14)。c和d中去除了部分杂质蛋白。sds-page对q-hp柱层析获得的洗脱峰进行sds-page电泳，以鉴定q-hp柱层析后m53多聚体蛋白的纯度。如图14所示，通过q-hp柱层析纯化，去除了部分的杂质蛋白。2.42通过monoq柱层析纯化mg53多聚体蛋白为了进一步提高mg53多聚体蛋白的纯度，将q-hp柱层析纯化得到的主要的洗脱峰(ph8.5，a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液，和洗脱液b洗脱得到的洗脱峰)进行monoq柱层析。在monoq柱柱层析中使用的试剂和装置：层析柱：体积25ml(预装柱26*20cm)层析缓冲液：结合液a：20mm磷酸盐缓冲液(pb)(配制时用0.21gnah2po4和6.78gna2hpo4，加去离子水定溶至1000ml，调整ph为7.0)洗脱液b：20mm磷酸盐缓冲液(pb)+1.0mnacl，ph7.0通过以下步骤进行monoq柱层析纯化：monoq柱层析：将在q-hp柱层析纯化中获得的主要的洗脱峰(ph8.5，a和b的混合物中洗脱液b为5％(体积比)的溶液，和洗脱液b洗脱得到的洗脱峰)即c和d合并后上样，以8ml/min的流速进行上样和/或洗脱。首先以a和b的混合物中洗脱液b为10％的溶液冲洗，之后以a和b的混合物中洗脱液b为10％-30％的梯度的溶液洗脱6个柱体积(6cv)，最后用洗脱液b洗脱。用a和b的混合物中洗脱液b为20％(体积比)的溶液洗脱获得了洗脱峰c、d、e。sds-page如上所述对monoq柱层析获得的洗脱峰进行聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳，以鉴定monoq柱层析纯化后mg53多聚体的纯度。如图15所示，通过monoq柱层析进一步纯化，mg53多聚体蛋白的纯度进一步提高，能达到90％以上的纯度。在图15中，c,d,e为还原状态下的mg53多聚体，f,g，h为非还原性状态下的mg53多聚体。在非还原状态下，mg53多聚体分子量主要为110kd和160kd左右。由于天然mg53单体的分子量约为53kd，因此我们获得的mg53多聚体主要以二聚体的形式存在。在还原性状态下的mg53以单体形式存在。由上可知，通过q-hp柱层析和monoq柱层析纯化后的mg53多聚体蛋白能达到90％以上的纯度，可用于制备干粉制剂和/或喷雾制剂和/或凝胶制剂，也可用于制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物组合物，或用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病的药物组合物。2.5mg53蛋白在原核细胞大肠杆菌bl-21和真核细胞cho中表达的比较我们通过非还原性聚丙烯凝胶电泳比较了mg53在原核细胞大肠杆菌bl-21和真核细胞cho中的表达形式。出乎意料地，在原核细胞大肠杆菌bl-21中表达的mg53蛋白以单体形式存在，在真核细胞cho中表达的mg53蛋白以多聚体形式，主要是二聚体的形式存在(图16)。因此，通过在真核细胞cho中表达mg53基因，成功地表达了本申请的mg53多聚体。通过检测物热源物质和生物活性测定，证明本申请的mg53多聚体蛋白符合国家注射用蛋白的质量标准。实施例3.mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的干粉制剂的制备3.1使用甘露醇、组氨酸、蔗糖等制备mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的干粉制剂辅料：甘露醇、组氨酸、蔗糖等。制备方法：溶解辅料，同时将溶解的辅料与按照实施例1-2中的方法获得的mg53单体蛋白原液(通过在大肠杆菌bl-21表达纯化获得)或mg53多聚体蛋白原液(通过在cho中表达纯化获得)混合，调整ph值到6.5，从而得到包含0.5mg/ml的mg53多聚体蛋白、50mg/ml甘露醇、25mg/ml蔗糖、25mg/ml组氨酸的溶液。