一种提高发酵生产丁醇产量的方法与流程

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种提高发酵生产丁醇产量的方法。

背景技术：

丁醇是一种重要的化工原料，广泛用于各种塑料和橡胶制品的制造和丁醛、丁酸、丁胺和乳酸丁酯等化学品的合成。近年来，随着下游产业的发展，市场需求直线上升，2013年我国丁醇的进口量在40万吨左右。丁醇是继燃料乙醇后又一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当，蒸汽压低，与汽油任意比混溶，使用安全性能高，并且不产生SOx及NOx等传统化石燃料所产生的环境污染废弃。另外，丁醇不会腐蚀管道、不易吸水，依靠现有的汽油输送管道及分销渠道便可以实现远程输送，基于以上的优良特性，联合国国际能源署将生物丁醇列为第二代生物燃料。

微生物发酵生产丁醇作为一种重要的生物转化技术极具发展和产业化的潜力。丙酮丁醇发酵主要指丙酮丁醇发酵菌在厌氧条件下将葡萄糖、木糖等作为发酵底物，经过复杂的生物化学过程后，形成以丁醇和丙酮为主要代谢产物的发酵工艺。传统丙酮丁醇发酵存在一系列的制约因素，阻碍着发酵丁醇的产业化，其中丁醇毒性被认为是抑制丙酮丁醇发酵菌生理活动的主要原因，其毒性机制与其疏水性相关，与其他长链脂肪醇一样，这些分子的主要作用可能是破坏细胞膜的磷脂结构，其次，丁醇的毒性还表现在抑制膜对糖和氨基酸的吸收方面。在很多研究报告中，在菌种生长培养基或者发酵培养基中添加适量的微量成分可以有效的提高菌种对丁醇毒性的耐受性，维持发酵菌种的正常生理活动，从而提高溶剂产量。

季冉等在“外加肌醇对嗜鞣管囊酵母发酵的酒精产量及其耐酒精能力的影响”（生物技术通报, 2008, (2): 163-167）一文中报道了在嗜鞣管囊酵母生长和发酵培养基中分别添加0-200mg/L肌醇，嗜鞣管囊酵母的生物量及发酵的酒精产量均有所增加，外加肌醇对嗜鞣管囊酵母生长有轻微的刺激作用，酵母生长最适肌醇浓度为150mg/L。该方法是在生长和发酵培养基中投加肌醇，并且投加量相对较大。

CN102876736A公开了一种添加FeSO₄•7H₂O调控以秸秆为原料发酵生产丙酮、乙醇及丁醇的方法，该方法通过单添加0.1-1g/L的FeSO₄•7H₂O促进发酵，避免了复杂的脱毒工艺，提高了溶剂产量和生产效率，降低了生产成本。

CN103215316A公开了一种添加锌离子调控厌氧发酵生产丁醇的方法，在包括碳源、氮源、无机盐和生长因子的发酵培养基中，添加浓度为0.1mg/L-120mg/L的锌离子调控厌氧发酵生产丁醇，能够存进菌体生长及碳源利用，缩短了发酵周期，提高了丁醇产量及产率。

上述专利中所投加的均是无机盐离子，与菌体细胞相容性不佳，另外，添加后其未改变菌种对丁醇毒性的抵抗能力，耐丁醇毒性不佳。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种提高发酵生产丁醇产量的方法。该方法通过在发酵过程中添加GHK-Cu²⁺、肌醇、水溶性胆固醇等添加剂，提高了丁醇产量和生产速率，缩短了发酵时间。

本发明提高发酵生产丁醇产量的方法，包括如下内容：

（1）种子活化：将丁醇发酵菌接入无氧的RCM培养基中活化；

（2）厌氧发酵：制备P2发酵培养基，灭菌除氧后接入步骤（1）活化好的丁醇发酵菌种子液，进行厌氧发酵；

（3）发酵调控：当厌氧发酵进入指数期后，加入适量添加剂，所述添加剂为GHK-Cu²⁺（蓝铜胜肽）、肌醇、水溶性胆固醇中的一种或几种，之后持续厌氧发酵至结束。

本发明步骤（1）所述的丁醇发酵菌为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)或拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），优选采用丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824，购于美国模式菌种收集中心。

