一种能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特异性多肽的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特异性多肽。

背景技术：

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)相关的疾病是影响当今人类健康的一个严峻的世界性疾病，据世界卫生组织估计，全球有20亿的人口感染HBV，而其中有3.5-4亿人转为慢性感染，并且仅我国的慢性感染患者就已经占据了慢性感染总数中的30％左右(1.2亿)，每年有一百万人死于HBV引发的慢性肝炎，肝硬化以及肝癌。在亚洲，乙肝和丙肝感染是肝脏疾病发生的主要原因。

HBV是一种3.2kb大小的DNA病毒，能特异性的侵染肝脏细胞并在其中复制，是慢性乙型肝炎的致病根源。HBV在肝细胞中编码的蛋白包括7个：Core、Pre-core、Pre S1、Pre S2、S、X，Pol。在进化过程中，HBV具备了一套对抗宿主免疫反应的机制，其中最为突出的是频繁的突变，并且能通过补偿突变提高交叉抵抗能力去适应宿主的抗病毒效应，这导致了慢性乙肝的治疗异常的困难。如今，深入研究HBV与宿主之间的作用机制，研发新型小分子药物，是有效治疗慢性乙型肝炎亟待解决的问题，但是现有技术中针对乙型肝炎病毒X蛋白的相关小分子药物鲜有报道。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种能降解的特异性多肽，该特异性肽段能与HBx蛋白在细胞内相互作用从而导致HBx的泛素化降解，为相关小分子药物的研发及生产提供理论依据。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特异性多肽，其包含如SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列或其功能片段、或者所述氨基酸序列及其功能片段的功能变体。

优选的，所述多肽的作用位点位于所述多肽序列的第30个位点的组氨酸。

本发明还提供一种能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特异性多肽在治疗乙型肝炎病毒药物上的应用。

(三)有益效果

本发明提供了一种能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特异性多肽TRIM5g，所述肽段为37个氨基酸，它能与HBX相互作用，从而使得HBX发生降解，且降解效果显著，这为该肽段的发现将为相关小分子药物的研发及生产提供理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：TRIM5g特异性降解HBX蛋白图；

图2：TRIM5g与HBX蛋白相互作用图；

图3：BBOX与HBX的相互作用图；

图4：HBX与BBOXWT、Mut和空载体与HBX的相互作用图；

图5：TRIM5g基因敲除后，HBX在HepG2细胞中表达情况；

图6：组氨酸对HBV复制的抑制情况。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特异性多肽，其包含如SEQ IDNO：1所述的氨基酸序列或其功能片段、或者所述氨基酸序列及其功能片段的功能变体。

所述多肽的作用位点位于所述多肽序列的第30个位点的组氨酸。

本发明还提供一种能降解乙型肝炎病毒X蛋白的特异性多肽在治疗乙型肝炎病毒药物上的应用。

特异性多肽对乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)的降解实验

1、TRIM5g降解蛋白

在293T细胞中转染HBX蛋白，同时转染HBV的其它5个蛋白或4个其它ISG蛋白表达质粒，28小时后，收取细胞裂解，western检测各蛋白的表达情况，实验结果如图1～3。

实验结果：TRIM5g能降解HBX，但不能降解HBV的其它5个蛋白，同样除了TRIM5g，4个其它的ISGs也不能降解HBX(图1)。

在293T细胞中转染HBX和TRIM5g的表达质粒，4小时后，免疫共沉淀检测两个蛋白的相互作用，结果表明，HBX与TRIM5g有明显的很强的相互作用(图2)。

293T细胞转染BBOX和HBX表达质粒，24小时后，免疫共沉淀检测两个蛋白的相互作用，实验结果表明，BBOX能与HBX发生相互作用并导致HBX的降解(图3)。

对照实验：采用基因快速定点突变的方法将如下所氨基酸突变，用293T细胞转染HBX表达质粒，同时转染BBOXWT(野生型)，293T细胞Mut(突变型)以及293T细胞空载体，24小时后，免疫共沉淀检测两个蛋白的相互作用，结果如图4所示。

结果表明H123A阻断了BBOX与HBX的相互作用及HBX的降解，同时在HepG2细胞中H123A也阻断了HBX的降解。

空白对照实验：

用CRISPR的方法将HepG2细胞的TRIM5g基因敲除后，检测BX在TRIM5g基因敲除HepG2细胞中表达情况。

实验结果如图5所示，结果表明在WT和KO的HepG2细胞转染HBX后，HBX在KO细胞中明显升高。

2、组氨酸对抑制HBV的复制的抑制情况

(1)在HepG2WT或TRIM5gKO细胞转染pHBV1.3HBV全基因组表达质粒，共转染TRIM5g，BBOXWT，Mut或空载体对照，72小时后Elisa检测细胞培养上清中的HBeAg以及Q-PCR检测细胞内的HBVDNA，实验结果如图6A。

(2)按上述方法转染pHBV1.3，共转BBOX WT，Mut或空载体对照，72小时后Elisa检测细胞培养上清中的HBeAg以及Q-PCR检测细胞内的HBVDNA，实验结果如图6B，6C。

实验结果：从图6中得到TRIM5g敲除能明显增强HBV在HepG2细胞中的复制，重新转染表达TRIM5g的外援质粒又能抑制HBV的复制，说明TRIM5g在抑制HBV复制过程中发挥重要作用，同时BBOX也能很好的抑制HBV的复制，H123位点的突变是BBOX的抑制功能消失，说明第123位的组氨酸在BBOX抑制HBV复制过程中是必不可少的。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQ ID NO：1：

hcarhgekll lfcqedgkvi cwlcersqeh rghhtfl