将得到的溶液过滤除菌，在下述冻干条件下冷冻干燥，即为冻干制剂，按照需要确定分装规格。冻干条件：1)预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2pa,2)90分钟升温至-6℃，保持10个小时，3)1小时升温至15℃，保持5小时，4)进一步干燥，即为冻干制品。3.2使用甘露醇、蔗糖、tween-80等制备mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的干粉制剂此外，我们还使用其他的辅料例如甘露醇、蔗糖、tween-80等得到了稳定性更好的mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的干粉制剂。辅料：甘露醇、蔗糖、tween-80等。制备方法：在200ml2mg/ml的按照实施例1-2中的方法获得的mg53单体蛋白原液(通过在大肠杆菌bl-21表达纯化获得)或mg53多聚体蛋白原液(通过在cho中表达纯化获得)中加入2g蔗糖,6g甘露醇,10mgtween-80，充分混匀后，调整ph值到7.4。经过滤除菌,在下述冷冻干燥条件下冷冻干燥，即为冻干制剂，按照需要确定分装规格。冷冻干燥条件：1)预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2pa,2)90分钟升温至-6℃，保持10个小时，3)1小时升温至15℃，保持5小时，4)进一步干燥，即为冻干制品。3.3不同辅料配方的稳定性比较为比较不同辅料配方对按照实施例3中的方法获得的mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白干粉制剂的复溶性的影响，我们进行了以下实验。仪器设备：冻干试验机、10ml瓶、塞、盖、天平试验过程：制备样品4ml/瓶，8种辅料配方，8瓶样品。分别使用以下各组辅料配方，按照3.2的方法冻干mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白。配方1：仅含蔗糖0.5％20mg配方2：仅含蔗糖1％40mg配方3：仅含甘露醇0.5％20mg配方4：仅含甘露醇1％40mg配方5：仅含甘露醇0.25％10mg配方6：含tween-800.005％0.2mg，蔗糖1％40mg，甘露醇3％120mg配方7：仅含蔗糖1％40mg，但不加样品配方8：仅含甘露醇1％40mg，但不加样品之后，加入生理盐水溶解获得的冻干制剂。经过滤震摇后，配方1-5号均有絮状、针状物质析出，配方6得到澄清的溶液。此实验说明，使用辅料配方6制备的mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白冻干制剂的复溶性和稳定性最优。实施例4.mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的喷雾制剂的制备将按照实施例3中的方法获得的mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的干粉制剂用生理盐水或医学常用溶剂溶解。溶解后的mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白浓度为50ng～100ug/ml，将其装入符合要求的喷雾器中，即可喷雾使用。实施例5.mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的凝胶制剂的制备5.1利用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物制备mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的凝胶制剂利用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(pluronic)的低温呈液态，体温凝聚成胶的特点，将其配制成mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的干粉制剂的凝胶伴侣。