本发明属于农业生物
技术领域：
，涉及一种植物组织培养技术生产莼菜幼苗的方法，具体涉及以植物组培技术为手段，通过在特定的培养基上培养莼菜茎段，完成增殖和生根培养，以获得大量再生植株的方法。
背景技术：
：莼菜(Watershield)是睡莲科(Nymphaeaceae)、莼菜属植物(BraseniaschreberiJFGmel)，多年生水生草本植物，中国稀有，世界也属珍品，是我国国家Ⅰ级重点保护野生植物(国务院1999年8月4日批准)。中国黄河以南、湖北西部利川及重庆市石柱县所有沼泽池塘都有生长。采其尚未透露出水面的嫩叶食用，是一种地方名菜，古人所谓“莼鲈风味”中的“莼”，就是指的这个菜。莼菜营养丰富，含有功能性多糖、蛋白质、脂肪、氨基酸、没食子酸、多种维生素和矿物质等。据研究表明，莼菜中总糖含量39.9％(干物质)、总蛋白含量31.2％(干物质)。莼菜酸性多糖含量最高，主要有D-半乳糖(30％-40％)、D-甘露糖(10％-14％)、L-岩藻糖(13％-16％)、L-鼠李糖(6％-9％)、D-葡萄糖(19％-29％)等组成，并已测明莼菜中18种氨基酸的含量均衡，维生素齐全，且VE、VP含量较高，微量元素含量均高于其他蔬菜，其中以锌含量为最高，有“植物锌王”之称，是天然的补锌食品。莼菜不但是一种味道鲜美的水生蔬菜，而且还具有很高的药用价值。据《本草纲目》记载，食莼具消渴、热脾、冷补下气、止呕、正泻、消炎、解毒之功效，富含多种人体所须氨基酸，营养丰富，历史上曾为皇家贡品。目前世界上除日本秋田县有少量莼菜种植外，国际市场上的莼菜主要产自我国。杭州的西湖和雷波县的马湖，湖北省利川市和重庆石柱县黄水镇等地生产的莼菜闻名于世，其中重庆石柱因其栽培面积、年均产量、品牌效益，在莼菜基地中居于首位。自上世纪90年代起，石柱从各地引种栽培莼菜，距今已达20余年时间，栽培区域内出现严重的品种退化现象，大面积换种势在必行，急需大批莼菜种苗供给。植物组织培养是指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生植株的技术。利用组培技术对莼菜进行离体繁殖，可加快良种繁殖速度，扩大种源生产，保持优良品种的性状，在时间、空间及原料等方面具有显著优势。这种组培繁育方式为莼菜的产业发展开拓了一条有效途径，具有极大的社会效益和经济效益。目前还未见植物组织培养技术应用于莼菜种苗繁育生产的方案报道。技术实现要素：因此，本申请的发明人系统地研究植物组织培养技术应用于莼菜种苗繁育生产的理论、工艺及可行性，对外植体选取、无菌体系建立、增殖、生根以及炼苗移栽等过程进行了考察，建立了一套快速、经济的莼菜组培快繁技术，且完成了对石柱、杭州、利川、雷波四产区莼菜的扩繁，获得大量优质莼菜幼苗，有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物组织培养技术生产莼菜幼苗的方法，该方法能高效稳定扩繁莼菜，达到工厂化生产水平。抗污染剂S106也称高效抗污杀菌剂S106，是一种长效、广谱、高活性植物组培专用防污染杀菌剂。具有用量少、使用方便、操作安全、配伍性好，其活性成分对环境无残留。不破坏培养基活性成分，耐高压灭菌，使用成本低。可有效降低瓶苗废弃率，降低组培成本，提高组培效益。通过市售渠道获得。为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种促进莼菜外植体增殖的培养基，所述培养基是在MS培养基中添加IBA和6-BA所得，所述培养基中IBA的含量为0.05-5.0mg·L-1，6-BA的含量为0.02-5.0mg·L-1。所述MS培养基的配方如下：组成成分数量(mg/L)组成成分数量(mg/L)组成成分数量(mg/L)NH4NO31650KN031900CaCl2.2H2O440MgSO4.7H2O370KH2PO4170KI0.83H3BO36.2MnSO4.4H2O22.3ZnSO4.7H2O8.6NaMoO4.2H2O0.25CoCl2.6H2O0.025Na2-EDTA37.3FeSO4.7H2O27.8CuSO4.5H2O0.025蔗糖300肌醇100.0烟酸0.5盐酸吡哆醇0.5甘氨酸2.0盐酸硫胺0.4进一步，所述的一种促进莼菜外植体增殖的培养基，所述培养基中还添加有质量百分数为0.2％的抗污染剂S106。S106是由A、B两种成分组成的一种植物组织培养中常用的抗污杀菌剂。S106A为白色粉末，S106B为液体(有结晶)，S106母液的配制：先把S106A用350毫升左右无菌水充分溶解，再把S106B开瓶前摇匀，再打开瓶盖倒入其中，再用无菌水洗瓶二次倒入。充分溶解后用无菌水定容至500毫升，瓶装低温贮藏。进一步，所述的一种促进莼菜外植体增殖的培养基，优选的，所述IBA的含量为0.5mg·L-1，6-BA的含量为3.0mg·L-1。