一种对羟基苯甲酸丙酯的合成方法与流程

本发明涉及一种对羟基苯甲酸丙酯的合成方法，属于生物催化合成技术领域。

背景技术：

对羟基苯甲酸丙酯是国际公认的安全、高效、广谱性防腐剂。它毒性极低，无刺激性以及在较宽pH范围比较稳定等特点，对霉菌、酵母、细菌均有广泛的抗菌作用，一直是化妆品和药品中应用较广的防腐剂。对羟基苯甲酸丙酯在生命科学研究领域实验中具有一定的影响，可用于生化研究和组织培养等。目前，常用的对羟基苯甲酸丙酯生产方法主要是基于化学催化剂的酯化反应。传统的化学催化法在高温高压和强腐蚀性的条件下进行，能耗大、设备易腐蚀、副产物多、环保成本高。应用生物催化剂可在温和、常压的条件下反应，固定化的生物催化剂易回收重复利用，反应能耗低，产物分离成本低，设备要求低。本合成方法符合绿色环保的要求，是未来化学品绿色合成的发展趋势。此外，单宁酶的天然底物为单宁酸、没食子酸及其酯类物质，应用单宁酸催化合成对羟基苯甲酸丙酯的相关研究未见报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种对羟基苯甲酸丙酯的合成方法，该方法是一种高效便捷的生产方式，为实现对羟基苯甲酸丙酯绿色高效的生产提供了一种新的途径。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种对羟基苯甲酸丙酯的合成方法，所述合成方法包括固定化生物印迹酶。

在上述方案中优选地，所述生物印迹酶的印迹体系为质量比为0.1-1:1-3:10的单宁酶-对羟基苯甲酸-硅藻土。优选地，所述生物印迹酶的印迹体系为质量比为1:1:10的单宁酶-对羟基苯甲酸-硅藻土。

在上述任一方案中优选地，固定所述化生物印迹酶的缓冲溶液为pH为6.0、浓度为100mM的乙酸缓冲溶液。

在上述任一方案中优选地，所述合成方法的反应体系包括正己烷、正戊烷、正丙醇、苯或石油醚(30～60℃)。

在上述任一方案中优选地，所述合成方法的反应体系包括正丙醇。

在上述任一方案中优选地，所述合成方法的反应体系为正丙醇-乙酸缓冲液复合溶剂体系。

在上述任一方案中优选地，所述正丙醇-乙酸缓冲液复合溶剂体系中所述正丙醇含量为25-98.5％(v/v)。

在上述任一方案中优选地，所述正丙醇-乙酸缓冲液复合溶剂体系中所述正丙醇含量为50％(v/v)。

在上述任一方案中优选地，所述正丙醇-乙酸缓冲液复合溶剂体系中所述乙酸缓冲液为pH为6.0、浓度为100mM的乙酸缓冲溶液。

在上述任一方案中优选地，所述合成反应的温度为40℃，震荡200rpm，反应24h。

本发明的有益效果：本发明应用固定化生物印迹单宁酶催化合成对羟基苯甲酸丙酯，选用正丙醇醇-乙酸缓冲液的复合溶剂体系提升其催化效率。本发明的方法能够实现26.5％的底物转化率。本方法反应温和、能耗小、污染少，是一种高效便捷的生产方式，为实现对羟基苯甲酸丙酯绿色高效的生产提供了一种新的途径。本发明利用生物酶在温和的条件合成对羟基苯甲酸丙酯，因具有成本低，设备要求不高，且绿色无污染，非常契合化学品绿色合成的要求，具有巨大的发展潜力，也是未来化学品绿色制造的发展趋势。因此，本发明具有重要的应用推广价值和社会意义。

附图说明

图1为不同反应体系的紫外光谱比较；

图2为不同反应体系的红外光谱比较；

图3为印迹酶催化反应样品与产物、底物的色谱比较；

图4为不同有机溶剂对印迹酶催化反应性能的影响；

图5为不同正丙醇含量对印迹酶催化反应性能的影响。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。如无特殊说明，“％”表示体积百分比。单宁酶购于济南华赞公司。本发明实施例中，所有乙酸缓冲液的pH为6.0，浓度为100mM。

实验例1：反应可行性研究

1、生物印迹酶的制备

向50mL锥形瓶中依次加入1mL 50mg/mL对羟基苯甲酸(PHBA)，0.2mL浓度为250mg/mL的单宁酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸缓冲液漩涡震荡3-5min后。将上述混合物放置在-20℃过夜，再低温冷冻干燥成粉末，保存于4℃备用。

2、反应体系的配制

2.1、无酶体系：向50mL锥形瓶中依次加入1mL正丙醇，18mL正己烷，1mL 50mg/mL PHBA，0.3mL乙酸缓冲液，0.5g硅藻土配制成反应体系。

2.2、自然酶体系：向50mL锥形瓶中依此加入1mL正丙醇，0.2mL浓度为250mg/mL的单宁酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸缓冲液漩涡震荡3-5min后。将上述混合物放置在-20℃过夜，在低温冷冻干燥成粉末，保存于4℃备用。将上述50mL锥形瓶加入2mL正丙醇，18mL正己烷，0.3mL乙酸缓冲液，1mL 50mg/mLPHBA配制成反应体系。

