本发明涉及一种原核表达载体构建技术，尤其涉及一种酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体及其构建方法。
背景技术：
酪蛋白激酶Iα属于CKI家族成员，它是一类具有独特理化特性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在从酵母到人类等真核生物中，主要分布在细胞质、细胞膜、细胞核及细胞骨架等部位，并且在有丝分裂期间，还定位于突触小泡、中心体和纺锤体微管。具有组成型活力(即被分离或者原核表达的CKIα都具有活性)。CKIα可磷酸化底物蛋白质中已被磷酸化的位点，也可作为其它蛋白激酶的底物被磷酸化，参与蛋白质的级联磷酸化过程，在信号转导途径中发挥作用，进而参与包括基因表达、细胞增殖及分化、囊泡转运、mRNA加工、有丝分裂纺锤体形成等多种细胞调节过程。近几年来，人们发现CKIα在Wnt和Hh信号转导通路中扮演着举足轻重的角色，而该两条信号通路与干细胞的分化和增殖密切相关。因此对酪蛋白激酶Iα进行重组表达，并将其应用于干细胞定向分化研究意义重大。
原核表达是将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株(一般是大肠杆菌)的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达，最后再通过纯化获得所需的目的蛋白。该项技术是基因工程、细胞工程、蛋白质工程等生物工程中广泛使用的一种分子生物学技术。迄今为止，原核蛋白表达系统是最为成熟可靠的蛋白表达系统，能快速表达纯化各种不同来源蛋白。以其大量制备的重组蛋白可用于药物筛选、结构生物学研究、细胞生物学研究、蛋白质组学研究等的一系列生物医学领域的研究。其优点是表达周期较短，操作简单方便，且所需的成本相对较低。此外，有多种可供选择的表达元件、宿主菌株以及已构建好的表达载体，同时，又可遵循一定的技术方案对其生理学和遗传学特性加以人为的改造。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景和生理生化特性为人们所熟悉，生产技术简便，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前它也是生物技术中应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。
如何利用原核表达系统获得更多更稳定的来源于真核生物的酪蛋白激酶Iα尚未有较成熟的方案。
技术实现要素：
本发明的目的是为克服现有技术的不足，提供一种利用原核表达系统制备大鼠酪蛋白激酶Iα重组蛋白的方法，并提供酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体及其构建方法。
为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体，其包含如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、限制性酶切位点Nde Ⅰ和限制性酶切位点BamH Ⅰ。
优选地，所述原核表达载体为pET-16b。
进一步地，所述SEQ ID No.1编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的重组蛋白。
一种如前所述的酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体的构建方法，其包括以下步骤：
根据GenBank数据库收录的大鼠酪蛋白激酶Iα的核苷酸序列设计扩增CKIα的引物；
获取大鼠细胞的全cDNA；
利用所述扩增CKIα的引物从所述cDNA中的克隆CKIα基因；
将所述克隆获得的CKIα基因与原核表达载体进行连接，获得重组的原核表达载体。
进一步地，所述扩增CKIα的引物引入了5’端的限制性酶切位点Nde Ⅰ和3’端的限制性酶切位点BamH Ⅰ。
优选地，所述扩增CKIα的引物包括如SEQ ID No.3所示的上游序列和如SEQ ID No.4所示的下游序列。
优选地，所述大鼠细胞为大鼠肝脏细胞。
具体地，所述CKIα扩增用的PCR温度条件为：
1)98℃3min；
2)98℃，10s；58.8℃，10s；72℃，1min；35个循环；
3)72℃8min。
进一步地，所述获得的重组的原核表达载体通过以下至少一种方式进行筛选和鉴定：
限制性酶切图谱法；
测定其核苷酸序列；
诱导重组蛋白的表达并进行Western Blotting分析。
与现有技术相比较，本发明具有如下优势：
(1)本发明的原核表达载体序列背景清楚，原核表达的体系成熟，易于实现；
(2)本发明的重组的原核表达载体，引入了限制性酶切位点Nde Ⅰ和限制性酶切位点BamHⅢ，增加了真核蛋白与原核表达载体进行酶连接的可能性，使该重组的原核表达载体能够构建成功；
(3)本发明提供的方法所诱导出的重组蛋白，结构域完整，并且能够保持原有的生物活性，证明本发明提供的方法是可行的。
附图说明
图1为本发明的酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体(转化子)pET-16b-CKIα的克隆筛选和鉴定结果；
图2为本发明的酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体(转化子)pET-16b-CKIα载体结构图谱；
