一株富磷和降解有机磷农药的Lysinibacillusmacroides及应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一株具有富磷、降解有机磷农药的赖氨酸芽孢杆菌属的Lysinibacillusmacroides及应用。
背景技术：
：随着多相分类学的发展和应用，芽孢杆菌属（Bacillussp.)的分类情况发生了很大的变化，许多种从芽孢杆菌属中分离出来归为其它属或者另建新属。赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillussp.）是近年来从芽孢杆菌属（Bacillussp.)分离出来的新属，因其具有独特的细胞壁肽聚糖构型A4α-type(L-Lys-D-Asp)，而将其与芽孢杆菌属（Bacillussp.)区别开来。赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussp.）分类地位为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Bacillales；Bacillaceae；Lysinibacillus。该属的菌种分离自土壤、河床底泥、造纸废水、雌性小鼠肠道、人类脑脊髓液、胡杨林胡杨茎秆液、潮滩沉积物，锰矿厂等各种环境，这些菌株来源不同，功能也体现在不同的方面。目前Lysinibacillus属包括16个被描述的种：L.bronitoleram，L.sphaericus，L.fusiformis，L.parviboronicapiens，L.xylanilyticus，L.massiliensis，L.odysse，L.sinduriensis，L.macroides，L.mangiferihumi，L.meyeri，L.contaminans，L.chungkukjangi，L.manganicus，L.pakistanensis，L.tabacifolii。赖氨酸芽孢杆菌属的所有菌种共同特点为菌体呈杆状，能够产生芽孢，主要脂肪酸类型为iso-C15:0或者anteiso-C15:0，主要呼吸醌类型为MK-7，细胞壁肽聚糖含有赖氨酸和天冬氨酸，DNA中（G+C）%含量占35-38%。Lysinibacillus属的菌株的极性脂组分有双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷酸类脂(PL)。目前，国内外研究者报道过一些关于Lysinibacillus属一些菌株的生物作用的研究，主要集中在降解废水中的染料，如专利CN103937697A；产生胞外蛋白酶和胞内酯酶如氨基甲酸乙酯水解酶，如专利CN103013948A；用于环境中还原六价铬离子，如专利CN103395893A；降解石化废水中的负二价硫离子，如专利CN102827786A；溶解或感染蓝藻，如专利CN102965298A；降解有毒物质多溴联苯醚，如专利CN102363756A；而关于Lysinibacillus属降解有机磷农药方面的研究却鲜有报道，仅有少量文献涉及到。NivethaMohan等人曾应用Lysinibacillusfusiformis处理有机磷农药高灭灵，并取得较好的效果。滕春红等人从生产2,4-滴丁酯的农药厂排污口采集污泥样品，驯化分离得到1株能够以2,4-滴丁酯为唯一碳源和能源生长的细菌LysinibacillusfusiformisT2，并能耐受高浓度的2,4-滴丁酯。本研究的LysinibacillusmacroidesMEW88不仅能高效降解低浓度有机磷农药乐果和草甘膦，而且还能吸附废水中的无机磷，因此将其应用于磷化工污染环境的治理具有重要的现实意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株具有富磷、降解有机磷农药的赖氨酸芽孢杆菌属的LysinibacillusmacroidesMEW88，并且该菌是首次在降解有机磷农药（草甘膦、乐果）方面中的报道。本发明的LysinibacillusmacroidesMEW88已于2016年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCCNO：M2016574，保藏单位地址，中国武汉武汉大学。本发明LysinibacillusmacroidesMEW88的形态学和生理生化特征：在LB固体培养基，28℃条件下培养48h，该菌菌落圆形，偏淡黄色，不透明，表面平坦，边缘有一圈半透明刺突状，菌落直径2-4mm，在显微镜下观察菌株细胞形态为杆状，产生芽孢，革兰氏阳性，穿刺实验显示穿刺线边缘模糊，证明该菌具有运动性，该菌氧化酶阴性、硝酸盐还原阴性、精氨酸水解酶阴性、不能水解酪蛋白、明胶和尿素。本发明LysinibacillusmacroidesMEW88的分子生物学鉴定方法为：采用16srDNA通用引物27F和1492R以LysinibacillusmacroidesMEW88基因组作为模板扩增其16srDNA序列，将PCR产物直接送到武汉擎科创新生物科技有限公司测序，得到如序列表所示的16srDNA序列。