一种泡叶藻硫酸酯化多糖及其制备方法、应用与流程

本发明涉及多糖领域，且特别涉及一种泡叶藻硫酸酯化多糖及其制备方法、应用。

背景技术：

硫酸酯化多糖是指在分子中的羟基被硫酸基取代的多糖，也称硫酸多糖或多糖硫酸酯。天然的硫酸酯化多糖主要来源海藻、肝素、植物及真菌,具有非常广泛的生物活性，除最主要的抗凝血作用外，还具有降血脂、抗衰老、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗辐射、抗血栓等多种生物活性功能。

泡叶藻(Ascophyllum nodosum)属于褐藻门，主要生于北冰洋海域附近海岸。泡叶藻是海藻工业生产常用原料，被用于提取碘、甘露醇、褐藻酸钠，并且含有丰富的矿物质元素及营养，因此也用作肥料的上等原料。褐藻多糖是一类天然的含有硫酸基的杂多糖，存在于细胞壁基质中，具有多种生物活性，如免疫调节、抗氧化、抗病毒、抗凝血、抗肿瘤等。

发明人研究发现，硫酸酯化多糖由于单糖组分的种类和比例、糖苷键的种类不同，硫酸基的多少和所在位置不同，立体结构不同，化学结构十分复杂，硫酸酯化多糖因此具有不同的生物活性。而目前对硫酸酯化多糖的研究主要集中对海带多糖的研究，对泡叶藻多糖的研究较少。同时，对硫酸酯化多糖的研究一般是对低分子量的多糖进行研究，而较少涉及对大分子量硫酸酯化多糖的研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种泡叶藻硫酸酯化多糖的制备方法，此制备方法操作简单、原料利用率高、工艺温和、适合规模化生产。

本发明的另一目的在于一种泡叶藻硫酸酯化多糖，其硫酸基含量高，分子量相对较大，活性结构稳定，具有调节肠道功能。

本发明的第三个目的在于提供泡叶藻硫酸酯化多糖在制备调节肠道功能产品中的应用。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种泡叶藻硫酸酯化多糖的制备方法，其包括以下步骤：

用溶剂对泡叶藻进行浸泡，然后除去泡叶藻中的溶剂，溶剂为醇或醇的水溶液。

以水为提取剂，60～100℃下对除杂后的泡叶藻进行提取、分离得到水提物。

对水提物进行醇沉，控制醇沉体系中乙醇的体积分数为60～80％，沉淀后分离出沉淀物。

用水复溶沉淀物，经截留量为8000～14000Da的透析膜透析后，浓缩、干燥得到的多糖粗品。

以氯化钠-水溶液为洗脱液，将多糖粗品于阴离子交换柱中梯度洗脱，收集多糖分子量大于100kDa的洗脱组分，经透析、浓缩、干燥得到大分子量多糖组分。

以氯化钠-水溶液为洗脱液，将大分子量多糖组分于凝胶柱中等度洗脱，收集含多糖的洗脱组分，经透析、浓缩、干燥得到泡叶藻硫酸酯化多糖。

本发明提出一种泡叶藻硫酸酯化多糖，其根据上述的制备方法制备得到。

本发明提出一种泡叶藻硫酸酯化多糖在制备调节肠道功能产品中的应用。

本发明实施例的泡叶藻硫酸酯化多糖及其制备方法、应用的有益效果是：

采用醇或醇的水溶液对泡叶藻进行浸泡，能够有效地除去泡叶藻中的色素、多酚、单糖及低聚糖等物质，减少泡叶藻中的杂质，便于后续的提取分离。

采用水提法进行提取，水提温度为60～100℃，温度较高，能够有效提取出泡叶藻中多糖成分，浸出速度快，浸出物含量高，不使用酸碱等有毒有害试剂，成本低。

对水提物进行醇沉，乙醇体积分数为60～80％的醇沉体系能够有效沉淀出硫酸酯化多糖成分。进一步对沉淀物进行透析处理，经截留量为8000-14000Da的透析膜能有效去除乙醇、小分子糖、蛋白质和盐，得到多糖粗品。

