卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ‑3及其筛选方法和应用与流程

本发明涉及一种卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3及其筛选方法和应用。

背景技术：

卵巢粘液性癌对化疗药物的敏感性差且治疗预后效果常不佳。因此，需要采用更多有针对性的研究以寻求更好提高卵巢粘液性癌患者生存率的治疗方法。在卵巢癌的诊断中，采用的主要方法包括B超、CT、MRI、腹腔镜检查和血清肿瘤标志物检查，这些诊断方法主要是基于形态学标准，缺乏与卵巢粘液性癌相关的特异性标志。另外，所有卵巢癌通常采用相同的治疗方法，即手术治疗联合化疗的综合治疗策略，这些治疗方法针对性不够理想。基于单克隆抗体技术，近年来发展的靶向治疗策略在提高卵巢粘液性癌患者生存率方面展现出独特优势，但是抗体本身所具有的一些缺陷，如免疫原性、不稳定性、批次间的差异性等，使其在临床上的实际应用中具有一定的局限性。综上所述，找到卵巢粘液性癌细胞的特异性识别分子，在肿瘤的诊断和治疗中具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有高特异性和高亲和力的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3及其筛选方法和应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，它的序列如下：

5’-AGCTGCTATACTAGCTAAAGACCTGAGGTCCTTTGACGTTCCAGGTAGACTTGAACCGTACCGTAGCGATAGCTAGCTT-3’

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术(指数富集配体的系统进化技术)，以卵巢浆液性癌细胞SKOV3和正常卵巢上皮细胞IOSE作为反筛细胞，以卵巢粘液性癌细胞3AO为正筛细胞，筛选出与卵巢粘液性癌细胞3AO特异性结合的核酸适配体。

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在制备检测卵巢粘液性癌的试剂盒、分子探针或靶向介质中的应用。

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在制备治疗卵巢粘液性癌的靶向治疗探针中的应用。

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在制备治疗卵巢粘液性癌药物中的应用。

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在研究卵巢粘液性癌细胞表面蛋白中的应用。

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的应用，在卵巢肿瘤组织病理染色中、分离卵巢粘液性癌细胞中以及在卵巢肿瘤相关的体内分子成像中的应用。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.核酸适配体WYZ-3具有高特异性的优点，它只特异性识别卵巢粘液性癌细胞3AO，对其他卵巢癌细胞、正常卵巢上皮细胞等不具有或者具有较弱的识别功能。

2.核酸适配体WYZ-3还具有高亲和力、可体外合成及修饰、化学性质稳定、药代动力学性质佳、无免疫原性等特点。

3.核酸适配体在肿瘤细胞生物学、临床实验诊断学、分子成像新技术开发以及靶向治疗方面具有广阔的应用前景和重要的学术价值。

4.核酸适配体WYZ-3的合成成本较抗体制备的成本低，且周期短，重现性好。

附图说明

图1为利用流式细胞术分析测定核酸适配体WYZ-3结合卵巢粘液性癌细胞3AO的解离常数绘制曲线。解离常数Kd＝30.8±10.6nM。在图1中，横坐标为DNA浓度(nM)，纵坐标为平均荧光强度。

图2为利用流式细胞术分析核酸适配体WYZ-3对卵巢粘液性癌细胞3AO的偏移。在图2中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为WYZ-3，虚线为未经筛选的单链DNA文库。

图3为利用流式细胞术分析核酸适配体WYZ-3对卵巢浆液性癌细胞SKOV3的偏移。在图3中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为WYZ-3，虚线为未经筛选的单链DNA文库。

图4为利用流式细胞术分析核酸适配体WYZ-3对正常卵巢上皮细胞IOSE的偏移。在图4中，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞个数，实线为WYZ-3，虚线为未经筛选的单链DNA文库。

图5为核酸适配体WYZ-3的空间结构示意图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

一种卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，它的序列如下：

5’-AGCTGCTATACTAGCTAAAGACCTGAGGTCCTTTGACGTTCCAGGTAGACTTGAACCGTACCGTAGCGATAGCTAGCTT-3’

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，在37℃，0.137M Na⁺，0.001M Mg²⁺的生理条件下，其具有特征性的茎环结构，其空间结构如下：

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3，对所述核酸适配体WYZ-3的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以卵巢浆液性癌细胞SKOV3和正常卵巢上皮细胞IOSE作为反筛细胞，以卵巢粘液性癌细胞3AO为正筛细胞，筛选出与卵巢粘液性癌细胞3AO特异性结合的核酸适配体。