本发明步骤（1）所述的RCM培养基配方是本领域常规使用的，具体配方以g/L计为：蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉 3.0，葡萄糖 5.0，可溶性淀粉 1.0，氯化钠5.0，醋酸钠 3.0，L-半胱氨酸盐酸盐 0.5，琼脂 0.5，以纯水配置，115℃灭菌20min。

本发明步骤（1）所述的种子活化是将丁醇发酵菌的芽孢液接入RCM培养基中，于36-38℃下厌氧培养16-20h得到种子液。

本发明步骤（2）所述的P2发酵培养基的配方是本领域技术人员所熟知的。具体配方以g/L计为：总糖60，酵母粉 1.0，CH₃COONH₄ 2.2，KH₂PO₄ 0.5，K₂HPO₄ 0.5，MnSO₄ 0.01，NaCl 0.01，MgSO₄·7H₂O 0.2，FeSO₄ 0.01，对氨基苯甲酸 0.001，维生素B1 0.001，生物素0.01e-3，115℃灭菌20min。所述的糖为丁醇发酵可以利用的各种糖，如可以是五碳糖或六碳糖，例如葡萄糖、木糖等中的一种或多种，优选为葡萄糖。

本发明步骤（1）、（2）中培养基通过先利用厌氧工作站，再添加除氧剂的方式除氧，除氧剂为1g保险粉与0.6g碳酸钠溶于10mL纯水制得。

本发明步骤（2）按照培养基体积比5%-10%接入活化的丁醇发酵菌种子液。厌氧发酵的温度为35-38℃，发酵时间为96-120h。

本发明步骤（3）所述厌氧发酵12-36h后加入添加剂。所述添加剂采用0.22um滤膜过滤后补加，优选首先制备成浓度分别为5g/L，10g/L，1g/L的母液，再稀释50-200倍，然后利用0.22um滤膜过滤后补加。

与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：

在现有P2发酵培养基的基础上，通过加入GHK-Cu²⁺、肌醇、水溶性胆固醇等添加剂的方式，增加了菌种对丁醇毒性的抵抗力，促进了菌体生长及碳源利用，在提高丁醇产量的同时，缩短了发酵时间，提高了丁醇的发酵产率。

附图说明

图1是本发明实施例1-3菌种发酵过程中葡萄糖代谢随时间的变化曲线。

图2 是本发明实施例1-3菌种发酵过程中丁醇产量随时间的变化曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例 1

以丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824为发酵生产丁醇的菌种。

（1）种子活化

制备RCM培养基，以g/L计为：蛋白胨 10，牛肉粉10，酵母粉 3.0，葡萄糖 5.0，可溶性淀粉 1.0，氯化钠5.0，醋酸钠 3.0，L-半胱氨酸盐酸盐 0.5，琼脂 0.5，以纯水配置，115℃灭菌20min。

制备除氧剂：1g保险粉与0.6g碳酸钠溶于10mL纯水制得。对上述RCM培养基进行除氧，得到无氧的RCM培养基。

将ATCC 824菌株的芽孢液接入无氧的RCM培养基中，于37℃下厌氧培养20h，制得活化的种子液。

（2）厌氧发酵

制备发酵培养基：以葡萄糖为碳源制备发酵培养基，以g/L计加入以下物质配制成P2培养基：葡萄糖60，酵母粉 1，CH₃COONH₄ 2.2，KH₂PO₄ 0.5，K₂HPO₄ 0.5，MnSO₄ 0.01，NaCl 0.01，MgSO₄·7H₂O 0.2，FeSO₄ 0.01，对氨基苯甲酸 0.001，维生素B1 0.001，生物素0.01e-3，115℃，灭菌20min。然后采用除氧剂除氧。

