一株产红青霉菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株产红青霉菌及其应用，具体涉及一株对多种农作物具有促生长作用的产红青霉菌，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：植物内生菌(Endophyte)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。但不像病原菌具有明显的病症，植物内生菌不表现任何明显的症状，并普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生菌。近几十年的研究表明，有些植物内生菌的醇提取物具有促进植物生长、提高抗旱、增加肥料的吸收等作用，引起植物学家们的关注。研究表明，每种野生植物至少有几十种内生菌存在。粗略估计，植物内生菌的种类大约有40万种之多。从植物进化角度分析，植物的多样性也必然导致其内生菌的多样性。所以，这些内生菌极有可能是有价值的化合物的宝库。目前已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。近年来，我国肥料生产和用量一直以较快的速度增长，但土壤退化、肥料利用率低及由此造成的资源、能源和人力极大的浪费一直是我国农业生产面临的巨大问题。青霉属(Penicillium)菌种是一类重要的微生物菌种资源，是微生物多样性的组成部分，其分布范围广泛，常分布于土壤、大气、食物、腐生木材等，与人类生活、研究和生产紧密相关，并为真菌学研究、农业及生物技术产业持续发展提供菌种资源，具有重要的经济意义。产红青霉属于青霉属的一种真菌，目前对其研究较少，已报道该种的国家有英国、美国、比利时、中国，基物包括发霉的哈密瓜、未发酵的葡萄汁、啤酒瓶盖等。对于产红青霉菌应用的研究则更为少见，弗莱明发现的产青霉素产红青霉P.rubens是一种细菌培养污染物(Houbrakenetal.2011)。而具有促进作为生长功能的产红青霉目前尚未见报道。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株产红青霉菌及其应用。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：根据本发明的第一方面，提供一株产红青霉，命名为产红青霉(Penicilliumrubens)PR1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCCNO.13189。该菌株是从巴西野生花生样品中分离得到，菌株在PDA上培养7d，直径27-29mm，菌落面平坦；质地绒状或兼轻微絮状；分生孢子结构大量产生，分生孢子面绿色或灰绿色；菌丝体白色；无渗出液；反面黄绿色或淡黄色；菌核无。孢梗茎36-120×3.0-4.0μm，无色，壁光滑；帚状枝三轮生，偶有双轮生和四轮生；瓶梗安瓿形，6.9-9.1×2.7-3.7μm，梗颈短；分生孢子球形、近球形或椭圆形，3.2-4.2×2.7-3.5μm，壁光滑；分生孢子链呈现疏松的圆柱形。根据本发明的第二方面，提供一种植物诱抗剂，其活性成分为上述产红青霉(Penicilliumrubens)PR1的发酵后菌丝体的乙醇提取物。本发明还提供上述植物诱抗剂的制备方法，包括：发酵上述的产红青霉(Penicilliumrubens)PR1，将发酵液离心过滤，得到菌丝体的步骤；以及将菌丝体采用乙醇进行提取的步骤。上述制备方法中，发酵采用的发酵培养基的原料组成为：马铃薯提取液1000ml、酵母膏1.0g、蛋白胨3.0g、葡萄糖15.0g、琼脂17.0g。所述马铃薯提取液的制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加蒸馏水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升。上述制备方法中，发酵的条件为：接种量为5-15％(体积百分数)、发酵培养温度为20-30℃，培养4-6天；优选的，发酵的条件为：接种量为10％、发酵培养温度为25℃，培养5天。上述制备方法中，乙醇提取的操作为：将菌丝体干燥、粉碎，加入乙醇冷浸20-30h，然后超声提取0.5-1.5h；重复提取2-4次，合并滤液，即得。所述乙醇提取的操作为：将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸12小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液。所述乙醇的加入量为菌丝体(干燥后)重量的15-30％；每次提取加入乙醇的量相同。根据本发明的第三方面，提供上述产红青霉(Penicilliumrubens)PR1和/或植物诱抗剂在促进农作物生长或者促进农作物增产中的应用。上述应用中，所述农作物为花生、豇豆和萝卜。本发明的有益效果：(1)本发明系首次从巴西野生花生中分离、纯化出一种产红青霉菌株。该内生菌可与植株呈互利共生关系，植物把光合作用产物、水和矿物质提供给内生菌；同时，内生菌产生次生代谢产物刺激植物生长发育，提高抗虫害、抗病菌、抗逆性和宿主对环境胁迫的抵抗力等。