可高效分解雌激素与多环芳烃的香茅醇假单胞菌及其用途的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株可高效分解雌激素与多环芳烃的香茅醇假单胞菌及其用途。

背景技术：

雌激素作为环境中典型内分泌干扰物质，会以直接或间接的方式在生物体内蓄积与富集；在体内与激素受体结合后，环境雌激素会引起生物的神经系统失调、内分泌紊乱、免疫能力下降和生殖失常等，具有很强的致癌性与致病性，直接威胁着人类社会与生物圈的生存与繁衍，已引起了学术界与社会的广泛关注。雌酮(E1)、17-β-雌二醇(E2)和雌三醇(E3)是由人和动物的卵巢分泌的天然雌激素，可随着动物与人体的排泄物排放进入污水处理厂、土壤、农田等环境中。人工合成雌激素17-α-乙炔基雌二醇(EE2)是低剂量口服避孕药、月经不调治疗药和更年期治疗药的主要成分，亦会被排泄到污水处理厂中。牲畜养殖业排放的雌激素亦会通过堆肥发酵等处理处置后通过施肥进入农田土壤中。多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons PAHs)是类雌激素物质中三致效应最强的一类化合物，来源于煤、石油、木材、烟草及有机高分子化合物等有机物不完全燃烧时产生的挥发性碳氢化合物，是重要的环境和食品污染物。迄今已发现有200多种PAHs，相当部分具有致癌性，如萘、蒽、菲、芘、苯并α芘、苯并α蒽等。随着人类生产活动的加剧和工业生产的发展，环境中的PAHs数量大大增加。如何加快PAHs消除速度，减少PAHs对环境的污染等问题，日益成为研究的重点。

常规活性污水处理系统不能有效去除原水中的雌激素与类雌激素物质，雌酮与17-β-雌二醇虽能得到部分降解，17-α-乙炔基雌二醇却基本不被降解，导致受纳水体及土壤中ng/L水平的雌激素被检出。多个国家污水处理厂出水中的雌激素含量检测显示，雌酮、17β-雌二醇与17α-乙炔雌二醇的平均浓度范围在1-11ng/L。雌激素随着污水处理厂出水排放进入河流中，在环境中累积。研究表明，河流中可检出ng/L级的雌酮、17β-雌二醇与17α-乙炔雌二醇，造成环境的二次污染。研究还发现，ng/L水平的雌酮、17β-雌二醇与17α-乙炔雌二醇可导致雄鱼的雌性化，是引起鱼类雌性化的主要物质。毒理研究表明，不同雌激素物质的雌激素效应大小依次为17α-乙炔雌二醇＞17β-雌二醇＞雌酮。2002-2003年间，日本东京湾近污水处理厂的水域内，发现多条鲻鱼、青麟雄鱼体中存在雌性鱼才会发育的卵细胞；这一鱼类雌性化现象主要是由于长期排入东京湾的污水处理厂的出水中含有的雌激素类物质所致。因此，环境雌激素污染物的污染对于水源水质、城镇供水、公共卫生及生态质量等方面构成的潜在威胁不容忽视。

污水处理厂在阻止雌激素排放到环境中担负着重要的作用。因此，必须探索污水处理厂对雌激素的有效的处理方法。生物降解已成为去除环境雌激素的重要方法之一。通常是利用从环境中分离获得的微生物菌株或菌群，以雌激素类物质为碳源或营养物质，经过复杂的代谢过程，最终将其完全分解为无害的终产物。因而，寻找能够有效降解雌激素的微生物菌株或菌群已成为环境雌激素分解的研究热点之一。近年来，一些可降解雌激素的微生物菌株陆续被发现，如睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosterom)，佐氏红球菌(Rhodococcus zopfii)与马红球菌(Rhodococcus equi)，再育镰刀菌(Fusarium proliferatum)，欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)等。睾丸酮丛毛单胞菌可利用多种激素类物质为单一碳源和能源；欧洲亚硝化单胞菌可高效降解雌二醇，而对17α-乙炔基雌二醇的降解效率略差；鞘氨醇杆菌JCR5在十天内对30mg/L的17α-乙炔基雌二醇的分解率可达87％；此外，香茅假单胞菌SS-2在7天内可对2mg/L雌二醇和雌酮的分解率均达到99％，对4mg/L 17α-乙炔基雌二醇的分解效率为93.6％，但不能降解雌三醇。这些研究显示微生物菌株在降解环境雌激素、修复环境雌激素污染方面具有重要意义。