采用阴离子交换柱和凝胶柱纯化多糖粗品，能够得到高纯度的泡叶藻硫酸酯化多糖。硫酸酯化多糖含有丰富的羧基和羟基，带负电荷，采用阴离子交换柱，可以吸附离子型物质，比如蛋白质、酸性多糖等。经阴离子交换柱纯化后，收集多糖分子量大于100kDa的洗脱组分，使用凝胶柱再次进行纯化，得到泡叶藻硫酸酯化多糖。经过两次纯化过程，得到的泡叶藻硫酸酯化多糖纯度高，硫酸基含量高，分子量相对较大，活性结构稳定，具有调节肠道功能的生理活性，能够应用于制备调节肠道功能产品。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的Sepharose Fast Flow柱的洗脱曲线；

图2为本发明实施例1提供的Sephacryl S-300柱的洗脱曲线；

图3为本发明实施例提供的泡叶藻硫酸酯化多糖AnP2-1的红外光谱图；

图4为本发明试验例2提供的泡叶藻硫酸酯化多糖AnP2-1体外发酵体系pH变化图；

图5为本发明试验例2提供的泡叶藻硫酸酯化多糖AnP2-1体外发酵过程中SCFA变化图；

图6为本发明试验例2提供的泡叶藻硫酸酯化多糖AnP2-1体外发酵过程中菌群的在门水平的相对丰度值。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的泡叶藻硫酸酯化多糖及其制备方法、应用进行具体说明。

本发明实施例提供的一种泡叶藻硫酸酯化多糖的制备方法，以泡叶藻为原料，先对泡叶藻进行粉碎处理，以增加物料和溶剂之间的接触面积，提高浸出速度和有效成分的浸出量。粉碎粒度优选为50～70目，进一步优选为60目，上述粒度范围内物料的有效成分含量最高，提取效率最优，保证最大化利用原料。可以理解的是，在本发明的其他实施例中，也可以不经过粉碎直接对泡叶藻进行处理。

采用醇或醇的水溶液浸泡粉碎后的泡叶藻，除去泡叶藻中的溶剂。泡叶藻属于褐藻类，含有较多的色素、多酚等杂质，使用醇或醇的水溶液处理，可以有效将上述杂质去除，便于后续的提取分离以及纯化操作，避免因为色素等物质的存在增加后续分离纯化的难度，降低产品的纯度。可以选用乙醇、正丁醇、乙醚、石油醚等对泡叶藻进行浸泡，均能有效对泡叶藻进行脱脂脱色处理。优选为采用体积分数为80％的乙醇溶液处理粉碎后的泡叶藻，其能够有效去除泡叶藻中的色素、多酚、单糖、低聚糖等成分，便于后续的提取分离以及纯化操作，且乙醇的毒性小，成本低，更易操作。

以水为提取剂，60～100℃下对除杂后的泡叶藻进行提取、分离得到水提物。硫酸酯化多糖是一种极性大分子化合物，因含有大量的羟基而易溶于水，采用热水进行提取，提取速度快，工艺简单，操作方便，成本低，既能保证多糖的提取率，又不使用酸碱等有毒有害试剂，健康环保。

进一步地，在本发明较佳实施例中，以5～30mL/g的液料比对泡叶藻提取3～5h，提取2～4次，离心后合并提取液即得到水提物。该液料比下，有效成分溶出多，提取效率高，多糖类物质的提取效果最佳。进一步地，提取时间优选为4h，提取时间过短则不利于多糖成分的溶出，提取时间过长，则容易造成多糖结构的破坏。提取次数优选为提取3次，3次提取能够提取出泡叶藻中绝大部分的多糖成分，既保证最大化利用了原料，又节约提取时间。

在本发明的其他实施例中，为进一步保证产品的提取率，在水提取过程中，可以采用超声波辅助提取或者微波辅助提取工艺对泡叶藻进行提取。

对水提物进行醇沉，控制醇沉体系中乙醇的体积分数为60～80％，沉淀后分离出沉淀物。在多糖水溶液中加入乙醇，会破坏多糖水溶液中的氢键，从而降低多糖在水中的溶解度，使多糖以沉淀的形式析出。利用多糖溶于水而不溶于高体积分数乙醇，可使多糖从水溶液中沉淀出来。醇沉体系中的乙醇的浓度过低，会导致沉淀成絮状，难以下沉，沉淀析出效果差，且乙醇用量大，浪费材料，回收不方便。醇沉体系中乙醇的浓度过高，沉淀中含有大量的物质，会将杂质一同析出，不利于后续的分离纯化操作。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，醇沉体系中乙醇的体积分数为70％，该体积分数的乙醇溶液能够有效沉淀出多糖组分，且杂质含量少。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，醇沉的条件为置于1～8℃中12～24h，离心分离得到沉淀物，保证多糖成分沉淀完全，提高多糖的提取率。