通过以下步骤制备mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的凝胶制剂：1)将按照实施例1-2中的方法获得的mg53单体蛋白原液(通过在大肠杆菌bl-21表达纯化获得)或mg53多聚体蛋白原液(通过在cho中表达纯化获得)，依据实施例3的方法制成干粉制剂。2)用低温优选地4-8℃保存的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物溶解所述mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白干粉制剂，配制成mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的凝胶溶剂。使用时，注射器吸出凝胶溶剂涂抹患处，体温作用即形成凝胶覆盖患处，并释放mg53多聚体产生治疗作用。凝胶伴侣与mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白干粉制剂溶解配制方法与上述喷雾制剂中生理盐水溶解干粉制剂的配制方法相同。5.2利用卡波姆、甘油和壳聚糖溶液制备mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的凝胶溶剂之后，我们对凝胶溶剂的配方进行了优化得到了性能更好的mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的凝胶制剂。具体制备方法如下：1)加50g水溶胀0.5g的卡波姆934，用10％naoh调节ph至7.0，2).加入10g甘油，混合均匀，作为凝胶基质；3)用5ml2％的壳聚糖溶液搅拌溶解如实施例3制备的mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的冻干制剂1.83g和尼泊金乙酯0.12g后，将其加入到凝胶基质中，混合均匀，即得到mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的凝胶制剂。实施例6.mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的水针制剂的制备我们还制备了mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的水针制剂。制备时使用的试剂如下：按照实施例3中的获得的mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的干粉制剂为1g注射用水2000ml制成1000支具体制备方法如下：1)在洁净条件下，用适量注射用水全部溶解1gmg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白，2)用少量活性炭处理，过滤，加注射用水至2000ml，调ph值，3)精滤，灌装，封口并灭菌，从而制成规格为2ml：2mg的mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白小容量水针制剂。实施例7.mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白乳剂的制备我们还制备了mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白乳剂。具体制备方法如下：1.取硬脂酸15g、单硬脂酸甘油酯8.5g和白凡士林10g在水浴中加热至80℃混匀，获得油相；2.将3gtween-80、7.5g甘油和90g水分别加热至80℃，获得水相；3.将油相慢慢加入水相中，边加边搅拌搅拌，冷凝，得乳剂基质(ph6.9)；4.