图3为重组CKIα蛋白诱导表达和检测结果(其中0、0.3、0.8分别表示非诱导组，诱导组0.3mM IPTG终浓度，诱导组0.8mM IPTG终浓度；划线处为目的蛋白条带位置)；
图4为酪蛋白激酶Iα的重组蛋白纯化过程中尿素洗涤液电泳图(M表示Marker，1～6分别表示pH8.0的0.5％Triton、1M、2M、4M、8M尿素洗涤液和沉淀)；
图5为酪蛋白激酶Iα的重组蛋白纯化过程中pH8.5的8M尿素洗涤液电泳图(其中M表示Marker，1和2分别表示pH8.5的8M尿素洗涤液和沉淀)；
图6为酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的纯化蛋白电泳图(M：表示Marker，1：流穿；2～8分别表示5、20、50、100、250、500(第一管)和500mM(第三管)咪唑洗脱液；9表示1mg/ml BSA标准品)；
图7为酪蛋白激酶Iα的重组蛋白浓缩后蛋白电泳图(M：表示Marker，1～4分别表示蛋白的5mM、20mM、250mM和500mM咪唑洗脱液浓缩样品，5表示1mg/ml BSA标准品)；
图8为酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的Western blotting检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
本发明的酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体的构建方法，依次进行以下步骤：
(1)引物设计
根据引物设计原则，在线查询美国国家医学图书馆GenBank资源库，按GenBank上CKIα序列(NM_053615)(SEQ ID NO：1)，设计PCR引物，扩增目的基因CKIα，在CKIα的5′端分别添加NdeI，3′端添加BamH Ⅰ位点。
上游引物5′-GGGAATTCCATATGATGGCGAGCTCCAGCGGTA-3′(SEQ ID NO：3)
下游引物5′-CGCGGATCCAAAGCCCGTCGGGGTCTG-3′(SEQ ID NO：4)
(2)大鼠肝细胞cDNA的获取
将新鲜大鼠肝脏组织放入研钵，加入适量液氮，研碎；加入1.0ml Trizol试剂，振荡混匀；室温静置5分钟，每1ml体积加入0.2ml氯仿，室温静止5分钟，4℃离心分层(12000g，15分钟)；将上层水相转入一干净的离心管中，加入等体积异丙醇，室温静置10分钟，4℃离心沉淀RNA(12000g，10分钟)；用75％乙醇洗涤沉淀2次；用无RNA酶的DEPC水溶解沉淀。离心(12000g，10分钟)收集沉淀，加入RNaseH，37℃20min；-20℃保存，作为PCR反应的模板。
(3)CKIα基因的PCR扩增
PCR反应体系为：5×Primer STARTM Buffer(Mg2+Plus)10μl，dNTP Mixture(10μM)4μl，引物-F(10μM)1μl，引物-R(10μM)1μl，模板DNA(PKN-Nell)1μl，Primer STARTM HS DNA Polymera 0.5μl，ddH2O加至50μl；
扩增程序为：1)98℃3min；2)98℃，10s；58.8℃，10s；72℃，1min；35个循环；3)72℃8min。
(4)重组质粒pET-16b-CKIα的构建
1)酶切和连接
酶切反应体系1：10×NEB buffer 4 5μl，pET-16b 4μg，NdeI 1μl，BamHI 1μl，H2O加至50μl，酶切条件为：温度37℃，时间3h；
酶切反应体系2：10×NEB buffer 4 5μl，CKIα4μg，NdeI 1μl，BamHI 1μl，H2O加至50μl，酶切条件为：温度37℃，时间3h；
10×loading buffer终止反应，1％琼脂糖凝胶电泳，对目的片段切胶后用QIAGEN凝胶回收试剂盒进行回收；
连接反应体系：10×T4Ligase buffer 2.5μl，Nell 0.03μg，pET-16b 0.03μl，T4 DNA Ligase 1μl，ddH2O加至25μl。连接条件为：4℃过夜。
2)阳性克隆筛选和鉴定：
冰上溶解感受态细胞Stbl3，把2μl连接反应产物加入到大肠杆菌Stbl3中，冰上孵育30分钟。42℃热击30秒后立即转移到冰上孵育2分钟；加入250μl SOC培养基，在37℃、250RPM的摇床里孵育1小时；把100μl转化物涂布到含有100μg/ml氨苄青霉素(Ampicillin)的LB(培养基)平板上，37℃培养过夜；挑取单克隆摇菌，提取质粒进行鉴定，鉴定结果如图1所示。
进一步挑选pET-16b-CKIα阳性克隆6进行测序，结果显示该基因序列和Genebank公布的序列一致，重组质粒pET-16b-CKIα的构建图谱见图2。
(6)重组CKIα表达的检测
将5ng质粒PET-16b-CKIα转化至100μl感受态细胞BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS涂于LB琼脂平板，37℃培养过夜；转化菌的培养：从转化平板上挑取单一菌落，接种于5ml LB培养液中，37℃，250r/min培养过夜。
诱导表达：设置非诱导组、低浓度诱导组及高浓度诱导组；接种浓度按1:100的比例，分别各取50μl过夜培养物加至装有5ml LB的培养管中，37℃，250r/min，培养约2h，OD600为0.5～1.0；在诱导组管中分别加入IPTG使其终浓度分别为0.3mM、0.8mM，37℃，250r/min，继续培养3h。最后离心(4℃，1200r/min)收集收转化菌体。