用水复溶醇沉得到的沉淀物，经截留量为8000～14000Da的透析膜透析后，浓缩、干燥得到的多糖粗品。对沉淀物进行复溶、透析，能有效去除乙醇、小分子糖、蛋白质和盐等，得到纯度较高的多糖粗品，便于后续的纯化操作。对透析得到的保留液进行减压浓缩后冷冻干燥得到多糖粗品，先进行减压浓缩再进行冷冻干燥，有利于在回收溶剂时保证物质的活性成分不受到破坏，同时除去大部分的溶剂，缩短干燥时间。采用冷冻干燥技术，可以得到纤维状的多糖粗品，便于后续操作，且最大限度保证多糖粗品的功能活性不遭受破化。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，透析时间优选为3～7天。该透析时间下，能够保证沉淀物中的小分子物质充分透出，透析效果最佳。

以氯化钠-水溶液为洗脱液，将多糖粗品于阴离子交换柱中梯度洗脱。优选地，采用湿法上样，具体为：将多糖粗品溶解在水中，离心后上样，以提高纯化效果。硫酸酯化多糖含有丰富的羧基和羟基，带负电荷，采用阴离子交换柱，可以吸附离子型物质，比如蛋白质、酸性多糖等。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上，通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，改变各种离子与离子交换剂的结合力达到分离目的。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，阴离子交换柱选用DEAE Sepharose Fast Flow柱或DEAE Cellulose离子交换柱。进一步优选为DEAE Sepharose Fast Flow柱，即DEAE琼脂糖凝胶Fast Flow柱，其具有高化学稳定性、高流速、高载量、好的机械性能、多次重复使用等特点，非特异性吸附低，回收率高，适用于工业化规模生产。采用DEAE Sepharose Fast Flow柱进行初纯化，其基质与水具有较强的亲和力，能够对多糖粗品进行快速分离纯化，纯化效果好。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，梯度洗脱过程的氯化钠-水溶液中，氯化钠的物质的量浓度依次为0M、0.5M、1M和1.5M。该洗脱梯度下，能够对多糖粗品进行有效的分离纯化，多糖中的羧基、硫酸基的取向、类型及数量有差异，利用不同浓度的氯化钠溶液洗脱，能够分离得到不同的多糖组分，纯化效果好。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，梯度洗脱的洗脱速度为1～3mL/min，优选为2mL/min。该洗脱速度下多糖粗品的分离效果最优。

具体地，分别用200mL的水、0.5M、1M和1.5M的氯化钠水溶液依次进行洗脱。每10mL洗脱液收集为一个洗脱组分，共收集得到80个洗脱组分。

进一步的，采用苯酚-硫酸法检测各洗脱组分中多糖含量，收集多糖分子量大于100kDa的洗脱组分，经透析、浓缩、干燥得到大分子量多糖组分。优选地，为了除去因为洗脱液而引入洗脱组分中的盐分，采用截留量为3500Da的透析膜对洗脱组分进行透析，除去洗脱组分中的盐分，保证纯化效果。分子量大于100kDa的多糖因其分子量较大，硫酸基含量相对较高，具有低分子量多糖所不具备的生理活性功能。

对大分子量多糖组分进行再纯化，以0.1M的氯化钠-水溶液为洗脱液，将大分子量多糖组分于凝胶柱中等度洗脱。优选地，采用湿法上样，用0.1M的氯化钠溶液溶解大分子量多糖组分，离心后上样，以提高纯化效果。采用凝胶柱对大分子量多糖组分进行进一步的精制，根据分子的大小对多糖进行分离纯化。优选地，凝胶柱选用Sephacryl S柱或Sephadex G柱，该凝胶柱能够有效对多糖进行分离纯化。进一步优选地，选用Sephacryl S-300柱对多糖进行纯化，其对大分子量多糖组分进行纯化后能够得到单一的对称峰，洗脱效果好。具体地，用300mL的0.1M氯化钠水溶液进行梯度洗脱。每10mL洗脱液收集为一个洗脱组分，共收集得到30个洗脱组分。

