一种抗呼吸道合胞病毒的全人源抗体的制作方法

本发明涉及抗呼吸道合胞病毒抗体或其抗原结合片段，特别是全人源的抗呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体。

背景技术：

人源化抗体可以通过用人源抗体的相应部分，取代小鼠抗体对抗原特异性不重要的区域而制备得到。由此得到的重组抗体由于其含有残余的鼠类序列，因此在将其给予病人时，往往会在病人中引发免疫应答反应(人抗鼠反应)。因此，希望制备出不含非人类序列的全人源抗体。人源化抗体已经有过报道，例如利用噬菌体展示技术构建和筛选人源抗体文库，以获得人源化抗体，或者将来自免疫人类供体的淋巴细胞植入重度联合免疫缺陷小鼠(SCID)，以获得人源化抗体，或者利用基因工程技术构建表达人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠，以获得人源化抗体。针对致病抗原的完全人源化抗体，也可以通过对脐带血的大量筛选，将包含IgM天然全组分的脐带血进行分离而得到(例如，参见美国专利No.6,391,635)。然而上述这些方法，或者得到的是亲和力低的抗体，或者需要依赖具有特定免疫应答的人类供体。

呼吸道合胞病毒(RSV，简称合胞病毒，也属副粘病毒科)是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原，可引起间质性肺炎，及毛细支气管炎。在北京，48％的病毒性肺炎和58％的毛细支气管炎系由合胞病毒引起(1980～1984)；在广州，小儿肺炎及毛细支气管炎的31.4％由合胞病毒引起(1973～1986)；在美国，20％～25％的婴幼儿肺炎和50％～75％的毛细支气管炎由合胞病毒引起。

RSV感染的潜伏期为2～8天(多为4～6天)。合胞病毒肺炎的典型所见是单核细胞的间质浸润。主要表现为肺泡间隔增宽和以单核细胞为主的间质渗出，其中包括淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞。此外肺泡腔充满水肿液，并可见肺透明膜形成。在一些病例，亦可见细支气管壁的淋巴细胞浸润。在肺实质出现伴有坏死区的水肿，导致肺泡填塞、实变和萎陷。少数病例在肺泡腔内可见多核融合细胞，形态与麻疹巨细胞相仿，但找不到核内包涵体。

RSV有两个主要的表面糖蛋白，F和G。两个糖蛋白(90KDa和68KDa)暴露于病毒粒子表面。90KDa的高度糖基化的G蛋白负责将病毒颗粒结合到靶细胞上。68KDa的F蛋白介导病毒被膜与细胞融合和合胞体形成。所述的F和G表面糖蛋白为主要的保护性抗原，核蛋白N和被膜蛋白M2具有较小的保护性活性。抗G糖蛋白的单克隆抗体比抗F糖蛋白的单克隆抗体不太可能中和病毒，且不具有抑制融合活性。F糖蛋白的氨基酸序列在与人感染有关的RSV亚组间有大约90％的保守性。

目前唯一上市的抗RSV单克隆抗体只批准用于预防早产儿感染RSV，是抗F蛋白的抗体，该抗体的名称是帕利珠单抗Synagis(MedImmune制造)，是一种人源化的鼠单克隆抗体，该药通过呼吸道合胞病毒融合蛋白阻止病毒向下呼吸道扩散。

技术实现要素：

本发明的目的是提供抗RSV抗体或其抗原结合片段，优选为全人源抗RSV单克隆抗体或其抗原结合片段。

根据本发明的一个方面，涉及抗RSV抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：

至少一个重链CDR，其具有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列；和/或

至少一个轻链CDR，其具有选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

进一步地，对于所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：

选自具有如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的三个重链CDR；和/或

选自具有如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的三个轻链CDR。

优选地，对于所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链可变区和/或具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的轻链可变区，所述抗体是全人源抗RSV单克隆抗体R66。

任选地，本发明所述的抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab)₂、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段。

根据本发明的另一个方面，涉及全人源抗RSV单克隆抗体R66。单克隆抗体R66的重链、轻链(KAPPA)的核酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，其相应的重链、轻链(KAPPA)的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

