一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法。

背景技术：

石斑鱼是一种重要的经济鱼类，尤其是在亚洲。神经坏死病毒(NNV)可攻击石斑鱼的神经系统，造成致命性的病毒脑病和视网膜病变。NNV一旦爆发会造成仔、稚鱼的大量死亡，发病后死亡率高达80-100％，带来巨大的经济损失，成为限制石斑鱼养殖业发展的主要瓶颈。

石斑鱼神经坏死病毒(NNV)属于Betanodaviridae病毒属Betanodavirus科，能在许多鱼类中传播。鱼类患病后出现神经紊乱症状，中枢神经系统和视网膜有局部空泡，并伴有螺旋式游泳，鱼鳔控制异常等表现。至今已从14个科30种以上的海洋鱼类体内分离出NNV。NNV基因组包含两条正义RNA连，其中RNA1编码一个RNA依赖的RNA聚合酶，RNA2编码病毒衣壳蛋白。在NNV基因所编码的蛋白中，衣壳蛋白具有免疫活性，可被用于制作疫苗。利用基因工程技术可在大肠杆菌中高效表达病毒衣壳蛋白，然而，由于原核细胞结构简单，通常在大量表达的同时不能使NNV衣壳蛋白正确折叠，最终呈包涵体形式存在，成为NNV疫苗开发的一大障碍。克服这一问题是当前石斑鱼神经坏死病的免疫防治迫切需求。

技术实现要素：

一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用，其特征在于，包

含以下步骤：

(1)将含有斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因的重组质粒pET32a-NNV转化到大肠杆菌BL21中，37℃、250rpm条件下，当OD达到0.6时加入IPTG，直至IPTG终浓度为1mM，降温至25℃，诱导表达12h；

(2)诱导表达完成后离心收集菌体，破碎，对包涵体进行纯化，将纯化后的包涵体冷冻干燥，碾磨成粉末，过80目筛。

进一步的，所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白大小为37kDa。

进一步的，所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列为Seq ID No1。

进一步的，所述石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白序列为Seq ID No2。

进一步的，所述步骤(2)中离心是在10000rpm转速下离心20min，弃上清。

进一步的，所述步骤(2)中破碎是将收集的菌体用裂解液重悬后采用高压均质机破碎，每次破碎压力为1000bar，时间为10min，共破碎3次。

进一步的，所述裂解液组成为：10mM Tris-HCl(pH 7.1)、100mM NaCl、125mM咪唑。

进一步的，所述步骤(2)中，石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白包涵体纯化步骤为：(1)取破碎后的菌体在20000rpm条件下离心30min后弃去上清，沉淀加入缓冲液B1，混匀后25℃振荡30min；(2)20000rpm离心30min后弃去上清，加入缓冲液B2，混匀后25℃振荡30min；(3)20000rpm离心30min后弃去上清，加入纯水，混匀后25℃振荡30min；(4)重复步骤(3)两次；(5)20000rpm离心30min后弃去上清，沉淀冷冻干燥后碾磨成粉末。

进一步的，所述缓冲液B1组成为：10mM Tris-HCl(pH 7.1)、100mM NaCl、1％TritonX-100；缓冲液B2组成为：10mM Tris-HCl(pH 7.1)、100mM NaCl。

更进一步的，衣壳蛋白的应用方法，将所述衣壳蛋白粉末添加到饲料中，喂食3龄期黄粉虫，培养至4龄期时，将虫体冷冻干燥并碾磨成粉末，并过80目筛，即得抗神经坏死病毒天然药剂。

更进一步的，所述抗神经坏死病毒天然药剂的应用方法为，将衣壳蛋白粉末按黄粉虫平均体重的1％添加到饲料中。。

特别的，本发明基于GenBank已公布的NNV衣壳蛋白基因序列(Seq ID No3)，人工合成基因并构建重组载体，其所含NNV衣壳蛋白基因序列为Seq ID No1，第42-54个碱基由原始的acc aag gcc gcg变为cgc ggg，导致对应的蛋白序列N端15-18个残基由TKAA变为RG(见Seq ID No2)。实验表明，相比于重组入原始Seq ID No3序列，含Seq ID No1的菌株蛋白表达量由23mg/g菌体(湿重)增加至27mg/g菌体(湿重)，提高达17.4％

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明制备的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白表达高效稳定。经病毒细胞对抗体敏感性检测证实，本发明所制备的石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白能够有效抑制石斑鱼神似坏死病，效价高，具有良好的免疫保护效力，可以在鱼类的稚鱼期，将其作为抗神经坏死病毒疫苗添加到鱼类饲料中，为石斑鱼神经坏死病毒疫苗的商品化推广提供了可能性，具有广阔的市场前景。

