一种原核融合表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种原核融合表达载体，其含有下述核苷酸片段，该核苷酸片段由启动子、编码PDI伴体蛋白的基因、连接区串联构成，其中所述的连接区含有肠激酶切割位点和多克隆位点。该发明构建载体能以融合蛋白的形式高效表达外源基因，表达产物可溶性好，纯化简易，且具有外源蛋白的天然生物活性。此表达载体不仅适用于重组蛋白的大量生产，也适用于基因工程产品及生物制剂的研究及生产，同时也可用于对蛋白功能与构象关系的研究。
【专利说明】一种原核融合表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种原核融合表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002]常规的基因工程的表达系统有原核表达系统和真核表达系统两大类。外源基因在原核细胞中的表达是令克隆的外源基因在原核细胞中以发酵的方式快速、高效地合成外源基因表达产物。原核表达系统是目前了解最深入、实际应用最广泛的表达系统。
[0003]在原核细胞中表达外源基因时，由于实验设计的不同，总的来说可产生融合型和非融合型重组蛋白。当以非融合方式(即所得重组蛋白的氨基酸序列与目的产物一致)表达外源基因时，为了避免表达产物被细菌蛋白酶降解，表达产物通常以不溶的包涵体形式存在。因为包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变复性处理。蛋白的复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高。这是限制其应用的主要制约因素。采用分泌表达方式可部分克服这一问题，但表达量却偏低，实际应用也有较大难度。另外，当表达一些分子量较小、二硫键较多的蛋白时，非融合表达系统很难得到有生物学活性的蛋白。非融合表达的另一个不利因素就是表达量差异很大。用相同表达载体表达不同的外源蛋白时，表达量可能有10倍的差异。大量的研究表明，翻译起始序列(TIR)二级结构或高级结构是影响基因表达的关键因素之一(Thanaraj TA, Pandit MW.NucleicAcids Res, 1989; 17 (8):2973)。一些外源基因只有通过优化TIR的二级结构才能达到高效表达(Calvez HL etal.Gene, 1996; 170:51)。这无疑加大了实验的难度和工作量。为了克服这些困难，融合蛋白表达系统应运而生。即利用一些特定的融合伴体使之与外源蛋白融合，在原核细胞中表达融合蛋白。这些融合伴体包括GST，TRX，lacZ，trpE，DsBA等(Smithetal, Gene, 1988,67:31-40)。融合表达系统都采用了优化的TIR，在表达量方面高效稳定。由于采用的融合伴体多为 来自细菌的分子伴侣，既可以保护外源蛋白免受细菌蛋白酶的降解，又能协助外源蛋白的正确折叠。因此，表达的融合蛋白的溶解性好，外源蛋白的构象更接近于天然蛋白，对于保证其生物学活性具有极为重要的作用，非常适合于基因的功能研究和重组蛋白的大量生产。当然，如想获得外源蛋白单体，就必须将融合伴体切除。切除融合伴体可采用酶解和化学裂解法。酶解可供选择的酶有凝血酶，蛋白酶3C，胰蛋白酶，Xa因子等；化学裂解常采用澳化氰裂解。
[0004]融合表达系统优势明显，但也有待完善的地方。如在纯化方面，需要有针对融合蛋白的简易高效的纯化措施；在融合伴体的选择方面，需要有能更好地协助目的蛋白折叠的分子伴侣；在切割融合伴体的方法上，需要有更高效、切割条件温和、低成本的切割试剂。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种新型高效的原核融合表达载体，用于高效地表达外源基因，使表达产物可溶性好、纯化简易，且具有外源蛋白的天然生物活性。[0006]为此，本发明提供了一种原核融合表达载体，其含有下述核苷酸片段，该核苷酸片段由启动子、编码PDI伴体蛋白的基因、连接区(包括2A区、肠激酶切割位点和多克隆位点)串联构成，其中所述的连接区含有肠激酶切割位点和多克隆位点。
[0007]根据本发明提供的表达载体，所述的核苷酸片段的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]根据本发明提供的表达载体，其采用质粒pPDI构建。
[0009]本发明还提供了所述表达载体在基因工程蛋白重组表达中的应用。
[0010]本发明还提供了上述表达载体的构建方法，其步骤如下:
[0011](I)PDI基因的PCR扩增
[0012]利用PCR方法，以线纹芋螺cDNA为模板扩增PDI基因，根据计算机软件对RACE结果分析，设计并合成了一对引物:
[0013]上游引物为5’ - ATGGCTAGCATGAAGTTTTCATCTTGTT-3，，
[0014]下游引物为5’ -GATCCCAGTTCATCTCTTGGCAGATCTTCA-3’。
[0015]在上下游引物中加入Nhel、BamH I酶切识别序列，进行PCR反应；
[0016]PCR反应参照Takara系统方法进行。
[0017](2)含PDI基因的转移载体pGEM-PDI的构建
