本发明涉及一种米根霉菌株及用其制备高活力固体菌剂的方法，属于米根霉的应用
技术领域：
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背景技术：
：L-乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药、农业和化工中，利用L-乳酸制备的聚L-乳酸是一种新型的可生物降解材料。细菌发酵和真菌发酵是发酵生产L-乳酸的主要方法，其中米根霉具有营养要求简单、生长迅速、环境适应能力强、分泌有机酸及淀粉酶的能力强、可进行同步糖化发酵、产酸光学纯度高等优点，是工业化生产最有潜力的菌株之一。米根霉目前主要被广泛应用于生物防治领域，其发酵生产工艺是以生产米根霉孢子为目的的，所制备的米根霉菌剂也是以孢子菌剂为主。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种米根霉菌株，其生长迅速、环境适应能力强，具有高产L-乳酸的能力；同时本发明提供了一种利用米根霉菌株制备高活力固体菌剂的方法，简单易行，成本低，便于工业化生产，具有良好的市场应用前景。本发明所述的米根霉菌株，该菌株为拟青霉(Paecilomyces)属中的米根霉菌株HP25-3#，该米根霉菌株已于2016年1月18日，保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为米根霉(Rhizopusoryzae)，保藏编号为CGMCCNo.12078。米根霉菌株是从山东省淄博市沂源县大张庄镇被禾谷孢囊线虫(Heteroderaavenae)侵染的小麦根部土壤中采用PDA平板根据菌落形态初筛及摇瓶发酵根据L-乳酸产量复筛的方法所得的高产孢菌株。所述的米根霉菌株，是利用通用引物PCR扩增该菌的ITSrRNA基因，得到所述的3#菌株的ITSrRNA基因序列614bp，应用BLAST程序与数据库中的已有真菌ITSrRNA序列进行相似性比较分析，3#菌株的基因序列与米根霉HP25相似性为99％。所述的利用米根霉菌株制备高活力固体菌剂的方法，包括以下步骤：(1)液体种子培养：将米根霉3#接种到液体种子培养基中，培养后获得种子培养液；(2)静置发酵：将步骤(1)所得的种子培养液接种到固体发酵培养基中，发酵培养；(3)发孢培养：将步骤(2)所得的固体发酵产物转移至浅盘进行发孢培养，继续培养40-48h后孢子成熟；(4)低温烘干：将步骤(3)所得的发酵产物移至低温烘干室进行烘干，得到固体菌剂，其水分质量百分含量为6-8％；(5)磨料制粉：将步骤(4)所得的菌剂进行研磨，磨料机筛孔不低于120目。所述液体培养基由以下重量百分含量的原料制成：葡萄糖1-10％，麸皮0.5-5％，玉米浆0.1-0.5％。通过调节初始阶段玉米浆的添加浓度0.1-0.5％，可以控制米根霉菌球直径为2.0～2.5mm。步骤(1)中，米根霉3#与液体种子培养基的装液量体积之比为1:4～6。步骤(1)中，26-30℃、130-170rpm下培养34-38h。所述固体发酵培养基由以下重量百分含量的原料制成：果渣30-50％，麸皮50-70％，碳酸钙0.01-1％。步骤(2)中，温度为26-30℃，发酵时间为24-60h。步骤(4)中，32-35℃下烘干24-36h。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)所述的米根霉菌株，生长迅速、环境适应能力强，具有高产L-乳酸的能力；(2)所述米根霉菌株所用的培养基配方成本较低，易于配制；(3)所述利用米根霉菌株制备高活力固体菌剂的方法，简单易行，成本低，便于工业化生产，具有良好的市场应用前景；(4)制得的高活力固体菌剂，孢子数＞1011个/g，中温淀粉酶活力在1200U/g以上，可用于乳酸发酵行业；(5)制得的高活力固体菌剂，用于强化食醋发酵过程，可有效增加生产食醋中的总酸及部分有机酸，且所生产食醋口感更柔和。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不限制本发明的实施。实施例1米根霉菌株的筛选与鉴定：1、配制PDA固体培养基：经高压灭菌后倒入培养皿中，制成平板平放冷却。平板放在30度左右恒温箱中培养3-5天备用。PDA固体培养基成分为：切碎的土豆20％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，pH自然；2、以无菌方法称取1g土壤样品，研磨，加入装有100mL灭菌生理盐水带玻璃珠的三角瓶中充分摇振溶解，取上清液用无菌水102、103、104稀释。稀释至合适的稀释度吸入平板后用涂布棒均匀涂抹，完成后放入33-34℃培养箱内倒置培养5-7天。3、筛选菌株：初筛：从培养平板中挑选菌落大、菌丝稠密、孢子较多的单个菌落移接到斜面培养基上再进行培养，使其充分生长。复筛：将初筛获得的菌种接入摇瓶，装液量20％，28℃，150rpm条件下培养48h后测定发酵液L-乳酸含量。复筛所用的培养基成分：葡萄糖2％，蛋白胨1％，玉米浆0.5％，K2HPO4·3H2O0.03％、KH2PO40.04％、MgCl2·6H2O0.01％，pH自然。经过筛选，获得一株高产L-乳酸的米根霉菌株3#，该菌株摇瓶发酵液中L-乳酸产量为73g/L。4、菌株鉴定：根据伯杰式菌种鉴定手册和ITSrDNA基因序列分析对其进行鉴定。