附图说明：

图1：免疫效力检测。

序列表说明：Seq ID No1为本发明菌株所带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因对应的核苷酸序列。

Seq ID No2为本发明菌株所带石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因对应的氨基酸序列。

Seq ID No3为GenBank已公布的一段石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因。

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实例1：石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白诱导表达及纯化

将含目的基因的大肠杆菌在37℃、250rpm培养至OD 0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，并使培养温度将至25℃。培养12h后结束表达。10000rpm转速下离心20min，充分弃去上清。

按3mL/g菌体(湿重)加入裂解液重悬菌体，随后采用高压均质机破碎，压力1000bar。破碎后的菌体在20000rpm下离心30min后弃去上清，按2mL/g菌体(湿重)加入缓冲液B1，混匀后25℃振荡30min；(2)20000rpm离心30min后弃去上清，按2mL/g菌体(湿重)加入缓冲液B2，混匀后25℃振荡30min；(3)20000rpm离心30min后弃去上清，按2mL/g菌体(湿重)加入纯水，混匀后25℃振荡30min；(4)重复(3)两次；(5)20000rpm离心30min后弃去上清。

其中，裂解液组成包括：10mM Tris-HCl(pH 7.1)、100mM NaCl、125mM咪唑；缓冲液B1组成包括：10mM Tris-HCl(pH 7.1)、100mM NaCl、1％TritonX-100；缓冲液B2组成包括：10mM Tris-HCl(pH 7.1)、100mM NaCl。

所得沉淀在-80℃冷冻后，置于预冷好的冷冻机内冷冻干燥，最后碾磨成粉末，并过80目筛。

实例2：重组NNV衣壳蛋白应用于石斑鱼神经坏死病防治

选取3龄期黄粉虫，按体重1％将NNV衣壳蛋白粉末添加于饲料中喂食。虫体培养至4龄期后，-80℃冷冻凝固，然后置于预冷好的冷冻机内冷冻干燥，最后碾磨成粉末，并过80目筛。将虫粉末按鱼体重1.5％添加到鱼饲料中喂食石斑鱼，每周喂食1次虫粉末，共喂食3次。最终提高石斑鱼对NNV的免疫力。

实施例3：免疫效力检测

免疫组1：取实施例2中免疫的石斑鱼。

免疫组2：采用目前已公布NNV衣壳蛋白制备方法制备的衣壳蛋白粉末喂养3龄期黄粉虫，虫体培养至4龄期后，-80℃冷冻凝固，然后置于预冷好的冷冻机内冷冻干燥，最后碾磨成粉末，并过80目筛。将虫粉末按鱼体重1.5％添加到鱼饲料中喂食石斑鱼，每周喂食1次虫粉末，共喂食3次。

其中，已公布的NNV衣壳蛋白制备方法为：在原核条件下，培养已含有编码神经坏死病毒衣壳蛋白基因的pQE30质粒载体的大肠杆菌，将OD600＝1.5的大肠杆菌菌液按照1％的质量分数接种到培养基中，37℃，250rpm下培养至OD600为0.3-0.5时，加入IPTG直至IPTG终浓度为900μM，转移至25-30℃，200rpm的转速下培养3-4小时完成表达；表达结束后，破裂菌体、分离及纯化获得神经坏死病毒的衣壳蛋白。

对照组：普通石斑鱼。

检测方法：设置3个2000L的放养池，池1内放养免疫组1的石斑鱼300尾，池2内放养免疫组2的石斑鱼300尾，池3内放养对照组的普通石斑鱼300尾。将感染神经坏死病的石斑鱼加水打碎成浆后离心，以上清为攻毒源投入鱼池。每天统计鱼死亡数，以此计算存活率。15天统计结果如图1所示。

结果表明：喂食本技术制备的黄粉虫粉末后石斑鱼对NNV抵抗力显著提高，存活率由5％上升至83％。而喂食目前已有技术制备的黄粉虫粉末后石斑鱼的存活率为57％。

综上，本发明采用基因工程技术表达包涵体NNV衣壳蛋白，基于包涵体NNV衣壳蛋白实现对石斑鱼的免疫防治，最终获得了显著的效果。本发明所涉及的黄粉虫养殖，技术简单，成本低，节省空间，周期短。并且，黄粉虫养殖不传播疾病，无需防疫。此外，与注射免疫的方法相比，本发明的喂食免疫方法操作更为简单，仅在常规饲料中多添加黄粉虫粉末一种原料即可实现明显免疫效果，可行性强，极大地提高了工作效率。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110> 斯澳生物科技（苏州）有限公司

