本发明属于聚合物改性领域，具体涉及一种基于昆布多糖的纳米凝胶及其制备方法。
背景技术：
纳米凝胶是由亲水性或两亲性高分子链组成的三维网状结构，是一种纳米尺度的水凝胶颗粒。由于水和凝胶网络的亲和性，水能以键合水、束缚水和自由水等形式存在于高分子网络中而失去流动性，因此纳米凝胶能够保持一定的形状。用作药物载体，纳米凝胶对药物具有很高的负载能力且具有一定的稳定性。
按照交联的类型，纳米凝胶也有物理交联及化学交联纳米凝胶之分。前者以共价键连接，后者诸如疏水作用力、氢键等非共价键连接。与物理交联凝胶相比，化学交联的纳米凝胶较为稳定，但由于制备过程中有机溶剂的引入则限制了其在蛋白质等药物中的应用。因此，开发制备过程中无需有机溶剂的化学键交联的纳米凝胶显得尤为重要。
Diels-Alder反应是指分子间的一种环加成协同反应，由共轭双烯与烯烃 ( 即亲双烯体) 反应生成取代环己烯。Diels-Alder反应是一类高选择性、高产率、高可靠性和环境耐受性的反应，反应条件温和、快速，在制备化学键交联的纳米凝胶中发挥了重要作用。
技术实现要素：
本发明的目的旨在提供一种基于昆布多糖的纳米凝胶及其制备方法。本发明采用Diels-Alder反应法制备基于昆布多糖的纳米凝胶，反应条件温和，不需要昂贵、大型的仪器设备，制备过程无需有机溶剂，克服了现有纳米凝胶的制备过程中由于有机溶剂的引入限制了其在蛋白质等药物中的应用。所得化学键交联的纳米凝胶，粒径分布均一，可控性好，稳定性高，具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
2-富烯戊酸的合成：2-富烯戊酸的合成方法为：在0 ℃条件下，将乙酰丙酸溶于四氢呋喃与甲醇的混合溶液中，再相继加入新蒸的环戊二烯和吡咯烷催化剂，在氩气保护下0 ℃反应30 min，然后在室温下反应3 h。反应完成后将反应液置于无水乙醚中，先用0.1 M的HCl酸洗，再用0.1 M的NaOH萃取乙醚层两次，将萃取液混合后倒入用二氯甲烷中调pH至2.0，两相分离后用二氯甲烷萃取2次，以无水硫酸镁为干燥剂干燥萃取液24 h，然后将有机相旋蒸至呈黄色油状液体，用硅胶柱色谱通过乙酸乙酯进行洗脱，旋蒸得到2-富烯戊酸。其中：四氢呋喃与甲醇的体积比为9:1；乙酰丙酸、环戊二烯、吡咯烷的摩尔比为1:2.5:2；色谱柱所用硅胶目数为200-300目。
2-富烯戊酸接枝昆布多糖的合成：将N,N-羰基二咪唑（CDI）加入到0.1 g/mL 2-富烯戊酸的DMSO溶液中，室温搅拌反应24 h。然后将0.1 g/mL昆布多糖的DMSO溶液加入上述体系，继续室温搅拌反应24 h，最后将反应液置于透析袋（Mw = 300）透析3 d，冷冻干燥48 h，即得产物。其中：2-富烯戊酸、CDI与昆布多糖结构单元的摩尔比为1:1:1。。
2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇的合成：将聚乙二醇（Mn = 2000）与2,3-二氯马来酸酐溶于甲苯中，在通氩气下120 ℃回流搅拌8 h，反应完成后用乙醚进行沉淀，减压抽滤，真空干燥得淡黄色产物。其中：聚乙二醇与2,3-二氯马来酸酐的摩尔比为 1:4。
基于昆布多糖的纳米凝胶的制备：在超声波振荡下将适量的2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇溶液逐滴滴加到2-富烯戊酸接枝的昆布多糖溶液中，超声振荡10分钟，最后置于37 ℃水浴锅中搅拌6 h，即可发生Diels Alder共价交联反应形成基于昆布多糖的纳米凝胶。其中：2-富烯戊酸接枝的昆布多糖配浓度为：0.05 g/mL，2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇浓度为：0.25g/mL。2-富烯戊酸接枝的昆布多糖与2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇的摩尔比为：1:1~3。