将该序列与EzTaxon-e中序列进行同源比对分析，结果发现LysinibacillusmacroidesMEW88与LysinibacillusmacroidesLMG18474(T)的序列相似性为99.59%，与LysinibacillussphaericusKCTC3346(T)的序列相似性为98.28%，与LysinibacillusmangiferihumiM-GX18(T)的序列相似性为97.86%，并调聚与该菌株同源性的典型菌株序列，用MEGA6.0(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis)软件采用邻接法(Neighbor-Joining)聚类分析，构建出系统进化树，如图2。综合上述形态学、生理生化特征、分子分类学结果，将MEW88鉴定为Lysinibacillusmacroides，该菌株已于2016年10月18日保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCCNO：M2016574。本发明提供的赖氨酸芽孢杆菌是通过如下的方法分离得到：采集宜昌某磷化工厂附近的土样及水样，称取2g土样及水样于100mLLB培养液中富集培养。将菌悬液按10%（V/V）的接种量接种于含有机磷农药的发酵培养基，逐步提高农药的浓度，直至驯化稳定后，划线于无机盐培养基，挑取平板中生长快速和旺盛的菌4株，接种于含有机磷农药的发酵培养基中，采用乙酰胆碱酶抑制率法（GB/T5009.199-2003）测定有机磷农药含量，从而筛选出本发明的赖氨酸芽孢杆菌，记为MEW88。本发明提供的LysinibacillusmacroidesMEW88在吸附无机磷方面具有很好的应用。具体做法是：将上述筛选得到的LysinibacillusmacroidesMEW88按10%（V/V）的接种量接种到PAM培养基（含磷量（以P计）分别为10mg/L、20mg/L）中，在28℃，150rpm的条件下摇瓶培养，于0、12、24、48、72h取样，测定上清液中无机磷含量（GB11893-89-钼锑抗比色法）。本发明提供的LysinibacillusmacroidesMEW88在降解有机磷农药乐果、草甘膦中的应用。具体做法是：将纯化后的LysinibacillusmacroidesMEW88接种于LB培养基28℃过夜活化，调节菌液OD600为2.0，按4%-10%（V/V）的接种量转接至含不同浓度草甘膦或乐果的发酵培养基培养，于1d、2d、3d、5d、7d取样测定有机磷农药降解率（GB/T5009.199-2003）。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明提供的LysinibacillusmacroidesMEW88同时具有吸附无机磷和降解有机磷的功能，因此，可直接应用于磷化工废水的处理中。一方面，该菌能降解废水中的有机磷，且对低浓度有机磷农药具有极高的降解效率；另一方面，该菌能吸收废水中的无机磷，这样避免产生无机磷污染，可减少水体富营养化的可能。因此，该菌在磷化工废水中有着良好的应用前景。（2）本发明首次将LysinibacillusmacroidesMEW88应用于有机磷农药草甘膦和乐果降解，这为有机磷农药降解提供一种新的思路，同时也为以后的研究打下坚实的基础。附图说明图1(A)为LysinibacillusmacroidesMEW88菌落形态、图1(B)为芽孢染色(400×)图。图2为LysinibacillusmacroidesMEW88菌株的16SrDNA基因序列系统发育树。图3为LysinibacillusmacroidesMEW88随时间的变化对不同浓度乐果的降解率。图4为LysinibacillusmacroidesMEW88随时间的变化对不同浓度草甘膦的降解率。具体实施方式以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但本发明的内容不仅仅局限于实施例所述的范围，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。实施例1LysinibacillusmacroidesMEW88分离及鉴定采集宜昌某磷化工厂附近的土样及水样，称取2g土样及水样于100mLLB培养液中，在28℃150r/min的条件下富集培养3d，LB培养基配方如下：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，水1L，pH7.0-7.2。