一种鲁氏不动杆菌及其在降解拟除虫菊酯类农药中的应用的制作方法

本发明涉及一株鲁氏不动杆菌及其在降解拟除虫菊酯类农药中的应用。

背景技术：

氯氰菊酯(Cypermethrin，CY)是拟除虫菊酯类农药中最常用品种之一，其广泛应用于茶树、果蔬、人畜等虫害的防治。由于其具有疏水性强、对光热稳定等特性，因此自然降解速率慢，在环境中半衰期长达94.2d-1103d，易导致其在环境中残留蓄积，因此其在土壤、水体、农畜产品中常出现较高的检出率和超标率。氯氰菊酯对鱼类及其他水生动物有高毒性，其还能在动植物体内蓄积，对神经系统有急性毒性，并能损伤男性生殖系统发育，长期接触还可能引发多种慢性疾病，美国环境保护局已将其认定为一种致癌剂。在我国广泛应用于茶树、果蔬、人畜等虫害的防治，氯氰菊酯类农药的过量使用不仅造成了环境污染，同时由于食物链的传递，在动物性来源食品中也存在严重的残留现象，从而严重危害人体健康，随着人们生活质量的不断提高和环保意识的逐渐增强，该类农药的残留问题已越来越引起人们的关注。如何消除氯氰菊酯类农药对环境的危害，已经成为关系人类健康和国民经济发展的重大科学问题。以微生物降解为基础的生物修复是一种环境友好型污染物去除方法。

拟除虫菊酯类农药作为目前最有发展前景的杀虫剂，在尚未找到新型替代化合物之前，未来几十年内仍将被广泛使用，因而迫切需要研究残留农药的降解。微生物降解是各种农药降解方法中较为绿色和高效的一种。

然而，现有细菌对氯氰菊酯的降解速度慢、降解率低，如，公开号为CN101139559A的专利申请以及肖红利，拟除虫菊酯降解菌株分离及生化分子基础研究，中国优秀硕士论文全文数据库工程科技Ⅰ辑2005/07公开了一种不动杆菌，其在培养基条件下，降解200mg/L的氯氰菊酯时，在48h的降解率仅52.1％，而且最高也仅能达到75％；胡桂萍，氟氯氰菊酯降解菌FLQ-11-1分离鉴定、降解特性及降解机理，中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑2016年第08期中公开了一种细菌，其在作用5天后对100mg/L的甲氰菊酯的降解率也仅90.23％。

急需提供一种可以快速、高效降解拟除虫菊酯类农药的新的菌株。

技术实现要素：

本发明提供了一种新的鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)及其在降解拟除虫菊酯类农药中的应用。

本发明提供了一种鲁氏不动杆菌，它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的保藏号：CGMCC No.13144的鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2。

本发明鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii，于2016年10月24日保藏在于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.13144。

本发明还提供了鲁氏不动杆菌在降解拟除虫菊酯类农药中的用途。

其中，所述鲁氏不动杆菌是保藏号为CGMCC No.13144的鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2。

其中，所述拟除虫菊酯类农药是氰戊菊酯、溴氰菊酯或氟氯氰菊酯。

本发明还提供了一种降解拟除虫菊酯类农药的方法，包括如下步骤：

(1)取鲁氏不动杆菌，复苏制备种子液；

(2)将种子液加入待处理的样品中，混匀，即可。

步骤(1)中，所述鲁氏不动杆菌是保藏号CGMCC No.13144的鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2。

步骤(1)中，所述种子液的浓度不低于10⁶cfu/mL。

优选地，所述种子液的浓度为10⁶～10⁹cfu/mL。

所述种子液的按照如下方法制备：取鲁氏不动杆菌，用LB培养基培养，调整浓度，即可。

本发明鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2，在培养基条件下降解200mg/L的氯氰菊酯，在48h的降解率达到80％，在96h时可达88％，降解效率显著优于现有文献报道的不动杆菌，可以高效、快速降解氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药，用于污染土壤、水体的生物修复或生物净化，保护生态环境，具有极好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明菌株JX-2培养48h的菌落培养特征。

图2为本发明菌株JX-2的细胞形态图。

图3本发明菌株JX-2对氯氰菊酯的降解情况。

具体实施方式

本发明培养基：

Luria-Bertani培养基(LB)：酵母浸膏(Yeast extract)5.0g；胰蛋白胨(Casein tryptone)10g；氯化钠(Sodium chloride)10g；蒸馏水(H₂O)1000mL；调pH至7.0，此固体培养基是在液体培养基中再加20g/L琼脂(Agar)制成的。培养基于121℃，灭菌20min备用。