收集含多糖的洗脱组分，经透析、浓缩、干燥得到泡叶藻硫酸酯化多糖。

本发明实施例还提供根据上述方法制备得到的泡叶藻硫酸酯化多糖，平均分子量为370±23kDa，硫酸基含量为23.8±0.02％。该泡叶藻硫酸酯化多糖活性结构稳定，硫酸基含量高，具有调节肠道功能。

本发明实施例还提供上述泡叶藻硫酸酯化多糖在制备调节肠道功能产品中的应用。

本发明实施例还提供上述泡叶藻硫酸酯化多糖在制备减肥功能产品中的应用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供的一种泡叶藻硫酸酯化多糖的制备方法，其包括：

将泡叶藻样品粉碎过60目筛后，用80％乙醇浸泡后晾干，重复数次，去除色素、多酚、单糖及低聚糖。

用水于60～100℃水中以液料比为20mL/g提取除杂后的泡叶藻3次，每次提取4h，离心后合并三次提取液，浓缩得到水提物。

在水提物中加入无水乙醇进行醇沉，并控制醇沉体系中的乙醇浓度为70％，在4℃条件下过夜，离心，收集沉淀得到沉淀物。

将沉淀物复溶于纯水中，将样品装入截留量为8000-14000Da透析袋进行透析5天，然后浓缩冷冻干燥，得到多糖粗品。

取多糖粗品溶解于去离子水中，离心后上样于DEAE Sepharose Fast Flow柱，分别用纯水、0.5M、1.0M及1.5M的NaCl溶液进行洗脱，流速为2mL/min。利用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖含量，该步骤的洗脱曲线如图1所示。由图1可得，多糖粗品经DEAE Sepharose Fast Flow柱纯化得到两个洗脱峰，且两个洗脱峰均为单一的对称峰，表明纯化效果良好。收集两个洗脱峰，分别经过透析(截留量为3500Da)、旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到两个洗脱组分，分别记为AnP-1和AnP-2。分别测定AnP-1和AnP-2的分子量，得到分子量大于100kDa的大分子量多糖组分AnP-2。

将大分子量多糖组分AnP-2用适量0.1M的NaCl进行溶解，离心后上样Sephacryl S-300凝胶柱，用0.1M的NaCl溶液进行洗脱，流速为1mL/min。利用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖含量，该步骤的洗脱曲线如图2所示。由图2可得，AnP-2经Sephacryl S-300柱纯化得到一个洗脱峰，该洗脱峰均为单一的对称峰，表明该多糖组分为均一多糖，纯化效果良好。收集该洗脱峰，经过透析(截留量为3500Da)、旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到泡叶藻硫酸酯化多糖，记为AnP2-1，AnP2-1的提取率为9.0％。

实施例2

本实施例提供的一种泡叶藻硫酸酯化多糖的制备方法，其包括：

将泡叶藻样品粉碎过60目筛后，用70％乙醇浸泡后晾干，重复数次，去除色素、多酚、单糖及低聚糖。

用水于60～100℃水中以液料比为5mL/g提取除杂后的泡叶藻4次，每次提取5h，离心后合并四次提取液，浓缩得到水提物。

在水提物中加入无水乙醇进行醇沉，并控制醇沉体系中的乙醇浓度为60％，在1℃条件下过夜，离心，收集沉淀得到沉淀物。

将沉淀物复溶于纯水中，将样品装入截留量为8000-14000Da透析袋进行透析3天，然后浓缩冷冻干燥，得到多糖粗品。

取多糖粗品溶解于去离子水中，离心后上样于DEAE Cellulose离子交换柱，分别用纯水、0.5M、1.0M及1.5M的NaCl溶液进行洗脱，流速为3mL/min。利用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖含量，收集得到多糖分子量大于100kDa的洗脱组分，经过透析(截留量为3500Da)、旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到大分子量多糖组分，记为AnP-2。