[0018]将上述PCR扩增`的PDI基因经琼脂糖凝胶电泳检测回收，再经Nhe I和BamH I双切后插入到转移载体质粒pGEM-easy的TA缺口，构建成转移载体pGEM-PDI ；
[0019](3)连接区LINKER的构建
[0020]根据Linker区的序列:
[0021]SftICC Caa tgt act aac tac get ttg ttg aaa ctc get ggc gat gtt gaa agtaac ccc ggt cct gat gat gat gat aaa fiifiCTC
[0022]合成互补的4条寡聚核甘酸片段:
[0023]BamH-2A+EK-lF:GATCCCAATGTACTAACTACGCTTTGTTGAAACTCGCTGGCG ；
[0024]2A+EK-sacl-2R:ATGTTGAAAGTAACCCCGGTCCTGATGATGATGATAAAGAGCT ；
[0025]bamHl-2A+EK-3R:CAACATCGCCAGCGAGTTTCAACAAAGCGTAGTTAGTACATTGG ；
[0026]2A+EK-sacl-4F:CTTTATCATCATCATCAGGACCGGGGTTACTTT ；
[0027]上述寡聚核甘酸片段经变性、退火、延伸得双链Linker序列，二者同时插入到pET28a的Ndel和Sac I酶切窗口，构建成融合表达载体pPDI。
[0028]本发明还采用RT-PCR的方法，从线纹芋螺cDNA中克隆到的二硫键异构酶基因作为融合表达伴体在基因工程重组表达中的应用，其DNA碱基序列如SEQ ID NO:2所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0029]本发明采用一种芋螺种属分子伴侣F1DI (protein disulfide isomerase,蛋白二硫键异构酶)作为融合伴体。PDI基因是通过PCR的方法，从线纹芋螺中扩增而得。PDI是大肠杆菌的一种分子伴侣，在细胞内能协助蛋白的正确折叠。来自海洋生物芋螺的PDI分子量约为58kD，其构象严紧，热稳定性好，甚至可耐受50°C的高温。研究表明，PDI在细胞内会以分子伴侣的形式协助目的蛋白折叠。2000年日本科学家在短芽孢杆菌内使用PDI融合表达体系，提高了蛋白胞外表达(T.KajinO，etc2000)。PDI的这些特性非常适合于作为外源蛋白的融合表达伴体。[0030]本发明所述表达载体含有碱基序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸片段，其中的启动子可以是T7启动子，它是载体的一个结构元件，也可用其它强启动子如Tac、Lac等代替。
[0031]本发明PDI位点之后还设计了肠激酶的切割位点。融合蛋白表达体系必须面对的一个问题是如何有效切除伴体蛋白而获得目的蛋白单体。肠激酶是一种丝氨酸蛋白酶，它能特异地识别肽链中N-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C五个氨基酸残基,切割点在Lys的梭基端。相对于其它切割酶，肠激酶具有识别特异性强、切割效率高、反应条件温和等优点。由于肠激酶的切割位点在识别位点的梭基末端，因而切割下来的外源蛋白在氨基端无额外的氨基酸，从而使其氨基酸序列与天然蛋白完全一致。
[0032]本发明在PDI序列的上游设计了 6个组氨酸的纯化标签。组氨酸能提供配位电子和一些金属离子如Ni2+鳌合位点。6个连续的组氨酸可以使蛋白吸附于含金属Ni2+的层析填料上，因而可以利用金属鳌和层析来纯化融合蛋白，从而简化蛋白纯化工作。
[0033]实验结果表明，本发明应用pPDI构建的pPDI_ltl4a载体，表达的融合蛋白95%以上可溶。本发明构建的融合蛋白载体PPDI可应用于重组蛋白的大规模生产。该发明构建载体能以融合蛋白的形式高效表达外源基因，表达产物可溶性好，纯化简易，且具有外源蛋白的天然生物活性。此表达载体不仅适用于重组蛋白的大量生产，也适用于基因工程产品及生物制剂的研究及生产，同时也可用于对蛋白功能与构象关系的研究。
[0034]本发明的载体的复制方法:参照Sambrook (Sambrook, etal.1989.Molecularcloning.Cold spring Harbor Laboratory Press.USA)方法，按 CaC1:法在 E.coli DH5a或E.coli JMlOl菌株中转化质粒，用含卡那霉素(30ug/mL)的LB培养基培养经转化的细菌，碱法提取质粒。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1是本发明的载体从启动子至多克隆位点的序列。其中，无下划线为PDI基因序列，单下划线“―”为6His序列，双下划线“_”为EK肠激酶酶切位点，曲线“―”为多克隆位点。
[0036]图2是PDI基因的PCR扩增产物示意图，其中泳道I是线纹芋螺cDNA模板所得的PCR产物，泳道2是Takara公司的DL200Marker。
[0037]图3是融合表达载体pPDI的构建示意图。
[0038]图4是母载体pET28a的物理图谱。