本发明的显著优点在于：以生物相容性良好的昆布多糖和聚乙二醇为原料，采用Diels-Alder反应法制备纳米凝胶，反应条件温和，不需要昂贵、大型的仪器设备，制备过程无需有机溶剂，克服了现有纳米凝胶的制备过程中由于有机溶剂的引入限制了其在蛋白质等药物中的应用。本发明所得纳米凝胶为化学键交联，稳定性高，粒径分布均一，且通过调控原料的摩尔比、浓度、超声振荡时间、反应条件等可以得到一定范围粒径的纳米凝胶，可作为潜在的药物载体。
具体实施方式
实施例1
（1）2-富烯戊酸的合成：在0 ℃条件下，将0.070 mol乙酰丙酸溶于90.0 mL四氢呋喃与10.0 mL甲醇的混合溶液中，再相继加入0.175 mol新蒸的环戊二烯和0.140 mol吡咯烷催化剂，在氩气保护下0 ℃反应30 min，然后在室温下反应3 h。反应完成后将反应液置于200.0 mL无水乙醚中，先用0.1 M的HCl酸洗，再用0.1 M的NaOH萃取乙醚层两次，将萃取液混合后倒入用二氯甲烷中调pH至2.0，两相分离后用二氯甲烷萃取2次，以无水硫酸镁为干燥剂干燥萃取液24 h，然后将有机相旋蒸至呈黄色油状液体，用硅胶柱色谱通过乙酸乙酯进行洗脱，旋蒸得2-富烯戊酸。
（2）2-富烯戊酸接枝昆布多糖的制备：将0.03 mol 2-富烯戊酸溶解于50.0 mL DMSO中，加入0.03 mol N,N-二羰基咪唑，室温搅拌反应24 h，然后将0.03 mol昆布多糖结构单元溶解于150.0 mL DMSO中，加入上述体系，室温搅拌反应24 h。最后将反应液置于透析袋（Mw = 300）透析3 d，冷冻干燥48 h，即得产物。
（3）2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇的合成：将0.005mol聚乙二醇（Mn = 2000）和0.02 mol 2,3-二氯马来酸酐溶解于40.0 mL甲苯中。在120 ℃通氮气的条件下回流8 h，反应完成后用乙醚进行沉淀，减压抽滤，真空干燥得淡黄色产物。
（4）基于昆布多糖的纳米凝胶的制备：将2.024×10-5 mol 2-富烯戊酸接枝的昆布多糖溶于4.0 mL PBS中配制成5.06×10-6 mol /mL的溶液，4.28×10-4 mol 2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇溶于4.0 mL PBS中配制成1.07×10-4 mol /mL的溶液。在超声条件下将189.1uL 2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇配溶液逐滴加入到4.0 mL 2-富烯戊酸接枝的昆布多糖溶液中，继续超声10 min，于37 ℃条件下反应6 h，即得基于昆布多糖的纳米凝胶。
实施例2
（1）2-富烯戊酸的合成：在0 ℃条件下，将0.070 mol乙酰丙酸溶于90.0 mL四氢呋喃与10.0 mL甲醇的混合溶液中，再相继加入0.175 mol新蒸的环戊二烯和0.140 mol吡咯烷催化剂，在氩气保护下0 ℃反应30 min，然后在室温下反应3 h。反应完成后将反应液置于200.0 mL无水乙醚中，先用0.1 M的HCl酸洗，再用0.1 M的NaOH萃取乙醚层两次，将萃取液混合后倒入用二氯甲烷中调pH至2.0，两相分离后用二氯甲烷萃取2次，以无水硫酸镁为干燥剂干燥萃取液24 h，然后将有机相旋蒸至呈黄色油状液体，用硅胶柱色谱通过乙酸乙酯进行洗脱，旋蒸得2-富烯戊酸。