将AnP-2用适量0.1M的NaCl进行溶解，离心后上样Sephadex G凝胶柱，用0.1M的NaCl溶液进行洗脱，流速为2mL/min。利用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖含量，收集含多糖的洗脱组分，经过透析(截留量为3500Da)、旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到泡叶藻硫酸酯化多糖，记为AnP2-1，AnP2-1的提取率为4.5％。

实施例3

本实施例提供的一种泡叶藻硫酸酯化多糖的制备方法，其包括：

将泡叶藻样品粉碎过80目筛后，用90％乙醇浸泡后晾干，重复数次，去除色素、多酚、单糖及低聚糖。

用水于60～100℃水中以液料比为30mL/g提取除杂后的泡叶藻2次，每次提取3h，离心后合并两次提取液，浓缩得到水提物。

在水提物中加入无水乙醇进行醇沉，并控制醇沉体系中的乙醇浓度为80％，在8℃条件下过夜，离心，收集沉淀得到沉淀物。

将沉淀物复溶于纯水中，将样品装入截留量为8000-14000Da透析袋进行透析7天，然后浓缩冷冻干燥，得到多糖粗品。

取多糖粗品溶解于去离子水中，离心后上样于DEAE Cellulose离子交换柱，分别用纯水、0.5M、1.0M及1.5M的NaCl溶液进行洗脱，流速为3mL/min。利用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖含量，收集多糖分子量大于100kDa的洗脱组分，经过透析(截留量为3500Da)、旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到大分子量多糖组分，记为AnP-2。

将AnP-2用适量0.1M的NaCl进行溶解，离心后上样Sephacryl S-300凝胶柱，用0.1M的NaCl溶液进行洗脱，流速为3mL/min。利用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖含量，收集含多糖的洗脱组分，经过透析(截留量为3500Da)、旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到泡叶藻硫酸酯化多糖，记为AnP2-1，AnP2-1的提取率为7.3％。

实施例4

本实施例提供的一种泡叶藻硫酸酯化多糖的制备方法，其包括：

将泡叶藻样品粉碎过70目筛后，用石油醚浸泡后晾干，重复数次，去除色素、多酚、单糖及低聚糖。

用水于60～100℃水中以液料比为15mL/g提取除杂后的泡叶藻2次，并采用超声波辅助提取，每次提取2h，离心后合并两次提取液，浓缩得到水提物。

在水提物中加入无水乙醇进行醇沉，并控制醇沉体系中的乙醇浓度为75％，在5℃条件下过夜，离心，收集沉淀得到沉淀物。

将沉淀物复溶于纯水中，将样品装入截留量为8000-14000Da透析袋进行透析6天，然后浓缩冷冻干燥，得到多糖粗品。

取多糖粗品溶解于去离子水中，离心后上样于DEAE Sepharose Fast Flow柱，分别用纯水、0.5M、1.0M及1.5M的NaCl溶液进行洗脱，流速为2mL/min。利用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖含量，收集多糖分子量大于100kDa的洗脱组分，经过透析(截留量为3500Da)、旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到大分子量多糖组分，记为AnP-2。

将AnP-2用适量0.1M的NaCl进行溶解，离心后上样Sephacryl S-300凝胶柱，用0.1M的NaCl溶液进行洗脱，流速为0.5mL/min。利用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖含量，收集含多糖的洗脱组分，经过透析(截留量为3500Da)、旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到泡叶藻硫酸酯化多糖，记为AnP2-1，AnP2-1的提取率为8.7％。

试验例1

实施例1～4中制得的泡叶藻硫酸酯化多糖AnP2-1的结构分析。

1.分子量的测定：采用高效凝胶色谱法测定AnP-1和AnP-2的分子量大小，测定结果表明，AnP-1的分子量为65.92±9kD，AnP-2的分子量为370±23kDa，质量分布较为均一。

2.硫酸根含量的测定--明胶氯化钡法

2.1明胶氯化钡溶液的配制：称取1g明胶溶于100mL 60-70℃蒸馏水溶解，冷却后冰箱静置过夜，第二天称取0.5g氯化钡溶于溶液中，静置2h后使用。

2.2硫酸钾溶液的配制：将K₂SO₄于105-110℃烘3h，放干燥器中冷至室温，准确称取35mg，配成100mL溶液，并换算成硫酸根离子的浓度(mg/mL)，分子量：硫酸根96，硫酸钾174。