利用卵巢粘液性癌细胞3AO为筛选靶细胞，以与之相对应的卵巢浆液性癌细胞SKOV3以及正常卵巢上皮细胞IOSE作为反筛细胞，筛选除去DNA寡核苷酸文库中与卵巢浆液性癌细胞、正常卵巢上皮细胞非特异性结合的部分，保证筛选得到的核酸适配体可以特异性的结合卵巢粘液性癌细胞3AO。

另外，采用标准的Cell-SELEX筛选方法，保持筛选细胞的形态和活性完好，保证细胞表面生物大分子更加接近于生物体内的分子构象。

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，它包括以下步骤：

(1)准备以下序列所示的单链DNA文库：

单链DNA文库：

5’-AGCTGCTATACTAGCTAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGTAGCGATAGCTAGCTT-3’；

(2)SKOV3细胞反筛：将步骤(1)准备的文库与SKOV3细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；

(3)IOSE细胞反筛：将步骤(2)所得上清与IOSE细胞孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的上清；

(4)3AO细胞正筛：将步骤(3)所得的上清与3AO细胞孵育，孵育完成后，弃上清液；洗涤3AO细胞并将3AO细胞刮下后，转移到EP管中进行加热变性，之后离心分离收集上清液；

(5)PCR富集：步骤(4)所得的上清液进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；其中PCR扩增所用的引物为：

引物Fup:5’-FAM-AGCTGCTATACTAGCTAAAG-3’；

引物Ldown:5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-spacer C9-AAGCTAGCTATCGCTACGG-3’；

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-spacer C9使两条引物的链长不一样，便于PCR扩增产物的变性电泳分离。

(6)单链DNA纯化：将PCR扩增产物进行变性解链后，变性电泳分离，纯化收集FAM标记的ssDNA；

(7)核酸适配体循环筛选：将步骤(6)所得的ssDNA作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(2)～(6)的筛选过程。

实施例一：核酸适配体WYZ-3的筛选：

所述的卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3的筛选方法，它包括以下步骤：

(1)筛选文库的准备：

委托生工生物工程股份有限公司合成单链DNA文库(5’-AGCTGCTATACTAGCTAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGTAGCGATAGCTAGCTT-3’)；取1管1OD的单链DNA文库，高速离心2min；在通风柜中轻轻打开管盖，加入300μL结合缓冲液(DPBS中含4.5g/L葡萄糖，100mg/L酵母tRNA、1g/L BSA，5mM MgCl₂)，漩涡振荡溶解；用封口膜封好离心管盖，95℃水浴5min，迅速冰水浴2min；高速离心2min，备用。

(2)SKOV3细胞反筛：将步骤(1)准备的文库吸入SKOV3细胞生长覆盖度达到约60％左右的直径100mm培养皿中，用结合缓冲液补足到1mL；4℃摇床振荡1h；将上清液1000rpm离心10min，收集上清液；

(3)IOSE细胞反筛：吸取步骤(2)所得上清至IOSE细胞生长覆盖度达到约60％左右的直径100mm培养皿中；4℃摇床振荡1h；将上清液1000rpm离心10min，收集上清液；

(4)3AO细胞正筛：吸取步骤(3)所得的上清至3AO细胞生长覆盖度达到约60％左右的直径60mm培养皿中，4℃摇床振荡1h；弃上清液；用洗涤缓冲液(DPBS中含4.5g/L葡萄糖，5mM MgCl₂)洗涤3AO细胞三遍；用细胞刮将3AO细胞刮下，用1mL洗涤缓冲液将3AO细胞转移到EP管中，95℃水浴5min，迅速冰水浴2min；10000rpm离心5min，留取上清。

(5)PCR富集：取50μL步骤(4)所得的上清样品，加入到1mL PCRmix中；漩涡振荡混匀后，按每管50μL分装进行PCR扩增，扩增条件为：95℃加热预变性10min后，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环。

其中1mL PCRmix中含有：H₂O 871μL；10×PCR缓冲液100μL；

引物Fup:5’-FAM-AGCTGCTATACTAGCTAAAG-3’和Ldown:5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-spacer C9-AAGCTAGCTATCGCTACGG-3’各3μL；pfu酶3μL；dNTP 20μL。所述引物Fup和引物Ldown均委托生工生物工程股份有限公司合成。