<120> 一种石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白的制备方法及其应用

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<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggtacgca aaggtgagaa gaaattggca aaacccgcga cccgcgggaa tccgcaaccc 60

cgccgacgtg ctaacaatcg tcggcgtagt aatcgcactg acgcacctgt gtctaaggcc 120

tcgactgtaa ctggatttgg acgtgggacc aatgacgtcc atctctcagg tatgtcgaga 180

atctcccagg ccgtcctccc agccgggaca ggaacagacg gatacgttgt tgttgacgca 240

accatcgtcc ccgacctcct gccacgactg ggacacgctg ctagaatctt ccagcgatac 300

gctgttgaaa cactggagtt tgaaattcag ccaatgtgcc ccgcaaacac gggcggtggt 360

tacgttgctg gcttcctgcc tgatccaact gacaacgatc acaccttcga cgcgcttcaa 420

gcaactcgtg gtgcagtcgt tgccaaatgg tgggaaagca gaacagtccg acctcagtac 480

acccgcacgc tcctctggac ctcgtcggga aaggagcagc gtctcacgtc acctggtcgg 540

ctgatactcc tgtgtgtcgg caacaacact gatgtggtca acgtgtcagt gctgtgtcgc 600

tggagtgttc gactgagcgt tccatctctt gagacacctg aagagaccac cgctcccatc 660

atgacacaag gttccctgta caacgattcc ctttccacaa atgacttcaa gtccatcctc 720

ctaggatcca caccactgga cattgcccct gatggagcag tcttccagct ggaccgtccg 780

ctgtccattg actacagcct tggaactgga gatgttgacc gtgctgttta ttggcacctc 840

aagaagtttg ctggaaatgc tggcacacct gcaggctggt ttcgctgggg catctgggac 900

aacttcaaca agacgttcgc agatggcgtt gcctactact ctgatgagca gcctcgtcaa 960

atcctgctgc ctgttggcac tgtctgcact taa 993

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> 石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白

<400> 2

Met Val Arg Lys Gly Glu Lys Lys Leu Ala Lys Pro Ala Thr Arg Gly

1 5 10 15

Asn Pro Gln Pro Arg Arg Arg Ala Asn Asn Arg Arg Arg Ser Asn Arg

20 25 30

Thr Asp Ala Pro Val Ser Lys Ala Ser Thr Val Thr Gly Phe Gly Arg

35 40 45

Gly Thr Asn Asp Val His Leu Ser Gly Met Ser Arg Ile Ser Gln Ala

50 55 60

Val Leu Pro Ala Gly Thr Gly Thr Asp Gly Tyr Val Val Val Asp Ala

65 70 75 80

Thr Ile Val Pro Asp Leu Leu Pro Arg Leu Gly His Ala Ala Arg Ile

85 90 95

Phe Gln Arg Tyr Ala Val Glu Thr Leu Glu Phe Glu Ile Gln Pro Met

100 105 110

Cys Pro Ala Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Val Ala Gly Phe Leu Pro Asp

115 120 125

Pro Thr Asp Asn Asp His Thr Phe Asp Ala Leu Gln Ala Thr Arg Gly

130 135 140

Ala Val Val Ala Lys Trp Trp Glu Ser Arg Thr Val Arg Pro Gln Tyr

145 150 155 160

Thr Arg Thr Leu Leu Trp Thr Ser Ser Gly Lys Glu Gln Arg Leu Thr

165 170 175

Ser Pro Gly Arg Leu Ile Leu Leu Cys Val Gly Asn Asn Thr Asp Val

180 185 190

Val Asn Val Ser Val Leu Cys Arg Trp Ser Val Arg Leu Ser Val Pro

195 200 205

Ser Leu Glu Thr Pro Glu Glu Thr Thr Ala Pro Ile Met Thr Gln Gly

210 215 220

Ser Leu Tyr Asn Asp Ser Leu Ser Thr Asn Asp Phe Lys Ser Ile Leu

225 230 235 240

Leu Gly Ser Thr Pro Leu Asp Ile Ala Pro Asp Gly Ala Val Phe Gln

245 250 255

Leu Asp Arg Pro Leu Ser Ile Asp Tyr Ser Leu Gly Thr Gly Asp Val

260 265 270

Asp Arg Ala Val Tyr Trp His Leu Lys Lys Phe Ala Gly Asn Ala Gly

275 280 285

Thr Pro Ala Gly Trp Phe Arg Trp Gly Ile Trp Asp Asn Phe Asn Lys

290 295 300

Thr Phe Ala Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Glu Gln Pro Arg Gln

305 310 315 320

Ile Leu Leu Pro Val Gly Thr Val Cys Thr

325 330

<210> 3

<211> 999

<212> DNA

<213> 已公布的一段石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因

<400> 3

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