[0039]图5是利用pPDI表达pPDI_ltl4a融合蛋白及纯化的SD S-PAGE示意图，其中M为蛋白Marker，I为诱导前，2为诱导后，3为超声沉淀，4为超声上清，5_9为用Ni2+ChelatingSepharose亲和层析柱梯度洗脱的PDI_ltl4a融合蛋白。
[0040]图6是pPDI_ltl4a酶切鉴定。I为进一步纯化的pPDI_ltl4a融合蛋白，2为用肠激酶切割TRX/PLA2融合蛋白，3为无肠激酶的阴性对照，M为蛋白marker。
【具体实施方式】
[0041]下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。
[0042]实施例一、融合表达载体pPDI的构建[0043]1.PDI基因的PCR扩增
[0044]PDI是从芋螺cDNA文库中获取，因此，利用PCR方法，以线纹芋螺cDNA为模板扩增PDI基因。根据计算机软件对RACE结果分析，设计并合成了一对引物:
[0045]上游引物为5’ - ATGGCTAGCATGAAGTTTTCATCTTGTT-3’，
[0046]下游引物为5’ -GATCCCAGTTCATCTCTTGGCAGATCTTCA-3’。
[0047]为方便克隆，分别在上下游引物中加入Nhe1、BamH I酶切识别序列。
[0048]PCR反应参照Takara系统方法进行。
[0049]2.含PDI基因的转移载体pGEM-PDI的构建
[0050]PCR扩增的PDI基因经琼脂糖凝胶电泳检测回收，再经Nhe I和BamH I双切后插入到转移载体质粒pGEM-easy的TA缺口，构建成转移载体pGEM_PDI，质粒构建过程见图3。
[0051]3.连接区LINKER的构建
[0052]首先，根据Linker区的序列:
[0053]臟 TCC Caa tRt act aac tac Rct ttR ttR aaa ctc Rct rrc Rat Rtt Raa agtaac ccc ggt cct gat gat gat gat aaa 6A6CTC
[0054]合成互补的4条寡聚核甘酸片段: [0055]
【权利要求】
1.一种原核融合表达载体，其含有下述核苷酸片段，该核苷酸片段由启动子、编码F1DI伴体蛋白的基因、连接区串联构成，其中所述的连接区含有肠激酶切割位点和多克隆位点。
2.按照权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的核苷酸片段的碱基序列如SEQID NO:1 所示。
3.按照权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于采用质粒pPDI构建。
4.构建权利要求1或2所述表达载体的方法，其步骤如下: (1)PDI基因的PCR扩增 利用PCR方法，以线纹芋螺cDNA为模板扩增PDI基因，根据计算机软件对RACE结果分析，设计并合成了一对引物: 上游引物为 5’ - ATGGCTAGCATGAAGTTTTCATCTTGTT-3，， 下游引物为 5’ -GATCCCAGTTCATCTCTTGGCAGATCTTCA-3’ ； 在上下游引物中加入Nhel、BamH I酶切识别序列，进行PCR反应； PCR反应参照Takara系统方法进行； (2)含PDI基因的转移载体pGEM-PDI的构建 将上述PCR扩增的PDI基因经琼脂糖凝胶电泳检测回收，再经Nhe I和BamH I双切后插入到转移载体质粒pGEM-easy的TA缺口，构建成转移载体pGEM_PDI ； (3)连接区LINKER的构建` 根据Linker区的序列:`
6ftTCC Caa tgt act aac tac get ttg ttg aaa ctc get ggc gat gtt gaa agt aacccc ggt cct gat gat gat gat aaa SSOC合成互补的4条寡聚核甘酸片段:
BamH-2A+EK-lF:GATCCCAATGTACTAACTACGCTTTGTTGAAACTCGCTGGCG ；
2A+EK-sacl-2R:ATGTTGAAAGTAACCCCGGTCCTGATGATGATGATAAAGAGCT ；
bamHl-2A+EK-3R:CAACATCGCCAGCGAGTTTCAACAAAGCGTAGTTAGTACATTGG ；
2A+EK-sacl-4F:CTTTATCATCATCATCAGGACCGGGGTTACTTT ； 上述寡聚核甘酸片段经变性、退火、延伸得双链Linker序列，二者同时插入到pET28a的Ndel和Sac I酶切窗口，构建成融合表达载体pPDI。
5.权利要求1或2所述的表达载体在基因工程蛋白重组表达中的应用。
6.采用RT-PCR的方法，从线纹芋螺cDNA中克隆到的二硫键异构酶基因作为融合表达伴体在基因工程重组表达中的应用，其DNA碱基序列如SEQ ID NO:2所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
【文档编号】C12N15/10GK103710373SQ201310754150
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】徐安龙, 王磊, 任政华, 王晓敏, 唐炜, 邹帆, 陈尚武 申请人:中山大学