将其次生代谢产物与新型肥料结合开发新型生物功能型肥料(缓控释肥、有机肥、水溶肥、氮肥等传统肥料等)具有功能优势、成本优势、减肥增效优势、节能环保优势，符合当前产业发展要求，将大幅度提高我国新型肥料水平。(2)本发明通过对发酵后的菌丝体进行乙醇提取，能够有效的对产红青霉产生的次生代谢产物进行富集，提高了其对农作物的促生长和增产作用。附图说明图1：PR1菌株的菌落形态。图2：PR1菌株的菌丝形态和孢子形态(40×0.65和100×1.4)。图3：菌株PR1通过ITS序列分析建立的系统发育树。具体实施方式下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实施例1：菌株的分离和鉴定1.菌株的分离与筛选：(1)菌株的分离巴西野生花生样品采集后用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干后切成0.5cm小段，置于70-75％乙醇消毒3-5min，冲洗干净后再用10％巴氏消毒液洗18分钟，最后用无菌水冲洗4次，晾干表面水分后备用。将上述消毒过的根在无菌条件下接种于孟加拉红培养基平板上，置于25℃度培养箱培养5天后，即可见样品切割过的边缘长出菌丝，经平板(孟加拉红培养基)反复分离、纯化，最后得到一株菌，编号为PR1；孟加拉红培养基配方及制作方法如下：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，琼脂20g，1/3000孟加拉红溶液100mL，蒸馏水1000mL，氯霉素0.1g。上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中，分装后，121℃灭菌20min。2.菌株PR1的形态及生物学特性测定将菌株PR1在室温，PDA上培养7d，直径27-29mm，菌落面平坦；质地绒状或兼轻微絮状；分生孢子结构大量产生，分生孢子面绿色或灰绿色；菌丝体白色；无渗出液；反面黄绿色或淡黄色；菌核无。孢梗茎36-120×3.0-4.0μm，无色，壁光滑；帚状枝三轮生，偶有双轮生和四轮生；瓶梗安瓿形，6.9-9.1×2.7-3.7μm，梗颈短；分生孢子球形、近球形或椭圆形，3.2-4.2×2.7-3.5μm，壁光滑；分生孢子链呈现疏松的圆柱形。该菌具有青霉属的特征，初步判断为产红青霉菌(Penicilliumrubens)。该菌的菌落形态如图1所示，不同放大倍率下的菌株的菌丝形态和孢子形态如图2所示(左图放大倍率为40×0.65，右图放大倍率为100×1.4)。3.菌株PR1的分子生物学鉴定以ITS1和ITS4为引物，对从野生花生根部中分离的真菌PR1菌株进行了扩增，并对扩增产物进行了测序；ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。扩增产物的序列如SEQIDNO.1所示，具体如下：基于blast搜索，选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对，利用Mega6.0软件通过ML算法，利用bootstrap1000次建树结果建立进化树(如图3所示)。结果表明PR1真菌与产红青霉(Penicilliumrubens)的同源相似性达到99％，氨基酸序列的相似性也达到了99％。通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，最终鉴定结果菌株PR1为产红青霉(Penicilliumrubens)。将筛选分离得到的菌株命名为产红青霉(Penicilliumrubens)PR1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCCNO.13189。实施例2：植物诱抗剂的制备具体制备方法如下：1.发酵培养：将4℃下保存在试管斜面上的实施例1分离保藏的产红青霉(Penicilliumrubens)PR1的菌种，接到平板PDA培养基上，25℃培养6天，用打孔器琼脂挖块接种于装有50mL种子培养液(PDA液体培养基)的250mL三角瓶，于25℃，180r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10％量接种入装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，得种子液。PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。发酵培养基配方：马铃薯提取液1.0L，酵母膏1.0g，蛋白胨3.0g，葡萄糖15.0g，琼脂17.0g。马铃薯提取液的制备：取去皮马铃薯200克，切成小块，加蒸馏水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升。2.乙醇提取：将发酵液离心过滤，得菌丝体，将菌丝体在60℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取1h；重复提取3次，合并滤液，即得植物诱抗剂。