用5ml2％的壳聚糖溶液溶解实施例3获得mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白的干粉制剂1.125g(相当于36mg按照实施例1-2中的方法获得的mg53单体蛋白原液(通过在大肠杆菌bl-21表达纯化获得)或mg53多聚体蛋白原液(通过在cho中表达纯化获得))，加入乳剂基质30g，5g甘油并混合均匀，从而得到了mg53单体蛋白或mg53多聚体蛋白乳剂。实施例8.mg53多聚体蛋白对机械损伤的293t细胞的细胞膜的修复作用实验原理：在体外培养的细胞中加入适量玻璃珠，在摇床上摇动，玻璃珠会对细胞的细胞膜造成物理损伤，释放细胞内乳酸脱氢酶(ldh)。mg53可以修复细胞膜。因此可以根据ldh释放水平判断mg53单体和mg53多聚体蛋白对细胞膜的修复功能。实验材料：玻璃珠(400目)；293t细胞；ldh试剂盒(takara-mk401)；dpbs；dmem培养基；胰酶；96孔板；板式离心机；移液枪(100μl，1000μl)；排枪(100μl)；酶标仪；摇床。实验方法1)293t细胞培养30h。2)铺96孔板a.实验组每孔加入30μl含玻璃珠的dpbs和20μl的系列稀释梯度的按照实施例1-2获得的mg53单体或mg53多聚体蛋白溶液，蛋白质系列稀释梯度的浓度为200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.75ug/ml；b.背景组每孔加入30μl的dpbs和20μl的系列稀释梯度的mg53单体或mg53多聚体蛋白溶液，蛋白质系列稀释梯度的浓度为200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.75ug/ml。c.消化293t细胞并计数(密度为1.2-1.5*106细胞/ml)，每孔加入50μl细胞悬液。3)室温下将96孔板置于120rpm的摇床上作用15分钟。4)振摇后立即在4400rpm下离心5分钟。5)离心后将50μl上清液转移至新96孔板中；6)根据ldh试剂盒说明书配置ldh试剂，每孔加入50μlldh试剂。7)室温4400rpm下离心1分钟(去气泡，以免影响读数)。8)避光反应15min，使用酶标仪于490nm下，检测od值。结果如图17所示。这些结果证明，在处于对数生长期的293t细胞中加入不同浓度的mg53单体和mg53多聚体蛋白，mg53多聚体的ldh活性明显高于无明显差异。因此，相比于天然mg53单体，mg53多聚体具有显著增强的对293t细胞的机械损伤的细胞膜的修复作用。实施例9.mg53多聚体蛋白对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用由于很多文献报道了mg53对心脏缺血/再灌损伤具有保护作用，我们对本申请的mg53多聚体在心脏缺血/再灌损伤中的作用进行了研究。1.药物：按照实施例3获得的mg53多聚体，2mg/瓶；按照实施例3获得的mg53单体，2mg/瓶；冻干粉剂，4℃冰箱保存。2.分组与施用动物分为假手术组(ns1ml/只)、模型组。将在不同时间经静脉施用mg53多聚体的动物分为3个亚组，即mg53多聚体蛋白1组(缺血前30分钟施用组)，mg53多聚体蛋白2组(再灌注前30分钟施用组)，mg53多聚体蛋白3组(再灌注后1小时施用组)，每组6只(24小时存活动物数)。模型组2(冠脉结扎前30min给ns1ml/只)。将在不同时间经静脉施用mg53单体的动物分为3个亚组，即mg53单体蛋白1组(缺血前30分钟施用组)，mg53单体蛋白2组(再灌注前30分钟施用组)，mg53单体蛋白3组(再灌注后1小时施用组)，每组6只(24小时存活动物数)。使用的动物：sd大鼠，即spraguedawley)远交群大鼠。sd大鼠是由美国的sprague&dawley农场的r.w.dawley用杂合的雄性大鼠和wistar雌性大鼠杂交后育成的白化封闭群大鼠。3.实验方法通过结扎雄性sd大鼠(220-260g)的冠状动脉左前降支(lad)来制备急性心肌损伤模型，水合氯醛腹腔注射麻醉各大鼠。直肠监测体温并采用热调节的爪垫保持大鼠的体温为37℃。开胸手术后，6-0丝线结扎左冠状动脉45分钟造成心肌缺血，然后打开进行再灌注。