对灭菌除氧后的P2发酵培养基，按照10%的接种量接入步骤（1）活化的丁醇发酵菌种子液，37℃下进行厌氧发酵。

（3）发酵调控

当厌氧发酵进行12h后，菌种生长进入指数期，然后添加GHK-Cu²⁺。其中GHK-Cu²⁺首先制备成浓度为5g/L的母液，然后稀释100倍，再利用0.22um滤膜过滤后补加。之后继续厌氧发酵至120h。

利用液相色谱法测定发酵液中葡萄糖及丁醇含量，结果如表1所示。液相色谱条件为：用5mM H₂SO4作为流动相，流速0.6mL/min，使用BioRad Aminex HPX-87离子交换柱(7.8×300mm)，柱温65℃，在45℃使用示差折光检测器进行信号检测。

实施例2

生产工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：采用肌醇代替GHK-Cu²⁺。其中肌醇首先制备成浓度为10g/L的母液，然后稀释100倍，再利用0.22um滤膜过滤后补加。之后继续厌氧发酵至120h。利用液相色谱测定发酵液中葡萄糖及丁醇含量，结果如表1所示。

实施例3

生产工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：采用水溶性胆固醇代替GHK-Cu²⁺。其中水溶性胆固醇首先制备成浓度为1g/L的母液，然后稀释100倍，再利用0.22um滤膜过滤后补加。之后继续厌氧发酵至120h。利用液相色谱测定发酵液中葡萄糖及丁醇含量，结果如表1所示。

实施例4

生产工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：采用木糖代替葡萄糖。其中GHK-Cu²⁺首先制备成浓度为5g/L的母液，然后稀释100倍，再利用0.22um滤膜过滤后补加。之后继续厌氧发酵至120h。利用液相色谱测定发酵液中木糖及丁醇含量，结果如表1所示。

实施例5

生产工艺和操作条件同实施例3，不同之处在于：采用木糖代替葡萄糖。其中水溶性胆固醇首先制备成浓度为1g/L的母液，然后稀释100倍，再利用0.22um滤膜过滤后补加。之后继续厌氧发酵至120h。利用液相色谱测定发酵液中木糖及丁醇含量，结果如表1所示。

实施例6

生产工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于采用拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20代替ATCC 824，该菌株已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9354。利用液相色谱测定发酵液中葡萄糖及丁醇含量，结果如表1所示。

实施例7

生产工艺和操作条件同实施例3，不同之处在于采用拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20代替ATCC 824。利用液相色谱测定发酵液中葡萄糖及丁醇含量，结果如表1所示。

比较例1

生产工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于厌氧发酵过程中不添加GHK-Cu²⁺。利用液相色谱测定发酵液中葡萄糖及丁醇含量，结果如表1所示。

比较例2

生产工艺和操作条件同实施例5，不同之处在于厌氧发酵过程中不添加水溶性胆固醇。利用液相色谱测定发酵液中葡萄糖及丁醇含量，结果如表1所示。

比较例3

生产工艺和操作条件同实施例1，不同之处在于：在厌氧发酵培养基中直接添加GHK-Cu²⁺。利用液相色谱测定发酵液中葡萄糖及丁醇含量，结果如表1所示。

由本发明图1、图2可知，发酵到48h时，发酵体系中葡萄糖消耗及丁醇产量逐渐达到最大值并趋于稳定。因此各实施例和比较例选择发酵至48h进行分析检测及效果比较。

表1 不同实施例和比较例的发酵效果

由表1可知，实施例3、2、1分别添加可溶性胆固醇、肌醇及GHK-Cu²⁺后，发酵48h，与比较例1相比，其糖代谢分别提高了7.38g/L、10.566g/L、13.602g/L，丁醇产量分别提高了2.058g/L、2.424g/L、3.129g/L。