所述乙醇的加入量为菌丝体重量的20％；每次提取加入乙醇的量相同。实施例3：植物诱抗剂在花生促生和增产中的应用1.试验方法：处理1：拌种(0.1克实施例2制备的植物诱抗剂拌30公斤种子)。处理2：拌种加一次喷雾(0.01克实施例2制备的植物诱抗剂拌30公斤种子，开花中后期0.02克实施例2制备的植物诱抗剂兑15公斤水稀释喷雾)。处理3：拌种加二次喷雾(0.01克实施例2制备的植物诱抗剂拌30公斤种子。开花中后期0.02克实施例2制备的植物诱抗剂兑15公斤水稀释喷雾；收获前1个月第二次喷雾)。每个处理重复3次。露地栽培，株距20厘米，行距为50厘米。每亩基施某品牌专用复合肥50公斤。测产方法：每处理选择生长比较均匀的垄收获2米垄长，摘下花生果晒干带皮称重和去壳称重。2.试验结果：表1：植物诱抗剂对黑花生的增产结果(单位：公斤)处理毛重增产(平均值)粒重增产(平均值)CK0.79/0.57/处理10.87510.8％0.64513.1％处理21.06534.8％0.79539.5％处理30.88512.0％0.6514.0％实验结果表明，处理2的增产幅度最大，毛重和净重分别达到34.8％和39.5％，处理1和处理2的增产幅度接近。测产过程可以看出，处理2的花生果和粒都明显大于其它处理，未成熟果较少，对照成熟较晚，未成熟的水粒比较多。实施例4：植物诱抗剂在豇豆促生和增产中的应用1.试验方法：使用方法：出苗后10天后0.02克实施例2制备的植物诱抗剂兑30公斤水灌根，每株1000毫升，开花后0.02克实施例2制备的植物诱抗剂兑15公斤水稀释喷雾。每次收获后喷雾一次。栽培中期用0.02克实施例2制备的植物诱抗剂兑30公斤水结合滴灌追肥一次。栽培方式：春季温室栽培。株行距为20×60厘米，每穴2株。每亩基施某品牌专用复合肥50公斤。测产方法：每次收获称重，累计最初5次收获的产量累加作为产量标准。2.试验结果：前五次收获比对照增产幅度45％，处理的除产量指标外，各处理结豆荚的数量大小等指标明显高于对照，后期受架高限制，产量形成受到影响，后期产量没有计算在内。在生产过程中可以明显提高豇豆前期的收获量，有利于农产品的早期产量形成，由于前期蔬菜的价格较高，所以具有双重的增收效果。实施例5：植物诱抗剂在萝卜促生和增产中的应用1.试验方法：处理方法：分2个处理浓度，分别为0.02克实施例2制备的植物诱抗剂和0.01克实施例2制备的植物诱抗剂兑水15公斤喷雾。在出苗放出真叶后用喷淋，以浸湿根部为准，20天后喷一次，封垄后再喷一次。栽培方法：入伏后在露地栽培。株行距为20×30厘米，单株栽培。三次重复。每亩基施富友牌专用复合肥50公斤。测产方法：收获是拔出萝卜，除去叶片，称重萝卜。2.试验结果：各处理产量分别为0.02克每壶水处理10.3公斤，0.01克每壶水处理11.7公斤，对照产量为7.5公斤。分别增产37.3％和56％，同时处理的萝卜品质明显得到改善，具有水果的甜脆口感，辛辣很弱，可直接鲜食，而对照非常辛辣，不易鲜食。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>泰安市煜达生物科技有限公司<120>一株产红青霉菌及其应用<130>2016<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>677<212>DNA<213>菌株PR1<400>1ttgatatgcttaagttcagcgggtatccctacctgatccgaggtcaacctggataaaaat60ttgggttgatcggcaagcgccggccgggcctacagagcgggtgacaaagccccatacgct120cgaggaccggacgcggtgccgccgctgcctttcgggcccgtcccccgggatcggaggacg180gggcccaacacacaagccgtgcttgagggcagaaatgacgctcggacaggcatgcccccc240ggaataccagggggcgcaatgtgcgttcaaagactcgatgattcactgaatttgcaattc300acattacgtatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccggaaccaagagatccgttgt360tgaaagttttaaataatttatattttcactcagactacaatcttcagacagagttcgagg420gtgtcttcggcgggcgcgggcccgggggcgtaagccccccggcggccagttaaggcgggc480ccgccgaagcacaaggtaaaataaacacgggtgggaggttggacccagagggccctcact540cggtaatgatccttccgcaggttcacctacggaagccaggggggctccaaaaagcgctgg600actacctgatccgaggtcacctggataaaaatttgggttgatcggcaagcgccggccggg660cctacagagcgggtgac677当前第1页1 2 3