关闭胸腔，使大鼠恢复清醒。24小时后，沿上次的切口再次开胸，同样的位置再次结扎左冠状动脉，剪下心脏，进行主动脉插管，1％依文思蓝溶液3ml缓慢注入主动脉，去掉右心房和右心室，将左心室从心尖部冠状切面切成5片，每片厚度为2mm。认为经依文思蓝染色的区域为非缺血区，没有被依文思蓝染色的区域是危险区(aar)。采用数码相机对依文思蓝染色后心肌两面拍照。拍照后将心脏置于1.5％ttc溶液，37℃温育8～10min，对aar中活的心肌细胞区域染色(ttc染色后，梗死区域为灰白色，而活的心肌为红色)。再次采用数码相机对每张心肌切片的两面拍照，使用moticimagesadvanced3.2image软件进行分析。计算梗死区域、aar、非缺血占左心室百分比，评估mg53单体和mg53多聚体蛋白在缺血前30分钟施用、再灌注前15分钟施用、再灌注后1小时施用对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用。缺血前，再灌注后6h、24h收集血清，检测血清中乳酸脱氢酶(ldh)的水平。4.实验结果如下表4所示，模型组梗死区面积(％)与危险区面积(％)基本相近，而mg53多聚体b30min组、l45min组、r60min组梗死区面积(％)明显小于相对应组的危险区面积(％)，其中b30min、l45min组梗死区面积(％)显著低于模型对照组(p<0.01，p<0.05)。表4，mg53多聚体对心肌缺血再灌注损伤的影响注：b30min表示缺血前30分钟施用l45min表示灌注前45分钟施用r60min表示再灌注后60分钟施用由以上实验数据可知，相比于mg53单体，mg53多聚体可以显著地减少心肌缺血梗死区面积，在心肌缺血前施用或再灌前施用能更有效地保护心肌缺血再灌注损伤作用。实施例10.mg53多聚体蛋白不会导致大鼠血糖升高以前的研究发现mg53在保护心脏的同时，会伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。同时，我们还进行了mg53多聚体蛋白静脉注射到sd大鼠中的血糖探索实验，以评估mg53多聚体蛋白导致的血糖升高水平是否达到病理标准。供试品:名称：mg53多聚体蛋白批号：2014-5-16包装：西林瓶规格：2.0mg/瓶性状：按照实施例3制备的mg53多聚体蛋白的干粉制剂保存条件：2～8℃，干燥。对照品名称：牛血清白蛋白批号：201421规格：20.5mg/瓶性状：白色干粉制剂保存条件：-20℃溶剂1名称：氯化钠注射液(生理盐水)生产单位：山东华鲁制药有限公司批号：d13102301浓度：0.9％规格：100ml:0.9g，100ml/瓶性状：无色澄明液体，味微咸。保存条件：密闭保存溶剂2名称：盐酸生产单位：北京化工厂批号：20140311浓度：36％～38％规格：100ml，0.9g，100ml/瓶性状：无色澄明液体保存条件：室温密闭保存牛胰岛素名称：牛胰岛素批号：i5500生产单位：sigma规格：25mg/瓶性状：白色或米色粉末保存条件：-20℃溶液配制及分析mg53多聚体蛋白溶液：按照实施例3制备的mg53多聚体蛋白干粉放至室温，用注射器吸取生理盐水2.0ml直接打入西林瓶中(不要打开瓶塞)，轻轻涡旋混合，以便完全溶解。最终配制浓度为1mg/ml的mg53多聚体蛋白溶液，配制完成后，采用0.22μm的滤膜过滤。牛血清白蛋白溶液对照：将牛血清白蛋白干粉取出后放至室温，用一次性注射器吸取氯化钠注射液适量，直接打入西林瓶中(不要打开瓶塞)。轻轻涡旋混合，以便牛血清白蛋白完全溶解于氯化钠注射液。溶解后用氯化钠注射液稀释至浓度为1mg/ml的牛血清白蛋白溶液，配制完成后，采用0.22μm的滤膜过滤。胰岛素：先用超纯水稀释盐酸至ph＝2～3，用0.22μm的滤膜过滤。再用ph为2～3的无菌稀盐酸将放至室温的胰岛素干粉稀释至2mg/ml。用氯化钠注射液将一部分的2mg/ml的胰岛素溶液稀释至0.01mg/ml(无菌配制)。剩余的2mg/ml的胰岛素溶液保存在-20℃备用。配制溶液保存与处置：mg53多聚体蛋白溶液及牛血清白蛋白溶液对照在施用前于2～8℃或冰盒中保存运输。