将上述菌悬液按10%（V/V）的接种量接种于含草甘膦和乐果的发酵培养基（蛋白胨2g/L，酵母提取物1g/L，NaCl2g/L，水1L，pH7.0-7.2），28℃，150r/min富集培养7d后，转接至相同培养基，在相同条件下继续培养驯化，在传代驯化过程中逐步提高草甘膦和乐果含量，直到其浓度为800mg/L；将驯化稳定的菌液划线于无机盐培养基（glucose10.0g，（NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，MgSO4•7H2O0.3g，FeSO4•7H2O0.03g，MnSO4•4H2O0.03g，草甘膦200mg/L，乐果200mg/L，水1L），28℃，倒置培养5d，挑取平板中生长快速和旺盛的菌落4株，接种于含草甘膦和乐果50mg/L农药的发酵培养基中，28℃，150r/min培养3d，采用乙酰胆碱酶抑制率法（GB/T5009.199-2003）测定有机磷农药含量，得到一株高效降解有机磷农药的菌株，将其命名为：MEW88，即为本专利菌株。以MEW88基因组为模板，使用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3’）扩增16SrDNA序列（见序列表）。将该序列与EzTaxon-e中序列进行同源比对分析，结果发现MEW88与LysinibacillusmacroidesLMG18474(T)的序列相似性为99.59%，与LysinibacillussphaericusKCTC3346(T)的序列相似性为98.28%，与LysinibacillusmangiferihumiM-GX18(T)的序列相似性为97.86%。在进化上，MEW88与LysinibacillusmacroidesLMG18474(T)靠的最近。本发明LysinibacillusmacroidesMEW88的形态学和生理生化特征：在LB固体培养基，28℃条件下培养48h，该菌菌落圆形，偏淡黄色，不透明，表面平坦，边缘有一圈半透明刺突状，菌落直径2-4mm，在显微镜下观察菌株细胞形态为杆状，产生芽孢，革兰氏阳性，穿刺实验显示穿刺线边缘模糊呈雾状向外扩散证明该菌具有运动性，该菌氧化酶阴性、硝酸盐还原阴性、精氨酸水解酶阴性、不能水解酪蛋白、明胶和尿素。综合上述形态学、生理生化特征、分子分类学结果，将MEW88鉴定为Lysinibacillusmacroides。实施例2LysinibacillusmacroidesMEW88富磷试验取实施例1中LysinibacillusmacroidesMEW88在28oC150r/min的条件下过夜活化，活化后的菌液离心，去上清，沉淀用灭菌PBS（pH7.2）洗涤1次，重悬后调节菌液浓度为OD600=1.0。将上述菌悬液按10%（V/V）的接种量接种于含磷量（以P计）为10mg/L、20mg/L的200mLPAM培养基，在28℃，150rpm的条件下摇瓶培养，于0、12、24、48、72h取样，经8000r/min离心10min后，测定上清液无机磷含量（GB11893-89-钼锑抗比色法）。所述PAM培养基组分为：Na3C6H5O74.0g/L，NaCl0.5g/L，(NH4)2SO42.5g/L，CaCl20.25g/L，MgSO40.25g/L，KH2PO40.0878g/L(磷含量20mg/L)，麦芽糖0.01g/L，水1L，pH7.2。富磷实验结果见表1，从表中可知，当磷含量为10mg/L时，经MEW88处理24h，培养基中磷去除率基本达到100%，上清液检测不到无机磷，达到国家一级排放标准（废水中P含量低于0.5mg/L）。当磷含量为20mg/L时，MEW88培养36h时富磷率也达到78.71%，培养基中上清液无机磷浓度由20mg/L降到4.24mg/L，此结果表明MEW88不仅能高效快速的去除低浓度废水中的无机磷，对高浓度也有较好的除磷效果。表1LysinibacillusmacroidesMEW88MEW88在PAM培养基培养时富磷率（%）随时间变化培养基磷含量12h24h32h48h72hP:10mg/L49.36±0.78100.84±0.82100.40±1.07100.32±0.6299.65±0.96P:20mg/L12.16±0.0771.30±0.8578.71±1.0976.24±0.972.33±0.75实施例3LysinibacillusmacroidesMEW88对不同浓度乐果降解效果试验取实施例1中LysinibacillusmacroidesMEW88过夜活化后，用PBS（pH7.2-7.4）洗涤菌体1次，重悬后调节菌液OD600为2.0，然后按4%（V/V）的接种量转接至含不同浓度乐果（50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、）的发酵培养基培养，定时取样测定有机磷农药降解率，结果如图3。从图3中可以看出，MEW88具有较高的乐果降解能力，尤其是低浓度50mg/L的乐果，第5天菌株降解率已达到97.5%，第7天基本检测不到乐果。因此，该菌在乐果脱毒和降低环境污染等方面具有良好的应用价值。