进一步，所述的一种促进莼菜外植体增殖的培养基，所述莼菜外植体为带芽的莼菜茎段。优选的，所述莼菜外植体为2-3年生莼菜成熟植株的带芽幼嫩茎段。一种植物组织培养技术生产莼菜幼苗的方法，以权利要求1或2所述的培养基作为诱导培养基和增殖培养基，包括如下进行的步骤：(1)外植体的准备选择莼菜植株带芽的茎段，清洗灭菌后切成1.0cm-1.5cm短枝，备用；(2)初代和继代培养将步骤(1)所得的短枝接入所述的诱导培养基上，进行初代增殖培养，待萌芽后转接入所述的增殖培养基上进行继代增殖培养；所述初代增殖培养和继代增殖培养的培养条件均为：温度25℃±2，光照强度1500-2500Lux，光照时间12小时/天；(3)生根培养步骤(2)中，待继代增殖培养40-45天后，将得到的组培苗直接转到生根培养基上进行生根培养，所述生根培养的培养条件为：温度25℃±2，光照强度1500-2500Lux，光照时间12小时/天；所述生根培养基是在1/2MS培养基中添加IBA和6-BA所得，所述生根培养基中IBA的含量为0.05-5.0mg·L-1，6-BA的含量为0.02-5.0mg·L-1；(4)炼苗移栽将步骤(3)生根培养所得的莼菜生根幼苗移栽到大田中培育，获得莼菜无性株系。进一步，所述的一种植物组织培养技术生产莼菜幼苗的方法，所述步骤(3)中，所述的生根培养基中还添加有质量百分数为0.2％的抗污染剂S106。进一步，所述的一种植物组织培养技术生产莼菜幼苗的方法，所述的诱导培养基、增殖培养基和生根培养基的pH值均为5.8±0.2。进一步，所述的一种植物组织培养技术生产莼菜幼苗的方法，所述步骤(1)中，清洗灭菌的方法为：用自来水快速冲洗8-10min，然后利用1g.L-1的HgCl2灭菌5-8min，再用无菌水清洗4-5次，每次2min。进一步，所述的一种植物组织培养技术生产莼菜幼苗的方法，所述步骤(2)中，初代增殖培养周期为25±2天，继代增殖培养周期为40-45天。进一步，所述初代增殖培养、继代增殖培养、生根培养的培养条件均优选为：温度25℃±2，光照强度2000Lux，光照时间12小时/天。本发明的有益效果：本发明的一种植物组织培养技术生产莼菜幼苗的方法即莼菜离体快繁的方法，通过外植体的合理选择，增殖和继代培养基的选择、增殖和继代培养条件的控制；生根培养基的选择和生根条件的控制，培养得到莼菜无性株系。本发明的方法外植体的污染率控制在8％以下，莼菜的再生率达到96％以上，生根率100％，显著提高了莼菜组培苗的数量和质量。该方法顺应现今中国莼菜基地莼菜种苗大量匮乏的市场需要，具有生产成本低、不污染环境，基本达到工厂化生产水平，发展前景良好。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。以下实施例中，莼菜品种分别来自重庆石柱、浙江杭州、四川雷波、湖北利川。MS培养基的配制：(1)先在烧杯中放入一些蒸馏水；(2)分别取上面所提物品按相应配置比例加入；(3)一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解；(4)加蒸馏水用量筒定溶至1L；(5)按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要(所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差)；(6)用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。(有条件的话使用酸度计，比较精确)可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值；(1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。1当量NaOH配制：称取NaOH4g配成100ml溶液。)(7)称取5g左右琼脂粉(质量好的琼脂粉)，倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化；(8)稍微冷却后，分装入培养容器中；无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧；(9)放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右；(10)灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。实施例1莼菜组织培养方法以重庆石柱的莼菜品种为原材料。