胚胎干细胞特有小分子多肽es61编码基因的克隆方法
【专利摘要】本发明提供了一种胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法，步骤如下：（1）提取人绒毛组织总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；（2）设计PCR扩增引物将目标基因扩增出来；（3）PCR产物的回收和纯化；（4）基因酶切连接转化。本发明的能够有效克隆该ES61编码基因，方便了以后ES61多肽基因的定量检测，为以后研究ES61多肽基因功能奠定了基础。
【专利说明】胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，具体涉及一种胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法。
【背景技术】
[0002]人胚胎干细胞(Embryonic Stem cell, ES细胞)是在胚胎发育早期存在的一类细胞，具有全能性，能分化成为生物体的各个组织器官；RP4-792G4.2 (NCBI登陆号HG492132.1)基因是目前发现特异性表达于ES细胞等多能干细胞中的一类不能翻译蛋白质的ncRNA (non-coding RNA, ncRNA),研究发现,RP4-792G4.2基因可以编码一种有61个氛基酸组成的多肽，命名为ES61多肽，编码ES61多肽的核苷酸序列由183个碱基组成，编码61个氨基酸，此氨基酸经过生物信息学分析存在典型分泌信号肽序列。
[0003]目前尚没有人报道针对该多肽ES61编码基因的克隆方法，因此难以完成对该ES61多肽基因的定量检测，以进一步研究该多肽的功能。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种有效的针对胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法。
[0005]为了实现以上技术目的，本发明公开了一种胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法，步骤如下:
[0006](I)提取人绒毛组织总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；
[0007](2 )设计PCR扩增引物将目标基因扩增出来；
[0008](3) PCR产物的回收和纯化；
[0009](4)基因酶切连接转化。
[0010]根据本发明的方法，所述步骤(2)的具体操作为:在ES61后面添加HA标签序列，上下游引物两端分别添加XhoI和HindIII限制性内切酶序列，引物扩增片段总长度为234bp ;将目标片段克隆连接到PLEGFP-N1真核生物表达载体中，引物序列如下:
[0011]ES61-F:5’-CGGCTCGAGACCATGAACTCGCAGATGCCGCTC-3，
[0012]
【权利要求】
1.一种胚胎干细胞特有小分子多肽ES61编码基因的克隆方法，步骤如下: (I)提取人绒毛组织总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ； (2 )设计PCR扩增引物将目标基因扩增出来； (3)PCR产物的回收和纯化； (4)基因酶切、连接、转化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)的具体操作为:在ES61后面添加HA标签序列，上下游引物两端分别添加XhoI和HindIII限制性内切酶序列，引物扩增片段总长度为234bp ;将目标片段克隆连接到PLEGFP-N1真核生物表达载体中，引物序列如下:
ES61-F:5，-CGGCTCGAGACCATGAACTCGCAGATGCCGCTC-3，ES61 -R: St -CCCMGCTTAGCC/mATCTGGAACATCGTATGGGT+ACATGGCGGCCTTGCACTCCGCGT-1f 用上述引物配合如下反应体系=PCR为50 μ I总体系，具体是5XPhusion HFBufferlOy 1,2.5mM dNTPmix5 μ 1，IOmM 的上下游引物各 2 μ l,2U/y I 的 Phusion DNA聚合酶0.8 μ I，人绒毛组织cDNA模板2 μ I，用灭菌水补足50 μ I体系，反应条件为“降落PCR”:95 0C 5min预变性，循环内98°C IOs变性，从68°C每个循环降1°C退火，72°C延伸20s, 10个循环；在60°C退火，进行25个循环；PCR反应循环后72°C继续延伸7min，然后16°C保存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，用XhoI和HindIII酶对上述PCR产物和PLEGFP-N载体进行双酶切，酶切反应体系如下:10X Buffer4 μ I，DNA约2 μ g，内切酶(?ου/μ I)各1μ 1，灭菌去离子水补足到40μ 1，反应条件37°C、lhr。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(4)中，连接反应体系如下:目的片段DNA2y 1，PLEGFP-N1载体0.5μ 1，了4连接酶1“ I, IOX T4Bufferl μ I灭菌去离子水补足到10 μ 1，22。。连接30min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中，转化步骤如下:取连接产物加到100 μ 1DH5 α感受态细胞中，混匀，冰浴30分钟；将上述转化液置于42°C水浴90秒，取出后立即置于冰浴中放置2-3分钟；向其中加入900μ 137°C预热的LB培养基，150rpm、37°C振荡培养45分钟；2500rpm离心5min，将上清液吸走，留100 μ I混匀菌液，加到含Kana抗生素LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开；待平板表面干燥后，倒置平板，37°C培养12-16小时。
【文档编号】C12N15/10GK103865920SQ201310753802
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】张茂雷, 陈杰 申请人:广州达恩基因科技有限公司