CKIα表达量检测：1)总组分样品制备：在收集的菌体中加入重悬液200μl(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl)，用漩涡振荡器重悬菌体，然后冰浴超声破碎约2min(功率350瓦，超声4秒，间隔9秒)，从细胞裂解物中取5μl样品置于0.5ml离心管中以备电泳检测用；取完样后将剩余的细胞裂解物在17000g，4℃离心20min，分别收集沉淀物和上清液；2)沉淀组分样品制备：取沉淀物用重悬液100uL重悬，然后从中取5μl样品置于0.5ml管中以备电泳检测用；3)可溶性组分样品制备：收集上清取10μl置于0.5ml离心管中以备电泳检测用。
电泳检测：将待检测的样品分别用还原样品缓冲液进行处理，8％SDS-PAGE电泳检测。图3结果表明：37℃，CKIα在BL21(DE3)宿主菌中有高表达，目的蛋白以包涵体为主。
(7)重组CKIα的纯化
将表达菌株接种于2L新鲜LB培养基(含有100ug/ml Ap)中，37℃、250rpm振荡培养至OD600约为0.6时，加入0.8mM IPTG，37℃、250rpm诱导4h；离心收集诱导后菌液，用150ml 1×PBS重悬，超声破碎，分别收集上清与沉淀，用0.5％Triton和1M、2M、4M、8M尿素(pH8.0)洗涤包涵体沉淀，分别收集上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳检测。由图4可知，包涵体蛋白不溶于pH 8.0的8M尿素。
将pH8.0的8M尿素分别调至pH7.0、pH7.5、pH8.5和pH9.0，分别取20ml洗涤包涵体沉淀，收集洗涤液进行SDS-PAGE电泳检测。图5结果显示目的蛋白在pH 8.5的8M尿素中有少部分溶出。
然后根据电泳检测结果，将pH8.5的8M尿素洗涤液过Ni柱进行蛋白纯化，分别用5，20，50，100，250，500mM咪唑(pH8.5)进行洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳检测。图6结果表明，5mM和250mM咪唑洗脱液中有较高浓度的目的蛋白；分别将目的蛋白的5mM、20mM、250mM和500mM咪唑洗脱液进行浓缩，电泳检测结果见图7。
(8)重组CKIα Western blotting分析
样品名称分别为CKIα可溶成分、CKIα沉淀蛋白和CKIα去内毒素，上样量均为10ul；按照10％分离胶和5％的浓缩胶配置SDS-PAGE；调整上样量为总蛋白量100ug，加入5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀，95℃水浴5分钟。浓缩胶中80V电泳，分离胶中120V电泳；
1)蛋白质的电转移以及膜的封闭：300mA，湿法转膜70分钟。取出膜，置于5％脱脂牛奶封闭液中，室温封闭1小时；
2)抗原抗体反应：将一抗以适当浓度的比例加入到5％脱脂牛奶封闭液中稀释；将封闭后的PVDF膜放入封闭袋中，加入4ml一抗，室温震荡孵育1小时后；弃去一抗，用1×TBS/T洗膜3次，每次5分钟，以除去过量的一抗；将膜转移至另一新的封闭袋中，加入4ml适当稀释二抗，室温振荡孵育1小时；用1×TBS/T洗膜3次，每次5分钟，以除去未结合的二抗；
3)ECL显色：将ECL A液和B液以1：1(V/V)混合，室温反应1～2分钟。将混合液滴加于PVDF膜表面，孵育1～2分钟。
电泳结果见图8，结果证明已获得重组CKIα。
综上所述，本发明酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体及其构建方法成功利用了原核表达系统，获得了重组CKIα。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>南方医科大学珠江医院
<120>酪蛋白激酶Iα的重组蛋白的原核表达载体及其构建方法
<160>4
<210>1
<211>978
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> 大鼠酪蛋白激酶Iα
<223>嵌合基因
<400>1
atggcgagca gcagcggctc caaggccgaa tttatcgtcg gtgggaaata caaactggtg 60
cggaagatcg gatctggttc cttcggggac atttatctag cgatcaacat caccaatggc 120
gaggaagtgg cagtgaaact agaatcccag aaggccaggc atccccagtt gctgtacgag 180
agcaaactgt ataagattct tcaaggtggg gttggcatcc ctcacatacg gtggtatggg 240
caaggaaaag actataatgt gctagtcatg gatcttctgg gacccagcct cgaagacctc 300
ttcaatttct gttcaagaag gttcactatg aagactgtac ttatgttagc tgaccagatg 360
atcagtagaa ttgaatatgt gcatacaaag aattttatac acagagacat taaaccagat 420
aacttcctaa tgggtattgg gcgtcactgt aataagttat tccttattga ttttggtttg 480
gccaaaaagt acagagacaa caggacaagg caacacatac catacaggga agataaaaac 540