组织培养方法具体包括如下步骤：(1)外植体的准备选择3年生成熟莼菜植株带芽的幼嫩茎段，用自来水快速冲洗8min，利用1g.L-1的HgCl2灭菌5min，无菌水清洗4-5次，每次2min，切成1.0cm-1.5cm短枝，备用；(2)初代和继代培养将步骤(1)所得的短枝接入所述的诱导培养基上，进行初代增殖培养，培养25天后生出不定芽，转接入所述的增殖培养基上进行继代增殖培养；所述初代增殖培养和继代增殖培养的培养条件均为：温度25℃±2，光照强度2000Lux，光照时间12小时/天；诱导培养基为MS+IBA0.5mg·L-1+6-BA3.0mg·L-1，pH值为5.8，增殖培养基为MS+IBA0.5mg·L-1+6-BA3.0mg·L-1，pH值为5.8；(3)生根培养步骤(2)中，待继代增殖培养40天后，统计增殖数，将得到的组培苗直接转到生根培养基上进行生根培养，所述生根培养的培养条件为：温度25℃±2，光照强度2000Lux，光照时间12小时/天；所述生根培养基是在1/2MS培养基中添加IBA和6-BA所得，所述生根培养基中IBA的含量为0.5mg·L-1，6-BA的含量为3.0mg·L-1，pH值为5.8；生根培养50天，以苗高5-6cm、根长在4cm左右，有2-3条粗壮的白色根计数，统计生根率；(4)炼苗移栽将步骤(3)生根培养所得的莼菜生根幼苗移栽到大田中培育，获得莼菜无性株系。按照本实施例的方法，莼菜增殖数为11.7，增殖率为90.5％，生根率为94％。实施例2莼菜组织培养方法以重庆石柱的莼菜品种为原材料。组织培养方法具体包括如下步骤：(1)外植体的准备选择3年生成熟莼菜植株带芽的幼嫩茎段，用自来水快速冲洗8min，利用1g.L-1的HgCl2灭菌5min，无菌水清洗4-5次，每次2min，切成1.0cm-1.5cm短枝，备用；(2)初代和继代培养将步骤(1)所得的短枝接入所述的诱导培养基上，进行初代增殖培养，培养25天后生出不定芽，转接入所述的增殖培养基上进行继代增殖培养；所述初代增殖培养和继代增殖培养的培养条件均为：温度25℃±2，光照强度2000Lux，光照时间12小时/天；诱导培养基为MS+IBA0.5mg·L-1+6-BA3.0mg·L-1，pH值为5.8，增殖培养基为MS+IBA0.5mg·L-1+6-BA3.0mg·L-1，pH值为5.8；同时在诱导培养基和增殖培养基中分别添加质量百分数为0.2％的抗污染剂S106；(3)生根培养步骤(2)中，待继代增殖培养40天后，统计增殖数，将得到的组培苗直接转到生根培养基上进行生根培养，所述生根培养的培养条件为：温度25℃±2，光照强度2000Lux，光照时间12小时/天；所述生根培养基是在1/2MS培养基中添加IBA和6-BA所得，所述生根培养基中IBA的含量为0.5mg·L-1，6-BA的含量为3.0mg·L-1，同时添加质量百分数为0.2％的抗污染剂S106，pH值为5.8；生根培养50天，以苗高5-6cm、根长在4cm左右，有2-3条粗壮的白色根计数，统计生根率；(4)炼苗移栽将步骤(3)生根培养所得的莼菜生根幼苗移栽到大田中培育，获得莼菜无性株系。按照本实施例的方法，莼菜增殖数为12.4，增殖率为96％，生根率为100％。本实施例为优选的方案(实施例1为不添加抗污染剂S106，实施例2为添加抗污染剂S106，这两个进行对比。),本申请发明人同时对诱导培养基、增殖培养基和生根培养基中添加的激素IBA、6-BA的量进行了摸索，诱导培养基和增殖培养基中，IBA的含量在0.05-5.0mg·L-1范围内，6-BA的含量在0.02-5.0mg·L-1范围内均可促进增殖；生根培养基中，IBA的含量在0.05-5.0mg·L-1范围内，6-BA的含量在0.02-5.0mg·L-1范围内均可促进生根，在此不一一累述。实施例3不同产区莼菜的组织培养莼菜品种分别来自重庆石柱、浙江杭州、四川雷波、湖北利川，选择2-3年生成熟莼菜植株带芽的幼嫩茎段，按照实施例2中外植体的准备步骤进行处理，备用。再分别取准备好的外植体按照实施例2记载的优选方案进行组织培养，统计结果，结果见表1。表1不同产地莼菜茎段组织培养的增殖与生根的比较结果产地增殖数增殖率生根率重庆石柱12.896.3100四川雷波13.096.5100浙江杭州13.396.8100湖北利川12.596.1100由表1可知，按照本发明的方法对4个不同产地莼菜的茎段进行组织培养，外植体平均再生芽数为12.5％以上，平均再生率在96％以上，生根率均达到100％，得到的莼菜组培苗的数量和质量较高，基本达到工厂化生产水平，本发明的方法生产成本低，不污染环境，发展前景良好。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页1 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