本发明还涉及通过对上述R66抗体的重链和/或轻链氨基酸序列的插入、取代和/或缺失形成的并具有相同功能的抗体。

本发明还涉及上述R66抗体的抗原结合片段，特别是选自Fab、Fab'、F(ab)₂、单链Fv(scFv)、Fv、dsFv、双抗体、Fd和Fd'片段的抗原结合片段。

本发明还涉及含有上述抗体(优选为R66)的单个重链和/或单个轻链的单域抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白抗体、抗体/抗体片段-因子融合蛋白或抗体/抗体片段-化学偶联物。

本发明提供编码上述抗体的核酸，其包含：

至少一个编码重链CDR的核苷酸序列，其选自SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9；和/或

至少一个编码轻链CDR的核苷酸序列，其选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15。

优选地，对于本发明所述的核酸，其包含：

如SEQ ID NO：1所示的编码重链可变区的核酸和/或如SEQ ID NO：2所示的编码轻链可变区的核酸。

根据本发明的另一个方面，提供制备抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)的方法，包括如下步骤：

(1)提供表达载体，所述表达载体含有编码本发明的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)的DNA分子，以及与所述DNA分子可操作相连的表达调控序列；

(2)用所述表达载体转化宿主细胞；

(3)在适合所述抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)表达的条件下培养所述宿主细胞；

(4)分离纯化获得所述的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)。

根据本发明的另一个方面，提供包含本发明的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)的核酸序列的载体以及包含所述核酸序列或载体的宿主细胞。

所述载体可以是重组表达载体。

所述宿主细胞可以是293T细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞、549A细胞、3T3细胞、以及许多其他细胞系。

根据本发明的另一个方面，提供本发明的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)、核酸、载体或宿主细胞在制备用于预防或治疗RSV相关疾病的治疗剂中的应用。

根据本发明的另一方面，提供用于治疗RSV相关疾病的药物组合物，药物组合物中包含治疗有效量的本发明的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)、核酸、载体或宿主细胞，和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体或赋形剂是本领域技术人员熟知的，包括生理相容的水性和非水性载体、稳定剂、防腐剂、增溶剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、缓冲液、血清蛋白等。

所述RSV相关疾病选自由病毒性肺炎、间质性肺炎、毛细支气管炎组成的组。

根据本发明的另一方面，涉及本发明的抗RSV抗体(优选为全人源抗RSV单克隆抗体)、核酸、载体或宿主细胞在制备用于检测RSV的检测试剂中的应用。

本发明提供的抗RSV抗体(优选为抗RSV单克隆抗体)优选是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)的抗RSV抗体相比，因物种差异导致的免疫原性大大减少，且特异性好、亲和力高，如果用于临床将大大降低副作用。此外，由于本发明中的抗RSV抗体(优选为单克隆抗体)可以和RSV F抗原特异性结合，在RSV的诊断和检测中也有很好的应用。应用于人时不会产生类似鼠抗体所产生的副作用。

附图说明

图1是R66纯化后的电泳图；

图2是ELISA实验检测单克隆抗体R66与RSV-F(Strain A2)的结合；

图3是ELISA实验检测单克隆抗体R66与RSV-F(Strain RSS-2)的结合。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例1全人源抗RSV抗体R66的制备

1、人工合成R66的重链可变区和轻链可变区

按照序列如SEQ ID NO：1所示的单克隆抗体R66的重链可变区、序列如SEQ ID NO：2所示的单克隆抗体R66的轻链(KAPPA)可变区的核酸序列送GENEWIZ公司人工合成。

将人工合成得到的R66重链可变区、轻链可变区作为模板，分别加入Taq酶和dNTPs，以及引物，进行PCR，得到PCR产物。

2、重组抗体的表达载体的构建

利用快速DNA产物纯化试剂盒(购自康为世纪)回收PCR产物，得到40μl PCR产物待用。

分别对R66的重链可变区、轻链可变区目的片段进行双酶切，双酶切体系为：Nhe Ⅰ/Not Ⅰ各0.5μl、10*FastDigest Green Reaction Buffer 3μl以及PCR产物26μl，37℃恒温5h。