施用结束后剩余的mg53多聚体蛋白溶液、对照品及胰岛素按照医疗垃圾进行处理。实验系统：实验动物种属&品系：颈静脉插管sd大鼠及正常sd大鼠等级：spf级实验动物来源：北京维通利华实验动物技术有限公司计划施用开始周龄：6～8周龄动物数及性别：预计订购颈静脉插管sd大鼠购入17只，雄性，试验使用15只，雄性。预计订购正常sd大鼠17只，雄性，试验使用15只，雄性。多余动物处理：购买的未使用动物在施用后2天内转交兽医统一处理。选择理由实验动物选择的理由：本试验没有其他已知可以替代活体动物实验的方法；本试验选用sd大鼠，是目前公认的可以作为已用于或拟用于人类的药物进行毒理学研究试验的标准动物模型，其具备有大量的背景数据，并且在研究相同或类似供试品时发现是合适的动物模型。动物数量选择的理由：在满足研究目的、科学标准和法规要求的前提下，使用尽可能少的动物。主要适应症：急性心肌梗塞施用途径：静脉注射临床拟用疗程：单次施用动物分组和施用剂量采用随机分组法，用excel软件对15只颈静脉插管sd大鼠中的每只动物分配一个随机数，按照随机数从小到大的顺序排序，将动物分为2组(1～2组)，每组5只动物。按同样的方法将15只正常sd大鼠随机分为3组(4～6组)，每组5只动物。表5，各组动物施用剂量和分组后的动物号注：*表示1～2组首次施用剂量为12mg/kg，首次施用约24h后，再次施用剂量为6mg/kg。#表示1～2组首次施用容量为12ml/kg，首次施用约24h后，再次施用容量为6ml/kg。施用施用途径：尾静脉注射，按照约2～3ml/min的速度推注。施用剂量及容量：按照上表信息进行施用方法：根据动物施用前体重，确定施用量。使用合适规格的一次性无菌注射器吸取供试品或对照品，在动物尾静脉注射给予相应剂量的供试品或对照品。施用频率及周期：1～3组分2次施用，施用间隔约24h；4～6组单次施用。胰岛素注射：1～3组所有动物末次施用结束10min及4～6组所有动物施用结束10min后，腹腔注射胰岛素，施用浓度为0.01mg/ml，施用剂量为0.037mg/kg，施用容积为3.7ml/kg。施用途径选择理由：根据委托单位提供的信息和相关指导原则，选择尾静脉注射施用，与临床拟用途径接近。体重检测动物：1～6组所有动物检测时间：动物接收后，分组前、首次施用前测定体重。动物施用前称重用于施用量的计算。禁食1～3组所有动物在首次及末次施用前禁食过夜，1～3组动物首次施用后2h内禁食。4～6组动物施用前及采集心脏前禁食过夜。血糖检测检测动物：1～3组所有动物检测时间：0min(首次施用前)、首次施用后15min、30min、1h、2h、8h、24h。测定方法：将试纸插入测量口，确保三个接触条朝向操作者，试纸条要推到底，注意不能弯曲。此时仪器自动打开。按▲或▼按钮来更改血糖仪显示的代码，使其与试纸瓶上的代码相匹配。通过颈静脉插管取血。当显示屏上闪烁血滴符号时，将试纸与血滴对齐，使试纸顶部的狭小通道几乎碰触血滴边缘。通道轻轻碰触血滴边缘后，血液将被吸入狭小通道内。当确认窗口变满，血糖仪的读数从5变为1后，血糖测量结果将会显示在屏幕上。屏幕上还将显示血糖测量单位、测量日期和时间。检测仪器：血糖仪，其厂家及型号为美国强生公司生产的onetouchultraeasy稳豪倍易型血糖仪。检测到的动物血糖数据如表4中所示表6，检测到的动物血糖数据同时，对得到的动物血糖数据进行了分析，结果显示于图18中。表6和图18显示，相对于牛血清白蛋白对照组，在注射mg53多聚体蛋白的动物中的血糖各个时间点均无显著差异。这些数据表明相比于天然mg53单体蛋白，mg53多聚体具有更强的细胞膜修复能力和保护心肌缺血再灌注损伤能力，同时避免了天然mg53导致的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征的副作用。实施例11：mg53多聚体蛋白促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖，有利于糖尿病足溃疡和腿部溃疡愈合目前用于治疗溃疡，尤其是慢性皮肤溃疡的现有药物的效果都不太理想。