尽管上述微生物均具有降解雌激素的能力，但其降解效率、降解周期和底物偏好等性质上存在较大差异，在实际应用中单一菌株难于实现对多种雌激素类物质的有效分解。同时，尽管某些微生物在实验室模拟条件下可有效分解雌激素，但由于实际环境的雌激素浓度仅为ng级水平，根本不能支持其生长，因而影响其降解效率。如鞘氨醇单胞菌KC8在ng级的雌激素条件下根本不生长。因此，获得一株可稳定高效地分解多种雌激素类物质的微生物菌株是进行有效的环境雌激素生物降解与环境修复的前提条件。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一株可高效分解雌激素与多环芳烃的香茅醇假单胞菌及其用途。本发明的香茅醇假单胞菌可稳定高效地分解多种雌激素类物质，可有效地用于环境雌激素生物降解与环境修复。

本发明所提供的香茅醇假单胞菌SJTE-3来源于污水处理厂活性污泥中，经过人工富集、筛分及纯化所得。SJTE-3菌落呈圆形，隆起，菌落呈白色，边缘光滑平整湿润，阳光下观察可见荧光，革兰氏染色呈阴性，直或弯的杆菌，单个和成对，无芽孢，37℃下生长良好。经对该菌株的16S rDNA的鉴定与序列分析，表明该菌株为香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)。

本发明中，所述香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)SJTE-3菌株已于2016年6月30日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC No.12720。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明涉及一株香茅醇假单胞菌菌株，所述菌株为香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis)SJTE-3CGMCC No.12720。

本发明的香茅醇假单胞菌菌株可高效分解雌激素与多环芳烃。本发明的香茅醇假单胞菌能以天然雌激素、合成雌激素和多环芳烃为单一碳源生长。

优选的，所述香茅醇假单胞菌的16S rDNA片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及一种上述的香茅醇假单胞菌菌株的获取方法，所述方法包括以下步骤：

S1、采集污水处理厂脱氮除磷工艺系统中的活性污泥作为微生物源；

S2、以雌激素类物质为碳源，制备含有50mg/L雌激素类物质的无机培养基，用盐酸调pH值至7.0-7.2，121℃灭菌20min；

S3、待所述无机培养基温度降低到30～37℃时，按照2-3％的活性污泥接种量进行接种；；

S4、接种后在37℃、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养；

S5、重复培养若干次后，在固体培养基平板上反复划线培养，直至分离出单菌株，之后再将菌株接种入所述无机培养基内驯化；获得香茅醇假单胞菌菌株。

优选的，每1L所述无机培养基的无机成分如下：K₂HPO₄ 0.1g/L、(NH₄)₂HPO₄ 0.1g/L、MgSO₄·7H₂O 0.02g/L、FeCl₃ 0.01g/L、CaCl₂·2H₂O 0.1g/L、NaCl 0.1g/L，余量为水。

优选的，所述雌激素类物质为17-β-雌二醇、雌三醇、17-α-乙炔基雌二醇、菲、蒽中的一种或几种。本发明发现，上述雌激素类物质的单一使用与组合筛选有助于获得对多种雌激素物质有降解效能的雌激素降解菌。特别是当雌激素类物质选用雌二醇或17α-乙炔雌二醇或多环芳烃(菲蒽组合)，能获得高效降解雌酮、17β-雌二醇、雌三醇与17α-乙炔雌二醇及多环芳烃(菲、蒽)的雌激素降解菌SJTE-3。步骤S5中，优选重复培养七次。