对改造好的表达载体(表达载体为pcDNA3.1-Zeo(+)(Invitrogen公司)，由GENEWIZ公司预先将人抗体重链/轻链的恒定区改造到此表达载体中)进行双酶切，双酶切体系为：Nhe Ⅰ/Not Ⅰ各0.5μl、10*FastDigest Green Reaction Buffer 3μl、载体1μg、用H₂O补齐30μl，37℃恒温30min。然后加入2μl碱性磷酸酶和3.5μl10*buffer(NEB)混匀，37℃恒温水浴2h。

上述目的片段和载体的双酶切体系中所使用的Nhe Ⅰ、Not Ⅰ、10*FastDigest Green Reaction buffer均购自Thermo Scientific。

对将酶切后的R66的重链可变区、轻链可变区目的片段分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并通过紫外仪观察结果。用小刀将目的条带切下放入一个称量好重量的Ep管中，利用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自康为世纪)回收各个目的片段。

将各个目的片段分别和载体进行连接，连接体系为：载体2μl、目的片段15μl、T4DNA Ligase(购自NEB)1μl、缓冲液2μl，混匀后16℃恒温水浴保持2h。

将每个目的片段的所有连接产物加入到E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s后，迅速置于冰浴5min。然后加入800μL培养基，37℃振荡(100r/min)温育1h。将培养菌液10000rpm离心15s，去除800ul上清，重悬沉淀，全部涂布于含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB固体培养基上,正向放入37℃培养箱中培养1h，再倒置培养过夜至菌落清晰。挑取单菌落接种到5ml含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养15h。利用高纯度质粒小提试剂盒(购自康为世纪)提取质粒，获得分别含有R66的重链(RH66)、R66的轻链(RK66)的质粒，并送样测序。

测序结果显示单克隆抗体R66的重链可变区、轻链(KAPPA)可变区的核酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，其相应的重链可变区、轻链(KAPPA)可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

实施例2单克隆抗体R66的表达和纯化

用实施例1中获得的含有R66的重链(RH66)的质粒和含有R66的轻链(RK66)的质粒分别转染293T细胞。先用Opti-MeM(1X)buffer分别稀释质粒和PEI，然后将PEI-Opti-MeM混合物缓慢加入到质粒-Opti-MeM混合物管中，室温静置20分钟后，再将PEI和质粒混合物加入到细胞悬液中。转染时细胞浓度为0.25～0.5×10⁶个细胞/ml，每孔细胞的转染使用2.5μg含有R66重链的质粒+2.5μg含有R66轻链的质粒+10μg PEI。转染结束后在37℃培养48h后收获上清，用ELISA检测上清。

使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE)纯化表达的抗体蛋白。分别收集表达R66的293T细胞培养物上清，10000rpm，4℃离心10min，取上清，将该上清加入到已用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，150mM氯化钠，pH7.4)平衡好的rProtein A Sepharose Fast Flow柱上，用同样的平衡缓冲液洗10个床体积，再用洗脱缓冲液(0.1M Gly-HCl缓冲液，pH2.5)流洗5个床体积，收集前3个床体积，向收集的洗脱液中加入1/10提及的中和液(1M Tris-HCl缓冲液，pH9.0)混匀，加入到Amicon Ultra-15Centrifugal Filters(Merck Millipore)中，5000G、4℃离心20min，浓缩蛋白，再向Amicon Ultra-15Centrifugal Filters中加入上述平衡缓冲液，5000G、4℃离心20min，更换新的平衡缓冲液，重复3次，分别获得浓缩后的R66抗体蛋白，将其分别转到1.5ml离心管中，取样测定蛋白质含量，然后置于4℃保存。

分别取纯化的R66抗体进行电泳，结果如图1所示，其中泳道M是标准蛋白；泳道R66是纯化的R66抗体，有两个明显条带，分别是约50KDa的重链和约22KDa的轻链。

实施例3R66抗体的ELISA检测

所用试剂包括：

PBS(1X)：用PBS(10X)和去离子水配置。

PBST：PBS(1X)加Tween-20至终浓度为0.05％。

封闭液：PBS(1X)+2％BSA+2％新生小牛血清，现用现配。

稀释液：PBST+1％BSA，稀释抗体用。

终止液：将6ml95％-98％的浓硫酸慢慢加入180ml水中，冷却后备用。

一抗：本发明制备得到的R66抗体，稀释成工作浓度为10μg/ml。

二抗：Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG(H+L)(购自Jackson Immuno Research)，取1.5ml的无RNase水完全溶解后，备用。

