检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法与流程

文档序号:12412705阅读:来源:国知局

技术特征:

1.检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法,其特征在于:包括以下步骤:

(1)获得突变体植株;

(2)用1μM油菜素内酯喷施突变体,恢复其矮小皱缩表型;

(3)按照Qiangen公司生产的RNA提取试剂盒及说明书提取总RNA,取2μg总RNA用Invitrogen公司的M-MLV反转录酶按照其说明书进行反转录后得到cDNA;

(4)RT-PCR检测,取100ng总RNA对应的cDNA,用宝生物生产的ExTaq酶按照其说明书进行PCR扩增;若发现油菜素内酯合成途径中关键基因未表达,则为存在突变体。

2.根据权利要求1中所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法,其特征在于:所述关键基因为dwf5,未表达的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1中所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法,其特征在于:所述检测方法中包括步骤:提取dwf5-8的基因组DNA,用引物P1和P2扩增得到DNA片段,发现DNA片段长度减小,经测序鉴定后发现dwf5-8中缺失一段DNA序列。

4.根据权利要求3中所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法,其特征在于:所述引物P1序列为:5’-CATAAAATGGGAGATTGGGAGT-3’

引物P2序列为:5’-CATAGGTGCAACACTTAATCCA-3’。

5.根据权利要求1或2中所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法,其特征在于:所述PCR扩增条件如下:95℃,2min;95℃,15s;55℃,30s;72℃,2min,第2至第4步重复29个循环;72℃延伸10min。

6.根据权利要求1中所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法,其特点在于:所述PCR扩增中引物序列如下:

DWF5-F:5’-ATGACTCGAGCTCTGCTGCTG-3’;

DWF5-R:5’-TCATACGTATATCCCTAAAAC-3’;

以EF1a为内参基因,EF1ɑ-F:5’-CAGGCTGATTGTGCTGTCCT-3’;

EF1ɑ-R:5’-TCAAGTAGCAAAATCACGGCGCTT-3’。

7.根据权利要求1中所述的检测油菜素内酯生物合成基因内是否存在突变体的方法,其特征在于:所述步骤(1)中突变体植株为发育莲座宽度变小、植株高度降低、荚果长度减小的表型的植株。

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