（2）2-富烯戊酸接枝昆布多糖的制备：将0.03 mol 2-富烯戊酸溶解于50.0 mL DMSO中，加入0.03 mol N,N-二羰基咪唑，室温搅拌反应24 h，然后将0.03 mol昆布多糖结构单元溶解于150.0 mL DMSO中，加入上述体系，室温搅拌反应24 h。最后将反应液置于透析袋（Mw = 300）透析3 d，冷冻干燥48 h，即得产物。
（3）2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇的合成：将0.005 mol聚乙二醇（Mn = 2000）和0.02 mol 2,3-二氯马来酸酐溶解于40.0 mL甲苯中。在120 ℃通氮气的条件下回流8 h，反应完成后用乙醚进行沉淀，减压抽滤，真空干燥得淡黄色产物。
（4）基于昆布多糖的纳米凝胶的制备：将2.024×10-5 mol 2-富烯戊酸接枝的昆布多糖溶于4.0 mL PBS中配制成5.06×10-6 mol /mL的溶液，4.28×10-4 mol 2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇溶于4.0 mL PBS中配制成1.07×10-4 mol /mL的溶液。在超声条件下将378.2 uL 2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇配溶液逐滴加入到4.0 mL 2-富烯戊酸接枝的昆布多糖溶液中，继续超声10 min，于37 ℃条件下反应6 h，即得基于昆布多糖的纳米凝胶。
实施例3
（1）2-富烯戊酸的合成：在0 ℃条件下，将0.070 mol乙酰丙酸溶于90.0 mL四氢呋喃与10.0 mL甲醇的混合溶液中，再相继加入0.175 mol新蒸的环戊二烯和0.140 mol吡咯烷催化剂，在氩气保护下0 ℃反应30 min，然后在室温下反应3 h。反应完成后将反应液置于200.0 mL无水乙醚中，先用0.1 M的HCl酸洗，再用0.1 M的NaOH萃取乙醚层两次，将萃取液混合后倒入用二氯甲烷中调pH至2.0，两相分离后用二氯甲烷萃取2次，以无水硫酸镁为干燥剂干燥萃取液24 h，然后将有机相旋蒸至呈黄色油状液体，用硅胶柱色谱通过乙酸乙酯进行洗脱，旋蒸得2-富烯戊酸。
（2）2-富烯戊酸接枝昆布多糖的制备：将0.03 mol 2-富烯戊酸溶解于50.0 mL DMSO中，加入0.03 mol N,N-二羰基咪唑，室温搅拌反应24 h，然后将0.03 mol昆布多糖结构单元溶解于150.0 mL DMSO中，加入上述体系，室温搅拌反应24 h。最后将反应液置于透析袋（Mw = 300）透析3 d，冷冻干燥48 h，即得产物。
（3）2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇的合成：将0.005 mol聚乙二醇（Mn = 2000）和0.02 mol 2,3-二氯马来酸酐溶解于40.0 mL甲苯中。在120 ℃通氮气的条件下回流8 h，反应完成后用乙醚进行沉淀，减压抽滤，真空干燥得淡黄色产物。
（4）基于昆布多糖的纳米凝胶的制备：将2.024×10-5 mol 2-富烯戊酸接枝的昆布多糖溶于10.0 mL PBS中配制成5.06×10-6 mol /mL的溶液，4.28×10-4 mol 2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇溶于4.0 mL PBS中配制成1.07×10-4 mol/mL的溶液。在超声条件下将567.3 uL 2,3-二氯马来酸酐改性的聚乙二醇配溶液逐滴加入到4.0 mL 2-富烯戊酸接枝的昆布多糖溶液中，继续超声10 min，于37 ℃条件下反应6 h，即得基于昆布多糖的纳米凝胶。
表1基于昆布多糖的纳米凝胶的粒径、粒径分布及zeta电位
以上所述仅为本发明的制备方法，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。