用PBS(1X)(pH7.4)缓冲液稀释RSV-F(Strain A2)和RSV-F(Strain RSS-2)(购自Sino Biological Inc.)作为包被抗原，使包被抗原溶液的终浓度为2ng/μl，吸取100μl包被抗原溶液加入到96孔板的每孔中，2-8℃包被过夜，用PBST清洗5次，然后每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h，封闭结束后用PBST清洗5次，每次停留1分钟。

用抗体稀释液(PBST+1％BSA)将一抗做10倍稀释：即取7个高压灭菌的1.5ml离心管，每一管加入270μl的抗体稀释液，从工作溶液中取30μl一抗溶液，涡旋震荡混匀后，标记为1:10稀释，从1:10稀释的溶液中取30μl放入下一管中，以此类推，分别为：1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000，1:1000000，1:10000000，分别加到相应的孔中，每孔100μl，做两个平行，并设立两个空白孔用PBST代替一抗，37℃孵育90min，然后用PBST清洗5遍。

用抗体稀释液(PBST+1％BSA)将二抗做5000倍稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h，然后用PBST清洗5遍，加入TMB显色液，100μl/孔，室温孵育15min，孵育结束后加入H₂SO₄终止液终止反应。在酶标仪上读取OD₄₅₀读数。

通过GraphPad Prism软件分析上述ELISA结果，获得R66抗体以及Synagis抗体的EC₅₀值。

结果显示，表达和纯化的R66抗体与RSV-F(Strain A2)和RSV-F(Strain RSS-2)的结合具有剂量依赖性，说明R66抗体与RSV-F(Strain A2)和RSV-F(Strain RSS-2)的结合是特异性的。

从附图2可以看出，R66抗体与RSV-F(Strain A2)结合的EC₅₀值为0.001791μg/mL，均低于Synagis的EC₅₀值(0.004881μg/mL，用Synagis以相同条件进行ELISA并用GraphPad Prism软件分析获得)。从附图3可以看出，R66抗体与RSV-F(Strain RSS-2)结合的EC₅₀值分别为0.001463μg/mL，也低于Synagis的EC₅₀值(0.001878μg/mL，用Synagis以相同条件进行ELISA并用GraphPad Prism软件分析获得)。由此说明，本发明的R66抗体比Synagis具有更高的灵敏度。

实施例4单克隆抗体R66的CDR的测定：测定单克隆抗体R66的重链CDR和轻链CDR

将抗体可变区域序列信息导入IgBLAST程序(version 1.6.1)中与人类可变区域原始序列文库进行对比分析，抗体的可变区域被进一步划分出3个构架区(FRs)和2个互补性决定区(CDRs)。然后将抗体序列导入IMGT High V-Quest系统中使用之前相同的文库进行比对确定出CDR3和FR。所有抗体序列的数字标定都是基于KABAT系统。

结果表明，该单克隆抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10，其对应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9；轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16，其对应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津昊免生物技术有限公司

<120> 一种抗呼吸道合胞病毒的全人源抗体

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gaatacgccg cgtctgtgag aggcagattc accatctcaa gagatgattc cagaagcatc 240

gcctatctac aaatgcacag cctgaaaagt gaggatacag ccgtctattt ctgtcttcga 300

ggatatagtg gctatgattg ggaaggtctt gatgcttttg aagtctgggg ccaagggaca 360

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<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

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gacatccaga tgacccagtc tccatctgcc atgtctgcat ctgtaggaga cagggtcacc 60

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gggaaagtcc ctaagcgcct gatctatgct gtatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240

gaagattctg caacttatta ctgtctacaa cataatagtt tcccgttgac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

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<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

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Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Leu Ile Lys Arg Asn Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Ser Ile

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met His Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr

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Phe Cys Leu Arg Gly Tyr Ser Gly Tyr Asp Trp Glu Gly Leu Asp Ala

100 105 110

Phe Glu Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

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<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ala Met Ser Ala Ser Val Gly

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ser Ser Thr Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Val Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Leu

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<213> 人(Homo sapiens)

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<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

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<400> 11

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