2.3标准曲线的绘制：取标准K₂SO₄液分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL。样品取0.25mL，加蒸馏水定容至3mL，加0.2M HCl 3.8mL，明胶氯化钡1mL，充分摇匀，放置30min后于500nm处测其吸光度。

2.4样品测定：把0.1g的样品AnP2-1左右放入小瓶中，加2M HCl 8mL，待样品溶胀后，封管，在水浴锅中加热4h，取出冷至室温。把样品从瓶中取出，放入小烧杯中加氨水中和至pH＝6-7后加活性炭，放置一段时间后用滤纸过滤，用蒸馏水慢慢少量冲洗，然后定容至25mL。按标准曲线测定方测定吸光度值，对照标准曲线计算硫酸根含量。

经测定得，AnP2-1的硫酸基含量为23.8±0.02％。

3.单糖组成的测定：

3.1多糖水解：分别称取5mg的样品AnP2-1，加入2.5mL的三氟乙酸，放入110℃的烘箱中水解6h。将小瓶敞口放在100℃水浴锅内，加入3mL左右的无水乙醇，进行蒸干，重复3-4次。向蒸干的样品加入200μL的0.5mol/L PMP和200μL的0.3mol/L的NaOH溶液，混匀后放在70℃的水浴锅中衍生30min。待冷却后，用0.3mol/L的HCl溶液调节pH，至中性。向溶液中加入2mL的超纯水和4mL的乙酸异戊酯，用涡旋混合器混合摇匀1min后，静止10min，弃上层废液。再向其中加入4mL乙酸异戊酯，用涡旋混合器混合摇匀1min后，静止10min，弃上层废液，最后加入4mL的氯仿溶液，用涡旋混合器混合摇匀1min后，静止10min，用于去除多余的乙酸异戊酯及其余杂质。将萃取后的溶液，定容到5mL，得到1mg/mL的溶液。溶液经滤膜过滤后进行单糖测定。

3.2液相色谱法测定：Agilent 1200液相色谱仪，色谱柱为Eclipse Plus C18柱。选择不同浓度的混合单糖标准品，以单糖浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制每种单糖的标准曲线进行单糖定性定量检测。

结果表明，AnP2-1的单糖组成为甘露糖：葡萄糖醛酸：阿拉伯糖：岩藻糖＝1.91:2.87:2.65:15.9。

4.红外光谱分析：如图3所示为AnP2-1的红外光谱图。其中，3435.98cm^-1出现强的宽吸收峰，是O-H伸缩振动，2937.06cm^-1出现强的弱吸收峰是C-H伸缩振动，1636.53cm^-1和1418.80cm^-1出现强吸收峰是羧基(C＝O)伸缩振动，1225.85cm^-1出现吸收峰是C-O-C非对称伸缩振动，1029.48cm^-1出现的吸收峰显示AnP2-1具有吡喃环结构。红外光谱显示该物质确实为硫酸酯化多糖化合物。

试验例2体外厌氧发酵

2.1试验方法

1.人体粪便混合物制备：分别向4名志愿者收集新鲜粪便(提供粪便的4名志愿者摄入正常的饮食，没有消化疾病，至少3个月没有服用抗生素)。从每名志愿者粪便中取等量的粪便混合，并立即储存于厌氧罐中。

2.粪便预培养：取粪便混合物(120g)在1L预培养基中厌氧条件下进行预培养(1L预培养基中含10g胰蛋白胨，5g酵母，10g NaCl，5g葡萄糖和6g麦芽糖)。过夜培养后，将120mL的预培养物通过已灭菌的纱布过滤除去大颗粒物后转移至一个厌氧罐中，得已预培养的粪便菌群。

3.酵解：1L酵解培养基中含：4.5g NaCl、4.5g KCl、1.5g NaHCO₃、0.69g MgSO₄·H₂O、0.8g L-半胱氨酸HCl·H₂O、0.5g KH₂PO₄、0.5g K₂HPO₄、0.4g胆汁盐、0.08g CaCl₂、0.005g FeSO₄·7H₂O、1mL吐温80和4mL树脂天青溶液(0.0025％，w/v，厌氧指示剂)。培养基在121℃下灭菌15min后分别装入已预先灭菌的厌氧管中。