2.3、印迹酶体系：将装有1中制备好的生物印迹单宁酶的50mL锥形瓶，依次加入2mL正丙醇，18mL正己烷，0.3mL乙酸缓冲液，配制成催化体系。

3、反应条件

将装有反应体系的锥形瓶置于40℃，200rpm的微型震荡培养箱中，催化反应24h。

4、产物鉴定

4.1、紫外检测

用紫外光谱仪分别对上述三种反应体系进行检测。由图1所示，酶能降低反应体系的光吸收值。其中，印迹酶体系降低光吸收值的能力比自然酶体系强。鉴于苯环上新增基团会遮蔽苯环使光吸收性下降，由此推断单宁酶可能具有催化合成对羟基苯甲酸丙酯的能力。进一步地，PHBA可能对单宁酶存在底物诱导的能力。

4.2、红外检测

用FT-IR分别对上述三种反应体系进行检测。由图2所示，880～680cm^-1之间为C-H面外弯曲振动，不参与反应。1166cm^-1是底物PHBA的特征峰。印迹酶体系、天然单宁酶体系和无酶体系都出现了PHBA的特征峰。通过比较不同样品红外波谱在1166cm^-1与858cm^-1的透射比比值发现，天然单宁酶和印迹单宁酶的数值逐渐降低(表1)，说明底物的消耗量越来越大，生成的产物可能越来越多，进一步证明了天然单宁酶和印迹单宁酶具有催化该反应的能力。并且，相对于天然酶，印迹酶催化性能更优。

表1不同反应样品的红外特征波谱分析

4.3、HPLC检测

用HPLC分别对上述三种反应体系进行检测。由图3中标准底物和产物色谱峰所示，保留时间为5min左右的峰是底物特征峰，28min左右的峰是产物对羟基苯甲酸丙酯的特征峰，比较底物、产物和印迹酶反应体系的特征峰，发现反应样品中存在对羟基苯甲酸丙酯，证明基于单宁酶催化的PHBA到对羟基苯甲酸丙酯的酯化反应是可以进行的。

因此，选择选择生物印迹单宁酶作为催化剂，催化PHBA到对羟基苯甲酸丙酯的酯化反应。

实验例2：反应体系的确定

1、反应介质的选择

将5个装有实验例1的1中固定化印迹单宁酶的50mL锥形瓶，分别加入4mL正丙醇，再依次加入15mL正己烷、正戊烷、正丙醇、苯和石油醚(30～60℃)，1mL乙酸缓冲液，配制成催化体系。将装有反应体系的锥形瓶置于40℃，200rpm的微型震荡培养箱中，催化反应24h。结果如图4所示，反应介质为正丙醇时，酶的催化性能最优，底物的转化率最高，达到4.23％(表2)。因此，选择正丙醇为反应介质。

表2不同介质的底物转化率

2、正丙醇最佳含量的确定

将5个装有实验例1的1中固定化印迹单宁酶的50mL锥形瓶，加入总体积为20mL的正丙醇-乙酸缓冲液的混合溶液，其中，正丙醇体积百分比为25-95％。将装有反应体系的锥形瓶置于40℃，200rpm的微型震荡培养箱中，催化反应24h。结果如图5所示，正丙醇体积百分比为50％时，底物的转化率最高，达到26.47％，是优化前的6倍(表3)。表明基于反应工艺优化，提升本发明的底物转化率的潜力巨大。

表3正丙醇不同含量的底物转化率

实施例1

向50mL锥形瓶中依次加入1mL 50mg/mL PHBA，0.2mL浓度为250mg/mL的单宁酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸缓冲液漩涡震荡3-5min后。将上述混合物放置在-20℃过夜，再低温冷冻干燥成粉末，保存于4℃备用。向装有制备好的生物印迹单宁酶的50mL锥形瓶，加入总体积为20mL的正丙醇-乙酸缓冲液的混合溶液，其中，正丙醇体积百分比为50％。配制成催化体系。将装有反应体系的锥形瓶置于40℃，200rpm的微型震荡培养箱中，催化反应24h。最终底物的转化率为26.47％，纯度99.95％。

实施例2

向50mL锥形瓶中依次加入1mL 50mg/mL PHBA，0.2mL浓度为25mg/mL的单宁酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸缓冲液漩涡震荡3-5min后。将上述混合物放置在-20℃过夜，再低温冷冻干燥成粉末，保存于4℃备用。向装有制备好的生物印迹单宁酶的50mL锥形瓶，加入总体积为20mL的正丙醇-乙酸缓冲液的混合溶液，其中，正丙醇体积百分比为50％。配制成催化体系。将装有反应体系的锥形瓶置于40℃，200rpm的微型震荡培养箱中，催化反应24h。最终底物的转化率为26.15％，纯度99.93％。

实施例3

向50mL锥形瓶中依次加入1mL 150mg/mL PHBA，0.2mL浓度为250mg/mL的单宁酶，0.5g硅藻土，4mL乙酸缓冲液漩涡震荡3-5min后。将上述混合物放置在-20℃过夜，再低温冷冻干燥成粉末，保存于4℃备用。向装有制备好的生物印迹单宁酶的50mL锥形瓶，加入总体积为20mL的正丙醇-乙酸缓冲液的混合溶液，其中，正丙醇体积百分比为50％。配制成催化体系。将装有反应体系的锥形瓶置于40℃，200rpm的微型震荡培养箱中，催化反应24h。最终底物的转化率为26.23％，纯度99.92％。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。