实施例4LysinibacillusmacroidesMEW88对不同浓度草甘膦降解效果试验取实施例1中LysinibacillusmacroidesMEW88在28℃，150r/min的条件下过夜活化，用PBS（pH7.2-7.4）洗涤菌体1次，重悬后调节菌液浓度OD600为2.0。将上述菌液按4%-10%的接种量转接至含草甘膦25mg/L或者50mg/L的发酵培养基培养，定时取样测定草甘膦降解率。结果表明MEW88处理低浓度的草甘膦不仅快速而且高效，当草甘膦浓度为25mg/L时，经过MEW88处理二天，草甘膦几乎完全被降解，具体结果见图4。MEW88对于处理物化方法难以消除的低浓度草甘膦污染更具有应用优势。<110>湖北大学<120>一株富磷和降解有机磷农药的Lysinibacillusmacroides及应用<160>3<210>1<211>1450<212>DNA<213>LysinibacillusmacroidesMEW88<400>1cactcttccaccttcggcggctggctccaaaaggttacctcaccgacttcgggtgttaca60aactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatg120ctgatccgcgattactagcgattccggcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccga180actgagaacgactttatcggattagctccctctcgcgagttggcaaccgtttgtatcgtc240cattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccac300cttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactaaatgatggcaactaa360gatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgac420aaccatgcaccacctgtcaccgttgcccccgaaggggaaactatatctctacagtggtca480acgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctcca540ccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccag600gcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagca660ctcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcg720cgcctcagcgtcagttacagaccagaaagtcgccttcgccactggtgttcctccaaatct780ctacgcatttcaccgctacacttggaattccactttcctcttctgcactcaagtccccca840gtttccaatgaccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagacttaaaggaccgcc900tgcgcgcgctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggc960tgctggcacgtagttagccgtggctttctaataaggtaccgtcaaggtacagccagttac1020tactgtacttgttcttcccttacaacagagttttacgatccgaaaaccttcttcactcac1080gcggcgttgctccatcaggctttcgcccattgtggaagattccctactgctgcctcccgt1140aggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgc1200atcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggcccatccta1260tagcgacagccgaaaccgtctttcagtctttcaccatgaagcaaaagagattattcggta1320ttagccccggtttcccggagttatcccaaactatagggtaggttgcccacgtgttactca1380cccgtccgccgctaacgtcaaaggagcaagctccttttctgttcgctcgacttgcattat1440aggcacgccg1450<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2agagtttgatcatggctcag20<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>3ggtaccttgttacgactt18当前第1页1 2 3