尽管在一些文献，例如cn103275980a和cn101511181b中提示包含mg53的组合物有可能用于治疗溃疡，但现有技术中未进行mg53治疗溃疡的试验研究。我们研究了mg53多聚体蛋白在溃疡，尤其是慢性溃疡和消化性溃疡中的作用。首先，我们利用了糖尿病足溃疡处成纤维细胞模型研究了mg53多聚体蛋白在治疗糖尿病溃疡中的作用。材料和方法：用含10％的新生小牛血清的rpmi1640培养基将对数生长期的单层糖尿病足溃疡成纤维细胞配制成单细胞悬液。之后以每孔2*105个细胞接种96孔板，每孔体积200ul。实验分5组，其中第一组空白对照组，第二组阴性对照组，第3-5组分别为0.1、1、10μg/ml按照实施例1-2获得的mg53多聚体蛋白，将每组中的物质加入到成纤维细胞中。培养7天，每组设两个重复孔，在490nm测定各孔光吸收值，取平均值；绘制生长曲线。试验结果如图19所示。由这些结果可知，添加mg53多聚体蛋白的成纤维细胞的生长曲线最高，其生长较空白对照组明显增强。由此可知，mg53多聚体蛋白促进糖尿病足溃疡成纤维细胞增殖，有利于糖尿病足溃疡和腿部溃疡愈合。实施例12：mg53多聚体蛋白促进大鼠糖尿病足溃疡处伤口愈合我们利用大鼠糖尿病溃疡模型研究了mg53多聚体蛋白在治疗糖尿病足溃疡中的作用。构建大鼠糖尿病溃疡模型利用磁片循环压迫的方法，构建大鼠糖尿病溃疡模型。首先用2％的戊巴比妥钠以30mg/kg腹腔麻醉大鼠，然后对大鼠进行脱毛，再用碘酒和酒精对脱毛区进行消毒。每只大鼠在手术前肌肉注射8-10iu的青霉素进行预防性治疗，然后在大鼠背部前端做一深至筋膜的切口，置入磁片于大鼠左前肢或右前肢的皮下，第二切口位于背部后端正中线。磁片植入后的大鼠随机分5组，空白对照组，假模型组，按照实施例1-2获得的mg53多聚体蛋白低剂量组、中剂量、高剂量组，按照实施例1-2获得的mg53单体蛋白低剂量组、中剂量、高剂量组。通过外源磁片于内体移植磁片相互吸引，形成压力，造成皮肤表面局部缺血，每次缺血2小时后，再将外源磁片拿下，让局部血流恢复30min，如此进行一个循环。每只大鼠每日进行3个连续循环，连续进行4天。判断溃疡的标准是皮肤变黑、变硬，针刺不出血。施用mg53多聚体蛋白和单体蛋白将按照实施例3获得的mg53多聚体蛋白或mg53单体蛋白干粉制剂伴以凝胶伴侣制剂的形式施用mg53多聚体蛋白或mg53单体蛋白。用注射器混匀mg53多聚体蛋白低剂量组(0.02mg/mlmg53多聚体蛋白)、中剂量(0.1mg/mlmg53多聚体蛋白)、高剂量组(1mg/mlmg53多聚体蛋白)或mg53单体蛋白低剂量组(0.1mg/mlmg53单体蛋白)、中剂量(0.5mg/mlmg53单体蛋白)、高剂量组(5mg/mlmg53单体蛋白)涂于溃疡部位。每天施用一次，疗程1个月，一个月后评价疗效。取溃疡皮肤和对照皮肤，10％甲醛固定，石蜡包埋，he染色，光学显微镜下观察。结果证明，使用不同剂量的mg53多聚体蛋白和mg53单体蛋白，均能导致患糖尿病溃疡大鼠的恢复，有效率100％。所有病例1周之内溃疡明显好转，在施用10天至1月中，溃疡基本痊愈。mg53多聚体蛋白促进糖尿病足溃疡处伤口愈合，并且mg53多聚体蛋白的药效显著优于mg53单体蛋白。这些实验证明相比于天然mg53单体蛋白，mg53多聚体蛋白能更有效地促进糖尿病足溃疡处伤口愈合。实施例13：mg53多聚体蛋白促进大鼠慢性胃溃疡的伤口愈合为了研究mg53多聚体蛋白在治疗其他类型的慢性溃疡中的作用，我们利用大鼠慢性胃溃疡模型研究了mg53多聚体蛋白在治疗慢性胃溃疡中的作用。构建大鼠慢性胃溃疡模型用微量注射器吸取0.05ml20％醋酸溶液，经胃窦前壁透过肌层注射胃粘膜。注射后3-4天，可形成界限清楚的溃疡。溃疡深达肌层，底部分层与人类消化性溃疡相似，从而构建了大鼠慢性胃溃疡模型。慢性胃溃疡模型大鼠随机分8组，空白对照组、假模型组、按照实施例1-2获得的mg53多聚体蛋白低剂量组、中剂量、高剂量组和单体低剂量组、中剂量组、高剂量组。