本发明还涉及一种上述的香茅醇假单胞菌菌株在修复雌激素类物质污染的环境中的用途。该香茅醇假单胞菌菌株用于环境中雌激素类物质的分解与去除。

优选的，所述雌激素类物质包括雌激素、类雌激素物质中的一种或几种。

优选的，所述雌激素包括雌酮、17-β-雌二醇、雌三醇、17-α-乙炔基雌二醇中的一种或几种。

优选的，所述类雌激素物质为多环芳烃。

优选的，所述多环芳烃为菲或蒽。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明的SJTE-3菌株在雌激素为唯一碳源的培养条件下，在24小时内将1mg/L的17-β-雌二醇完全分解，在48小时内可分解1mg/L的雌酮与雌三醇，144小时后对50mg/L 17-β-雌二醇的降解90％以上；七天内对25mg/L的17-α-乙炔基雌二醇降解率大于85％，对25mg/L的菲的降解率可达到50％以上。17-β-雌二醇的降解过程中有雌酮的生成，该雌酮亦被逐渐降解为无雌激素活性的物质。降解反应符合一级动力学反应定律。

2)依据本发明，由于香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株具有高效降解环境中的天然雌激素雌酮、17β-雌二醇、雌三醇与合成雌激素17α-乙炔雌二醇及多环芳烃物质(菲、蒽)的特性，因此，SJTE-3菌株可应用于含有雌激素及多环芳烃的废污水治理或土壤修复。

3)本发明与现已发现的雌激素降解菌，如鞘氨醇杆菌JCR5和香茅假单胞菌SS-2等相比，其对雌酮、17β-雌二醇、雌三醇与17α-乙炔雌二醇及多环芳烃(菲、蒽)的降解效率显著提高，降解周期明显缩短。如鞘氨醇杆菌JCR5在十天内对30mg/L的17α-乙炔基雌二醇的分解率可达87％；香茅假单胞菌SS-2在7天内可对2mg/L雌二醇和雌酮的分解率均达到99％，对4mg/L 17α-乙炔基雌二醇的分解效率为93.6％，但不能降解雌三醇。两者均不能降解多环芳烃类物质。与两者相比，本发明的SJTE-3菌株在雌激素为唯一碳源的培养条件下，24小时内可将1mg/L的17-β-雌二醇完全分解，在48小时内可分解1mg/L的雌酮与雌三醇；七天内对25mg/L的17-α-乙炔基雌二醇降解率大于85％，对25mg/L的菲的降解率可达到50％以上。降解效率显著提高，降解周期明显缩短。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株的平板划线图；

图2为本发明的香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株以10mg/L雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)、雌三醇(E3)与17α-乙炔雌二醇(EE2)为单一碳源的生长曲线；

图3为本发明的香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株对1mg/L雌酮(E1)、17β-雌二醇(E2)和雌三醇(E3)的降解曲线；

图4为本发明的香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株降解25mg/L 17α-乙炔雌二醇(EE2)的曲线图；

图5为本发明的香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株降解1mg/L(菲、蒽)的曲线图；

图6为本发明的香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株降解17β-雌二醇(E2)过程中生成的雌酮(E1)浓度随时间变化图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例