(6)单链DNA纯化：将PCR扩增产物混合，加入6倍体积的正丁醇，旋涡震荡混匀，14000rpm，室温离心10min；吸取底部样本约50μL，与TBE/7M Urea缓冲液等体积混合，95℃水浴10min，迅速冰水浴2min；用7M尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(400V电压)；电泳结束后，在荧光成像系统中，切胶回收FAM标记的ssDNA条带；将凝胶切碎，加入500μL ddH₂O，煮沸10min，高速离心收集上清；加入2.5倍体积乙醇，室温放置15min，高速离心，弃上清，沉淀用100μL结合缓冲液溶解。

(7)核酸适配体循环筛选：将步骤(6)所得的ssDNA作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(2)～(6)的筛选过程。

实施例二：核酸适配体WYZ-3序列的分析：

经过12轮筛选后，回收3AO细胞正筛上清，并委托上海派森诺生物科技股份有限公司利用高通量测序技术对文库序列进行分析，分析过程为：PCR扩增富集文库，并加上测序接头和Index部分；通过凝胶电泳选择纯化文库；利用Agilent 2100Bioanalyzer通过Agilent High Sensitivity DNAKit对文库质控；利用Quant-iT PicogGreen dsDNA Assay Kit对文库进行定量；利用IlluminateNextSeq 500平台，以单链文库为模板进行桥式PCR扩增、测序引物退火、边合成边测序；并对测序结果进行比对和富集分析。

利用UNAFold网络平台分析在生理条件下(37℃，0.137M Na⁺，0.001M Mg²⁺)，该核酸适配体WYZ-3序列的二级结构。分析出核酸适配体WYZ-3序列的二级结构示意图如图5所示。

实施例三：核酸适配体WYZ-3与卵巢粘液性癌细胞3AO结合能力的分析：

1.将靶细胞3AO接种于24孔板中(5万个/孔)，于37℃，5％CO₂培养24h。

2.用结合缓冲液将FITC标记的单链DNA(包括核酸适配体WYZ-3和未经筛选的单链DNA文库)配置成浓度为0nM、10nM、50nM、100nM、200nM的溶液；95℃水浴5min，迅速冰水浴2min。

3.用结合缓冲液洗涤细胞两次，每孔加入200μL上述梯度浓度的单链DNA溶液，并置于冰上孵育30min。

4.孵育过后，弃上清，用细胞刮将细胞刮起；用结合缓冲液洗两次，将细胞重悬，体积为250μL。

5.使用BD公司的FACSAria流式细胞仪对细胞进行荧光测定；测定结果用GraphPad Prism 6软件作图，计算出所得核酸适配体WYZ-3的解离常数为30.8±10.6nM，如图1所示。图1的检测结果表明：核酸适配体WYZ-3与靶细胞卵巢粘液性癌细胞3AO的结合能力强，解离常数在纳摩尔级别。

实施例四：核酸适配体WYZ-3与卵巢粘液性癌细胞3AO结合特异性的分析：

1.计数待测细胞并接种于24孔板中(5万个/孔)，于37℃，5％CO₂培养24h。

2.用结合缓冲液洗涤细胞两次，每孔加入200μL FITC标记的单链DNA(包括核酸适配体WYZ-3和未经筛选的单链DNA文库)，并置于冰上孵育30min。

3.孵育过后，弃上清，用细胞刮将细胞刮起；用结合缓冲液洗两次，将细胞重悬，体积为250μL。

4.使用BD公司的FACSAria流式细胞仪对细胞进行荧光测定。

所述的待测细胞分别为卵巢粘液性癌细胞3AO、卵巢浆液性癌细胞SKOV3以及正常卵巢上皮细胞IOSE，其中，卵巢浆液性癌细胞SKOV3以及正常卵巢上皮细胞IOSE为对照细胞，检测结果如图2～4所示。由图2～4流式细胞术的检测结果证明，本发明的核酸适配体WYZ-3对卵巢粘液性癌细胞3AO具有较强的特异性识别能力，而对对照细胞卵巢浆液性癌细胞SKOV3以及正常卵巢上皮细胞IOSE无识别。

SEQUENCE LISTING

<110> 吴冬

<120> 卵巢粘液性癌细胞3AO的核酸适配体WYZ-3及其筛选方法和应用

<160> 3

<210> 1

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agctgctata ctagctaaag acctgaggtc ctttgacgtt ccaggtagac 50

ttgaaccgta ccgtagcgat agctagctt 79

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agctgctata ctagctaaag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagctagcta tcgctacgg 19