将AnP2-1加入已预培养的粪便菌群中进行体外酵解。所有样品和粪便培养物在Forma厌氧系统(10％H₂，10％CO₂和80％N₂)中，加入不同厌氧密闭管(已含有酵解培养基)中。将所有厌氧密闭管在TC-2112B恒温摇床中进行酵解培养(37℃，160rpm)。

2.2试验结果

1.pH测定

在酵解0、12和24h时，取样进行酵解pH测定分析。吸取酵解培养物于测试管，并将测试管置于冰水浴中20min。通过pH计测定酵解培养物中的pH值。每个样品重复测定3次。计算均值和标准偏差。

测定结果见图4。pH值变化时酵解过程总的指标之一。在体外厌氧发酵中浓度为10mg/mL时，酵解培养物的最初pH值为7.5左右，随着酵解时间的延长(0h至24h)，pH值逐渐减低。研究发现，在酵解24h内，具有泡叶藻硫酸酯化多糖的酵解培养物(AnP2-1)的pH值始终低于空白酵解培养物(Blank)的pH值。与空白组相比，泡叶藻硫酸酯化多糖可以降低厌氧发酵体系的pH值，这与AnP2-1酵解培养物含有比Blank酵解培养物显著增加的短链脂肪酸有关。肠道内pH值的降低会使有害菌无法生长繁殖，有效减少甲酸、吲哚、和对-苯甲酚等有毒有害肠道腐败物生成，并降低有害酶，如β-葡萄糖醛酸酶等的生成量和代谢活性，有益于机体健康。

2.短链脂肪酸(SCFA)测定

将粪便培养物离心15min，上清液用于测定。色谱分析通过Agilent 6890N气相色谱和HP-INNOWAX色谱柱进行。GC分析条件：FID检测器，载气为N₂；N₂的流速为19.0mL/min，分流比为1:10。空气的流速为300mL/min，H₂的流速30mL/min；检测器温度为240℃，进样口温度为240℃；升温程序为100℃(0.5min)-180℃(4℃/min)。样品进样量为0.2μL，每次测定时间为20.5min。每个样品均进行3次独立重复测定。通过HP Chem工作站软件进行数据分析。同时进行统计分析。

对建立的GC方法的方法学验证参照食品药品监督局(FDA)关于生物分析方法验证的标准进行。每个分析物的最低检测限(LLOD)等于每个分析物相对于噪音信号5倍的浓度(峰面积)，即测定5个空白中添加的某种标准分析物的浓度。不同标准分析物绘制的标准曲线浓度范围为：乙酸2-80mmol/L；丙酸1.5-60mmol/L；正丁酸1-50mmol/L；异丁酸0.1-5mmol/L；正戊酸0.1-5mmol/L；异戊酸0.1-5mmol/L(每个标准分析物设定10个浓度梯度，每个浓度的标准分析物平行测定三次)。通过测定样品的回收率确定方法的准确度。

测定结果见图5。肠道代谢物是生物化学反应的产物，并能从某种程度上反映生命过程的本质。功能性多糖不能在消化道前段降解，但可被胃肠道特别是盲肠微生物代谢利用，从而改变微生物菌群的构成，促进肠道有益菌的生长，抑制病原菌的滋生，并产生大量的酵解产物，主要是乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸(SCFA)。这些SCFA的氧化能够为人体结肠组织提供超过70％的氧供组织消耗。同时，乙酸能被大脑、心脏和外周组织氧化。丙酸可抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的活性，从而降低胆固醇的合成，影响肝脏和胆固醇代谢。丁酸可以被上皮细胞吸收利用，具有抗炎性，调节氧化应激，并能影响粘液层的组成。SCFA对于维持水电解质平衡、抗病原微生物以及调节肠道菌群平衡、改善肠道功能等具有重要作用。图5表明，与Blank组相比，AnP2-1组能够显著促进乙酸、乳酸、丙酸和丁酸的生成，有利于维持肠道内环境的稳定和平衡。