实施例1本发明鲁氏不动杆菌的分离鉴定

1、分离

取醋赔样品4份，分别拌匀，各取5g，置于装有30mL LB培养基的250mL锥形瓶中，于80℃下加热10min，冷至室温再加入氯氰菊酯使其质量浓度为50mg/L，于30℃、180r/min振荡培养48h。培养结束后按5％接种量再依次进行3次富集培养，每次培养48h，并逐步提高培养基中氯氰菊酯浓度，使之分别达到100mg/L、200mg/L、400mg/L。将最后一级梯度驯化后的培养液按5％(v/v)接种量转接于30mL含100mg/L氯氰菊酯的LB培养基中，并用无菌生理盐水作空白对照，于30℃、180r/min振荡培养120h。

最终从醋醅中富集分离得到一株可以降解氯氰菊酯的菌株，编号为JX-2。

2、鉴定

(1)形态、生理生化特征

形态：挑取菌株JX-2至LB固体培养基平板培养，记录其菌落形态特征，挑取单菌落进行涂片、革兰氏染色，于10×100倍油镜下观察记录颜色、大小、形状、排列等。

生理生化鉴定参见《伯杰细菌鉴定手册》第八版。

菌株JX-2的形态鉴定(如图1、图2所示)：革兰氏染色阴性，杆菌，菌落近圆形，扁平，不透明，微黄色，不反光，表面皱褶，边缘不整齐。

表1菌株JX-2生理生化鉴定结果

(2)16S rDNA鉴定

对菌株16S rDNA基因的PCR扩增，PCR条件：94℃预变性5min；然后94℃、45s，56℃、45s，72℃、90s，循环30次；最后72℃延伸10min；PCR产物经电泳检测，扩增产物由成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，菌株JX-2的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示：

TGGTAGCGTCTCCTTACGGTTAGACTACCTACTTCTGGTGCACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGATCGGCTTTTTGAGATTAGCATCCTCTCGCGAGGTAGCAACCCTTTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCCGGCTTAACCCGCTGGCAAATAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTATGTAAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTTACTATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACTAAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCATACTCTAGCCAACCAGTATCGAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATTTGACTTAATTGGCCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAAATCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCCAAGAGTATTAATCTCGGTAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTACAACCAAAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGGTTCCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTAGCGCAAGGTCCGAAGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTCCCTTTCGGAACGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTAAGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTAGGTCCAGTAGCAAGCTACCTTCCCCGCTCGACTGCAGGT。

测定，测序结果与GenBank数据库中序列进行Blast同源性对比，该菌株序列与Acinetobacter lwoffii菌株基因序列高度同源。

综上，结合形态特征、生理生化特征、16S rDNA鉴定结果，将本发明分离株JX-2鉴定为鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)，并将其命名为鲁氏不动杆菌cinetobacter lwoffii JX-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13144。

实施例2采用本发明鲁氏不动杆菌降解土壤中的氯氰菊酯

取本发明鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏号为CGMCC No.13144，简称菌株JX-2。菌种活化：挑取菌株JX-2至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为10⁶cfu/mL，制成种子液。

将种子液加入待处理土壤中，混匀，即可。

实施例3采用本发明鲁氏不动杆菌降解水中的氯氰菊酯

取本发明鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏号为CGMCC No.13144，简称菌株JX-2。菌种活化：挑取菌株JX-2至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为10⁷cfu/mL，制成种子液。

将种子液加入待处理水中，混匀，即可。

实施例4采用本发明鲁氏不动杆菌降解土壤中的氯氰菊酯

取本发明鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏号为CGMCC No.13144，简称菌株JX-2。菌种活化：挑取菌株JX-2至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为10⁹cfu/mL，制成种子液。

将种子液加入待处理土壤中，混匀，即可。

以下用实验例的方式来证明本发明的有益效果：

实验例1采用本发明鲁氏不动杆菌降解拟除虫菊酯类农药的方法

1材料与仪器

1.1材料

菌种：本发明鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏号为CGMCC No.13144，简称菌株JX-2。

氯氰菊酯：购自中国标准物质中心。

1.2主要仪器

WondaSil C18柱，购自岛津技迩(上海)商贸有限公司。

2试验方法

菌种活化：挑取菌株JX-2至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。

用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为10⁶cfu/mL，制成种子液。

将降解菌株JX-2的种子液按5％接种量接种于含有100mg/L、200mg/L、400mg/L氯氰菊酯的LB液体培养基中,分装30mL/250mL锥形瓶，设接种5％无菌水为空白对照，30℃、180r/min振荡培养，取样时间为0h-96h期间每12h取样1瓶，作为样品进行检测。

样品前处理及检测条件：从锥形瓶中取均匀培养液1mL至刻度试管，用乙腈定容至10mL，混匀后于10000r/min离心10min，取上清液供液相色谱(HPLC)分析用。测定条件：色谱柱为WondaSil C18柱(150mm×4.60mm，5.0μm)；流动相为乙腈:水(85:15，V/V)，流速1.0mL/min；紫外检测器，其波长为210nm；进样量10μL。