一、香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株的获取与保藏

采集污水处理厂脱氮除磷工艺系统中的活性污泥作为微生物源，冷藏运回实验室。制备含有50mg/L雌激素类物质(17-β-雌二醇、雌三醇、17-α-乙炔基雌二醇、菲、蒽中的一种或几种)为唯一碳源的无机培养基，按照2％的活性污泥接种量接种于含有100mL上述无机培养基的500mL三角瓶中。培养基中所含无机成分为：K₂HPO₄，0.1g/L；(NH₄)₂HPO₄，0.1g/L；MgSO₄·7H₂O，0.02g/L；FeCl₃，0.01g/L；CaCl₂·2H₂O，0.1g/L；NaCl，0.1g/L；蒸馏水定容到1000mL。盐酸调pH值为7.0-7.2，高压灭菌锅121℃灭菌20min。待培养基温度降低到37℃左右时，在超净台下接种。污泥接种后在37℃、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养。重复培养七次后，在固体培养基平板(琼脂20.0g/L)上反复划线培养，直至分离出单菌株。之后再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的可降解雌酮、17β-雌二醇、雌三醇与17α-乙炔雌二醇、菲及蒽的SJTE-3菌株，平板划线图如图1所示。该菌落呈圆形，隆起，菌落呈淡黄色，边缘光滑平整湿润，阳光下观察可见荧光，37℃下生长良好。纯化后菌株加甘油后于-80℃冷冻保藏。本发明的SJTE-3菌株已于2016年6月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCC No.12720。

二、香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株的鉴定

将分离出的SJTE-3菌株进行16S rDNA序列的扩增、序列测定与数据库比对。利用基因组提取试剂盒(TIANGEN，北京)提取SJTE-3菌株的基因组DNA，之后，利用16S rDNA片段扩增与检测试剂盒(Takara，大连)扩增该菌株的16S rDNA片段并测定序列。SJTE-3菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。与NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，表明该SJTE-3菌株为香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis，菌株为无芽孢杆菌，单个和成对，属革兰氏阴性菌，严格好氧，化能异养。

三、香茅醇假单胞菌Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株对雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔雌二醇、菲和蒽的降解能力

将Pseudomonas citronellolis SJTE-3菌株划固体培养基平板，37℃过夜培养。挑取单克隆，分别接种于以1mg/L雌酮、17β-雌二醇、雌三醇与17α-乙炔雌二醇为唯一碳源的液体培养基中，37℃，150rpm恒温振荡培养箱中培养7天。采集不同时间点的2个平行样品，一个样品利用紫外分光光度仪(UV-2100spectrophotometer，Unic)测定600nm吸光度值用以表示微生物生长情况，如图2所示。另一个样品中加入等体积乙腈混匀，以0.22μm有机系尼龙滤膜(13mm，Millipore)过滤后，采用高效液相色谱(HPLC，Waters 1525)测定残余的雌激素物质的浓度。检测器为UV(DualλAbsorbance Detector，Water 2487)，色谱柱为Nova-Pak C18柱(4μm粒径、3.9mm×150mm I.D.，Waters)，流动相体积比为乙腈∶水＝1∶1，检测波长为280nm，流速为1mL/min。不同雌激素的浓度测定结果如图3、图4和图5所示。在雌激素类物质为唯一碳源的培养条件下，菌株SJTE-3在24小时内将1mg/L的17-β-雌二醇完全分解，在48小时内可分解1mg/L的雌酮与雌三醇，在144小时后对50mg/L 17-β-雌二醇的降解90％以上；七天内对25mg/L的17-α-乙炔基雌二醇降解率大于85％，对25mg/L的菲的降解率可达到50％以上。降解反应符合一级动力学反应定律。

本发明发现SJTE-3菌株可高效降解雌酮、17β-雌二醇、雌三醇、17α-乙炔雌二醇、菲和蒽，且该菌株对17β-雌二醇的分解速度最快。图6表明，在SJTE-3菌株对17β-雌二醇的降解过程中可观察到有雌酮生成，其雌酮亦被逐渐降解为无雌激素活性的物质。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 可高效分解雌激素与多环芳烃的香茅醇假单胞菌及其用途

<130> DAG27622

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1461

<212> DNA

<213> 香茅醇假单胞菌(Pseudomonas citronellolis) SJTE-3

<400> 1

tagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcagg cctaacacat gcaagtcgag 60

cggatgaagg gagcttgctc ccggattcag cggcggacgg gtgagtaatg cctaggaatc 120

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