ctcactggca ctgcccggta tgccagcatc aatgcacatc ttggcattga gcagagtcgc 600
cgagatgaca tggaatcttt aggatatgtt ttgatgtatt ttaatagaac cagtctgcca 660
tggcaagggc taaaggctgc aacaaagaaa caaaaatatg aaaagattag tgaaaagaag 720
atgtccactc ctgttgaagt tttgtgtaag gggtttcctg cagaatttgc catgtactta 780
aattactgtc gtgggctgcg ctttgaggaa gctccggatt acatgtatct gaggcagctg 840
ttccgcatcc tcttcaggac cctgaaccac cagtatgact acacgtttga ttggacgatg 900
ttaaagcaga aagcagccca gcaggcagcc tcttccagtg ggcagggtca gcaggcccaa 960
acccccacag gtttctaa 978
<210>2
<211>325
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>大鼠酪蛋白激酶Iα
<223> 重组蛋白
<400>2
Met Ala Ser Ser Ser Gly Ser Lys Ala Glu Phe Ile Val Gly Gly Lys
5 1015
Tyr Lys Leu Val Arg Lys Ile Gly Ser Gly Ser Phe Gly Asp Ile Tyr
202530
Leu Ala Ile Asn Ile Thr Asn Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Leu Glu
354045
Ser Gln Lys Ala Arg His Pro Gln Leu Leu Tyr Glu Ser Lys Leu Tyr
505560
Lys Ile Leu Gln Gly Gly Val Gly Ile Pro His Ile Arg Trp Tyr Gly
65707580
Gln Gly Lys Asp Tyr Asn Val Leu Val Met Asp Leu Leu Gly Pro Ser
859095
Leu Glu Asp Leu Phe Asn Phe Cys Ser Arg Arg Phe Thr Met Lys Thr
100 105 110
Val Leu Met Leu Ala Asp Gln Met Ile Ser Arg Ile Glu Tyr Val His
115 120 125
Thr Lys Asn Phe Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Asp Asn Phe Leu Met
130 135 140
Gly Ile Gly Arg His Cys Asn Lys Leu Phe Leu Ile Asp Phe Gly Leu
145 150 155 160
Ala Lys Lys Tyr Arg Asp Asn Arg Thr Arg Gln His Ile Pro Tyr Arg
165 170 175
Glu Asp Lys Asn Leu Thr Gly Thr Ala Arg Tyr Ala Ser Ile Asn Ala
180 185 190
His Leu Gly Ile Glu Gln Ser Arg Arg Asp Asp Met Glu Ser Leu Gly
195 200 205
Tyr Val Leu Met Tyr Phe Asn Arg Thr Ser Leu Pro Trp Gln Gly Leu
210 215 220
Lys Ala Ala Thr Lys Lys Gln Lys Tyr Glu Lys Ile Ser Glu Lys Lys
225 230 235 240
Met Ser Thr Pro Val Glu Val Leu Cys Lys Gly Phe Pro Ala Glu Phe
245 250 255
Ala Met Tyr Leu Asn Tyr Cys Arg Gly Leu Arg Phe Glu Glu Ala Pro
260 265 270
Asp Tyr Met Tyr Leu Arg Gln Leu Phe Arg Ile Leu Phe Arg Thr Leu
275 280 285
Asn His Gln Tyr Asp Tyr Thr Phe Asp Trp Thr Met Leu Lys Gln Lys
290 295 300
Ala Ala Gln Gln Ala Ala Ser Ser Ser Gly Gln Gly Gln Gln Ala Gln
305 310 315 320
Thr Pro Thr Gly Phe
325
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> 引物-F
<223>上游引物
<400>3
gggaattcca tatgatggcg agctccagcg gta33
<210>4
<211> 27
<212> DNA
<213>人工合成
<220>引物-R
<223> 下游引物
<400> 4
cgcggatcca aagcccgtcg gggtctg 27