施用mg53多聚体蛋白或mg53单体蛋白将慢性胃溃疡模型大鼠随机分5组，分别为空白对照组，假模型组，mg53多聚体蛋白低剂量组、中剂量和高剂量组，mg53单体蛋白低剂量组、中剂量和高剂量组。使用注射器将低剂量(0.02mg/ml)、中剂量(0.1mg/ml)和高剂量(1mg/ml)的mg53多聚体蛋以及mg53单体蛋白低剂量组(0.1mg/ml)、中剂量(0.5mg/ml)、高剂量组(5mg/ml)灌注到对应组的大鼠胃中。每天灌胃1次，持续2个月。2个月后评价疗效。取各组大鼠的胃粘膜，10％甲醛固定，石蜡包埋，he染色，光学显微镜下观察。结果证明，使用不同剂量(高、中、底剂量)的mg53多聚体蛋白和单体蛋白，均能导致患慢性胃溃疡大鼠的恢复，有效率100％。然而，使用的mg53多聚体蛋白的含量明显低于mg53单体蛋白(是其1/5)，同时药效显著优于mg53单体蛋白。这些实验证明相比于天然mg53单体蛋白，mg53多聚体蛋白能更有效地促进胃溃疡愈合。实施例14：mg53多聚体蛋白促进人糖尿病足部溃疡和坏疽的伤口愈合我们研究了mg53多聚体蛋白在治疗人慢性溃疡，例如糖尿病足部及腿部溃疡中的作用。糖尿病足的诊断标准糖尿病足的诊断标准，按照国际wagner的分级及1995年中华医学会第一届全国糖尿病足学术会制定的分级标准，共分为0-v级。0级：肢端供血不足；i级：皮肤有开放性病灶；ii级：感染病灶已侵犯深部肌肉组织；iii级：肌腱韧带破坏；iv级：骨质缺损；v级：大部分或者全足坏疽，甚至累计踝关节和小腿。患者情况5例患者均为常规换药方法无效和应用表皮生长因子无效或过敏的病例。男性3例，女性2例；年龄最大75岁，最少50岁；糖尿病史最长26年，最短4年，均为2型糖尿病。诊断分级病例：i级3例，ii级1例，iii级1例。施用mg53多聚体蛋白或mg53单体蛋白局部治疗，凡有感染灶、溃烂坏疽者，外科清创去除溃烂坏疽，然后在创面上均匀涂抹0.2mg/ml按照实施例5获得的mg53多聚体凝胶制剂或1mg/ml按照实施例5获得的mg53单体凝胶制剂，也可以按照相同剂量使用干粉制剂(干粉和凝胶制剂的制备方法和使用方法见实施例3、5)，然后无菌纱布覆盖，每天施用一次，疗程一个月，一个月评价疗效。疗效判定标准显效：7-15天溃烂伤口好转及愈合；有效：10-20天伤口好转及愈合；无效：在治疗30天内病情无好转，反而继续加重及恶化或者15天以上局部伤口无变化。结果显示于图20中。这些实验显示，使用mg53多聚体蛋白凝胶制剂后，全部病例足部坏疽情况好转，有效率100％，其中显著有效率95％。并且在使用mg53多聚体蛋白凝胶制剂后，患者未出现明显不良反应，耐受良好。由上可知mg53多聚体蛋白可以有效地治疗糖尿病足部溃疡和坏疽，并且无任何副作用。糖尿病足坏疽的病因复杂，可以由营养不良、动脉粥样硬化和外伤引起。糖尿病血管病变虽然广泛，但病理发展缓慢，有利于与侧支循环的形成，若能在坏疽形成早期进行积极治疗，促进血管和表皮细胞的新生，能有效缓解或者治愈坏疽。目前所使用的局部药物，如庆大霉素，谁让能抑制局部细菌滋生，但是不能很好促进伤口愈合，而且中药生肌作用周期长，效果欠佳。表皮生长因子虽然有一定的效果，但是很多患者使用，临床表现仍然无效。mg53蛋白是人体内自身分泌蛋白，特异存在于骨骼肌和心肌，具有很强的细胞修复功能。mg53多聚体蛋白仅使用mg53单体蛋白剂量的1/5就可以达到和其类似的治疗效果。因此，相比于mg53单体蛋白，mg53多聚体蛋白能更有效地治疗糖尿病足部溃疡和坏疽。参考文献：1.s.matthaei，m.stumvoll，m.kellerer，h.u.haring，endocrrev21，585(dec，2000).2.c.m.taniguchi，b.emanuelli，c.r.kahn，natrevmolcellbiol7，85(feb，2006).3.x.j.sunetal.，nature352，73(jul4，1991).4.a.r.saltiel，c.r.kahn，nature414，799(dec13，2001).5.c.x.caietal.，naturecellbiology11，56(jan，2009).当前第1页12