测得的ITSrRNA基因序列如下：AGAGCGGGAAGGTATTATTATGTTAAGCGCCTTACCTTAGGGTTTCCTCTGGGGTAAGTGATTGCTTCTACACTGTGAAAATTTGGCTGAGAGACTCAGACTGGTCATGGGTAGACCTATCTGGGGTTTGATCGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGTACCCTTCATAATAAACCTAGAAATTCAGTATTATAAAGTTTAATAAAAAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAGCTTGCACTCTATGGTTTTTCTATAGAGTACGCCTGCTTCAGTATCATCACAAACCCACACATAACATTTGTTTATGTGGTGATGGGTCGCATCGCTGTTTTATTACAGTGAGCACCTAAAATGTGTGTGATTTTCTGTCTGGCTTGCTAGGCAGGAATATTACGCTGGTCTCAGGATCTTTTTTTTTGGTTCGCCCAGGAAGTAAAGTACAAGAGTATAATCCAGTAACTTTCAAACTATGATCTGAAGTCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAA利用通用引物PCR扩增该菌的ITSrRNA基因，得到上述3#菌株的ITSrRNA基因序列614bp，应用BLAST程序与数据库中的已有真菌ITSrRNA序列进行相似性比较分析，3#菌株的基因序列与米根霉(Rhizopusoryzae)HP25相似性为99％。结合生理生化分析及ITSrRNA序列分析结果，将3#菌株鉴定为米根霉。实施例2米根霉3#高活力固体菌剂的制备：将米根霉3#接种在PDA斜面上，35℃培养7天。在室温条件下，用无菌水洗下斜面上的米根霉孢子，制成104～109个/mL的孢子悬液备用。按照以下步骤制备米根霉固体菌剂：1.液体种子培养基：葡萄糖2％，麸皮1％，玉米浆0.5％；固体培养基：果渣39.8％，麸皮60％，碳酸钙0.2％。2.液体种子培养：将米根霉3#接种到液体种子培养基中，装液量1:5(体积比)，30℃和150rpm条件下培养36h，获得直径区间为2.1mm左右、光滑分散、尺寸均一的米根霉菌球种子液。3.静置发酵：将上述种子培养液接种到固体培养基中，发酵培养温度为30℃，发酵时间为48h；4.发孢培养：将上述固体发酵产物转移至浅盘进行发孢培养，继续培养48h后孢子成熟；5.低温烘干：将上述发酵产物移至低温烘干室，32℃低温烘干30h，菌剂水分8％。6.磨料制粉：磨料机筛孔120目。经检测本实施例所获得的米根霉固体菌剂活孢子数为1.5×1011个/g，中温淀粉酶活力在1450U/g。实施例3米根霉3#强化食醋发酵过程：1、生物强化菌株米根霉预培养，按如下步骤操作：从斜面挑取米根霉菌丝体接种于PDA液体种子培养基，35℃，170rpm的条件下培养72h，获得米根霉一级种子；将米根霉一级种子，按质量分数5％的接种量接种到装有7L液体培养基的10L发酵罐中发酵，发酵条件控制为：温度35℃，通气量控制为2.5L/min，搅拌转速170rpm，压力0.15MPa，培养约72h后获得米根霉二级种子液。2、米根霉强化食醋发酵过程：选取麸皮和大糠为醋醅的主要原料，再与酒醪均匀混合后制备醋醅，具体操作步骤如下：向醋缸中加入130kg酒醪，50kg麸皮，搅拌混匀，加入8kg种醅，喷洒培养基总量(v/w)1％～3％的米根霉发酵液，用手搅拌混匀后，于醅上加盖一层大糠；在醅上适当漂水，加适量稻壳并进行翻醅，待醋醅品温上升至40℃以上，根据品温向下切麸、漂水、加糠、翻醅；过杓开始一两天后，开始分缸，并将水和稻壳全部添加完毕，每天翻醅至醋缸底部；同时每天测定下层卤汁中的总酸和不挥发酸，确定封醅日期，封醅持续时间为7d。醋酸发酵完成后取样，取样时从醋醅的表面垂直取到池底，然后将醋醅混匀。整个醋酸发酵过程为18d，每个发酵理化指标测定时将三个池子取平均值以代表该指标。3、总酸及有机酸含量分析：发酵结束后，取样用HPLC法对醋酸发酵结束醋醅中有机酸的种类和含量进行分析，结果如表1所示。表1采用米根霉强化技术生产的食醋中的特征有机酸含量比较(g/100mL)乙酸乳酸焦谷氨酸琥珀酸对照组4.171.890.150.12米根霉强化组5.152.960.180.11从HPLC分析结果可以看出，采用米根霉强化技术生产的食醋中乳酸含量及总酸含量显著提高。其中，乳酸含量较对照组增加了56.6％；总酸含量较对照组提高了45.7％；乙酸及焦谷氨酸的含量较对照组也分别提高了23.5％和20％；此外，采用米根霉强化技术生产的食醋口感更为柔和纯正。AGAGCGGGAAGGTATTATTATGTTAAGCGCCTTACCTTAGGGTTTCCTCTGGGGTAAGTGATTGCTTCTACACTGTGAAAATTTGGCTGAGAGACTCAGACTGGTCATGGGTAGACCTATCTGGGGTTTGATCGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGTACCCTTCATAATAAACCTAGAAATTCAGTATTATAAAGTTTAATAAAAAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAGCTTGCACTCTATGGTTTTTCTATAGAGTACGCCTGCTTCAGTATCATCACAAACCCACACATAACATTTGTTTATGTGGTGATGGGTCGCATCGCTGTTTTATTACAGTGAGCACCTAAAATGTGTGTGATTTTCTGTCTGGCTTGCTAGGCAGGAATATTACGCTGGTCTCAGGATCTTTTTTTTTGGTTCGCCCAGGAAGTAAAGTACAAGAGTATAATCCAGTAACTTTCAAACTATGATCTGAAGTCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAA当前第1页1 2 3