3.实时定量PCR技术定量分析肠道菌群

以低聚果糖(FOS)为阳性对照，采取与AnP2-1相同的试验条件进行体外厌氧发酵试验，通过实时定量PCR技术定量分析技术得到粪便的菌群组成。粪便中肠道菌群主要门的相对丰度如图6所示。

人体最大的微生态系统，其中大量的微生物称肠道菌群。肠道菌群的组成和结构的改变和一些复杂得到疾病如行为失调、代谢性疾病等有关。比如自闭症、肝性脑病、过敏症、肥胖病、糖尿病及各种神经疾病等。肠道菌群主要是由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)等组成。其中最主要的是拟杆菌门和厚壁菌门，占据着超过98％的绝对优势。

厚壁菌门是人体及高等哺乳动物肠道内最具优势的一大类细菌，能够帮助宿主从饮食中吸收能量，从而与肥胖、糖尿病代谢性疾病的发生相关。厚壁菌门也具有降解人体所不能降解的多糖、为人体提供能量的作用。拟杆菌门是人体肠道内第二大类优势类群，具有碳水化合物发酵、参与多糖代谢、胆汁酸和类固醇代谢、维持肠道正常生理等诸多功能，对人体健康有重要影响。

如图6所示，为发酵24h后菌群的在门水平的变化情况。由图6可得，厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度最高，为粪便中的优势菌群。相比于空白对照组(Blank)，阳性对照组(FOS)中的放线菌门的相对丰度较高，说明低聚果糖作为一种益生元，主要通过促进益生菌群的生长繁殖进行肠道功能的调节。而泡叶藻硫酸酯化多糖AnP2-1有明显的富集拟杆菌门的作用，显著降低厚壁菌门/拟杆菌门的比例，同时降低梭杆菌门的比例。现代研究表明，厚壁菌门与拟杆菌门比值与肥胖等慢性代谢性疾病相关，患有全身性代谢疾病的人体内的厚壁菌门/拟杆菌门水平较高。由此可见，AnP2-1对肠道功能的调节机制不同于低聚果糖，AnP2-1可显著降低厚壁菌门/拟杆菌门的比例，其是通过调节肠道菌群的比例，促进肠道平衡，对调节肠道功能具有重要作用。

试验例3

1.实验动物：

刚断乳的雄性SD大鼠，100只，购于江苏省实验动物中心。

2.食源性肥胖大鼠造模：

10只为标准全价鼠饲料喂养，90只采用高脂饲料喂养，喂养4个月后，以体重超过正常饲料喂养老鼠体重平均值的40％为肥胖标准，造模成功58只。高脂饲料的配方为：标准全价鼠饲料50％、猪油17％、蔗糖10％、奶粉5％、花生5％、鸡蛋10％、麻油1％、及食盐2％。

3.分组及处理方法：

将肥胖大鼠随机分为3组，每组18只。

空白组：模型对照大鼠，灌胃等溶剂生理盐水，连续2个月。

实验组：将实施例1制备的AnP-1和AnP2-1溶于水，以40mg/kg·bw的剂量，连续灌胃2个月。

4.观察指标

在实验前后，分别用电子称称量大鼠的体重(g)，并计算降低率，降低率＝给药后的降低的体重/给药前的体重×100％，结果如表1所示：

表1.大鼠体重变化情况表

由表1可知：在连续给药2个月后，相比于空白组，AnP-1组的大鼠体重的降低幅度很小，AnP2-1组的大鼠体重显著降低。具体地，AnP-1组的大鼠体重降低19±10.57g，降低率为2.92±1.36％；AnP2-1组的大鼠体重降低127±13.71g，降低率为19.9±6.18％。由此表明AnP2-1具有很好的减肥功效。这主要是由于AnP2-1能够调节肠道菌群水平，维持肠道正常功能，促进乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的生产，降低胆固醇等的生成。同时，通过调节肠道菌群水平，降低肠道中厚壁菌门/拟杆菌门水平，减少机体对于能量物质的吸收和利用，达到减肥功效。

综上所述，本发明实施例的泡叶藻硫酸酯化多糖的分子量较大，具有稳定的活性结构，硫酸根含量高，具有肠道益生功能，能够应用于制备肠道益生功能产品。其制备方法简单，工艺条件温和，制备过程中不使用酸碱等有毒有害试剂，适合规模化生产，且制得的产品纯度高。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。