3结果与分析

结果如图3和表2所示：

表2菌株JX-2降解LB培养基中的农药

如图3和表2所示，本发明菌株鲁氏不动杆菌JX-2，降解100mg/L的氯氰菊酯时，降解率可达98％；降解200mg/L的氯氰菊酯时，在48h的降解率达到80％，而且在96h时还可达88％；降解400mg/L的氯氰菊酯时，降解率可达67％。

实验结果说明，本发明鲁氏不动杆菌JX-2可以有效降解氯氰菊酯，且降解速度快，降解率高。

实验例2采用本发明鲁氏不动杆菌降解土壤中的拟除虫菊酯类农药

1材料与仪器

1.1材料

菌种：本发明鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2，保藏号为CGMCC No.13144，简称菌株JX-2。

氯氰菊酯：购自中国标准物质中心。

1.2主要仪器

WondaSil C18柱，购自岛津技迩(上海)商贸有限公司。

2试验方法

菌种活化：挑取菌株JX-2至LB液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h；然后连续划线、挑取单菌落培养两次(30℃)，挑取单菌落接种至LB斜面30℃培养2d备用。

用无菌生理盐水洗下斜面上菌体并调整细胞浓度为10⁶cfu/mL，制成种子液。

从四川省某蔬菜基地取土壤样品，添加氯氰菊酯使其质量浓度分别为50mg/L、30mg/L、20mg/L、10mg/L，将降解菌株的种子液按5％接种量接种(实验组)，设接种5％无菌水为空白对照，30℃培养，每24h取样，用实验例1所述方法测定样品中氯氰菊酯的残留量。

通过HPLC检测样品中氯氰菊酯的残留量，空白土壤样品中氯氰菊酯含量变化较小，实验组的土壤样品中氯氰菊酯降解率如表3所示。

表3菌株JX-2降解土壤中的农药

实验结果说明，本发明鲁氏不动杆菌JX-2可以有效降解氯氰菊酯，且降解速度快，降解率高。

综上，本发明分离得到了一株新的鲁氏不动杆菌Acinetobacter lwoffii JX-2，其可以高效、快速降解氯氰菊酯等拟除虫菊酯类农药，对环境修复的作用佳，具有极好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都医学院

<120> 一种鲁氏不动杆菌及其在降解拟除虫菊酯类农药中的应用

<130> GY044-16P1498

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 16S rDNA

<400> 1

tggtagcgtc tccttacggt tagactacct acttctggtg cacaaactcc catggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg cattctgatc cgcgattact 120

agcgattccg acttcatgga gtcgagttgc agactccaat ccggactacg atcggctttt 180

tgagattagc atcctctcgc gaggtagcaa ccctttgtac cgaccattgt agcacgtgtg 240

tagccctggt cgtaagggcc atgatgactt gacgtcgtcc ccgccttcct ccagtttgtc 300

actggcagta tccttaaagt tcccggctta acccgctggc aaataaggaa aagggttgcg 360

ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420

tgtatgtaag ttcccgaagg caccaatcca tctctggaaa gttcttacta tgtcaagacc 480

aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540

ccgtcaattc atttgagttt tagtcttgcg accgtactcc ccaggcggtc tacttatcgc 600

gttagctgcg ccactaaagc ctcaaaggcc ccaacggcta gtagacatcg tttacggcat 660

ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccatgctt tcgcacctca gtgtcagtat 720

taggccagat ggctgccttc gccatcggta ttcctccaga tctctacgca tttcaccgct 780

acacctggaa ttctaccatc ctctcccata ctctagccaa ccagtatcga atgcaattcc 840

caagttaagc tcggggattt cacatttgac ttaattggcc acctacgcgc gctttacgcc 900

cagtaaatcc gattaacgct tgcaccctct gtattaccgc ggctgctggc acagagttag 960

ccggtgctta ttctgcgagt aacgtccact atccaagagt attaatctcg gtagcctcct 1020

cctcgcttaa agtgctttac aaccaaaagg ccttcttcac acacgcggca tggctggatc 1080

agggttcccc ccattgtcca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg 1140

tctcagtccc agtgtggcgg atcatcctct cagacccgct acagatcgtc gccttggtag 1200

gcctttaccc caccaactag ctaatccgac ttaggctcat ctattagcgc aaggtccgaa 1260

gatcccctgc tttctcccgt aggacgtatg cggtattagc gtccctttcg gaacgttgtc 1320

ccccactaat aggcagattc ctaagcatta ctcacccgtc cgccgctagg tccagtagca 1380

agctaccttc cccgctcgac tgcaggt 1407