本发明涉及一种小分子三七多糖提取物的制备方法及应用，属于植物活性物质提取分离领域。
背景技术：
在植物糖化学研究中很多报道指出具有治病、防病功效的高活性多糖基本为小分子多糖，大分子多糖功效较弱。免疫系统是一个极其复杂而重要的生理体系，其中吞噬细胞是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线之一，包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等，它们都是先天性免疫系统的重要组分。其中巨噬细胞能够非特异性吞噬和杀灭病原微生物，同时还能够释放一些炎性介质和细胞因子来将其杀灭，此外还能将病原菌提供给T淋巴细胞，激活适应性免疫反应释放各种细胞因子来发挥免疫调节作用。研究发现灵芝多糖(PSG)能通过NF～κB信号通路促进免疫细胞的成熟分化，及细胞因子TNF～α、IL～1β、IL～12，共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达，从而在机体的免疫反应中发挥重要作用。
三七又名金不换，为五加科植物，以其根部作为药用部分，三七主产于我国的云南文山，三七多糖是从三七中提取出来的具有多种生物活性且结构复杂的杂多糖或其复合物。大量研究证明，三七多糖具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、增强免疫力等多种功效。我国目前对三七多糖的开发利用并不多，三七多糖的功效研究、产品开发等还存在着很大的研究价值和空间。
具有活性的三七小分子多糖的提取方法未见报道，相关报道主要集中在三七总多糖提取方法和药理活性研究方面；三七总多糖提取主要有采用干药材粉碎、脱脂、水提、乙醇沉淀法、脱蛋白、干燥得到三七总多糖，但由于提取的大分子多糖含有可溶性纤维素、淀粉等，药效活性很低，且大部分大分子多糖分子量都是几万万、上百万，人体很难吸收，人体要真正吸收发挥作用要通过代谢成小分子成分，所以大分子多糖的利用低。
因此，开展了对三七小分子多糖的研究，可为进一步深入研究我国特有三七资源、提高其附加值、增加种植户收入做出积极贡献，具有较好的经济和社会效益，也可给人们提供新的保健品，为人类健康做出贡献。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供小分子三七多糖提取物的制备方法，该方法以三七为原料，具体操作如下：
（1）在粉碎后的三七粉末中加入质量百分比浓度95～100%乙醇溶液提取处理2～3h ，过滤滤渣重复提取1～2次，丢弃滤液；
（2）在步骤（1）滤渣中加入水并于90～95℃下提取1～2次，提取时间1.5～2小时后过滤合并滤液，丢弃滤渣；
（3）将步骤（2）滤液置于40～60℃下真空浓缩到波美度1.1后，加入高浓度乙醇溶液使得混合液中乙醇浓度为93%～97%，静置3～5h小时后，过滤收集沉淀；
（4）在步骤（3）的沉淀中加入其质量10～15倍的纯净水混匀，然后加入混合物质量3～5%的三氟乙酸，于90～100℃密闭水解20～40min后，40～60℃下真空回收三氟乙酸得小分子多糖粗提液；
或在步骤（3）的沉淀中加入其质量10～15倍的纯净水混匀，然后加入混合物质量2%的溶菌酶，于35℃～45℃水解3～5小时后，升温至100℃灭酶10min得小分子多糖粗提液；
（5）将步骤（4）小分子多糖粗提液过磺酸基强酸性阳离子交换树脂柱，收集流出液体；
（6）将步骤（5）收集的液体过丙烯酸弱碱性阴离子交换树脂柱，收集流出液体；
（7）在步骤（6）收集的液体中加入液体质量1～2%的活性炭粉，混匀后60～65℃下静置0.5h后，用钛棒过滤器过滤得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）将步骤（7）小分子三七多糖溶液浓缩、冷冻干燥后即得小分子三七多糖提取物。
所述步骤（1）中添加的乙醇溶液量是三七粉末质量4～6倍。
所述步骤（2）中添加的水量为滤渣质量6～10倍。
所述钛棒过滤器的滤芯过滤精度为0.25～0.5微米。
本发明另一目的是将上述方法制得的小分子三七多糖应用于制备治疗免疫缺陷或免疫力低下疾病药物中，即制备治疗免疫疾病药物。
本发明所述应用中还可以加入一种或多种药物上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、稀释剂、粘合剂、赋形剂、吸收促进剂、填充剂、表面活性剂和稳定剂等，必要时还可加入香味剂、色素和甜味剂等；或者与其他治疗免疫疾病的药物配合使用。
本发明所述应用除制成胶囊外，还可以制成丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液等多种形式。
本发明方法粗提取采用乙醇脱脂、水提、乙醇沉淀去除大部分蛋白质、果胶、粘液质、淀粉等杂质；然后采用三氟乙酸或溶菌酶水解控制水解反应进程，使得大分子多糖向小分子多糖方向水解转化，尽可能不转化为单糖，比传统酸水解、酶水解反应更为温和可控，小分子多糖收率更高；使用阴阳离子交换柱脱去液体中氨基酸、蛋白质、色素、灰分，替代传统的有机溶剂脱蛋白工艺，解决传统方法中所得多糖灰分超标这一问题，具有更好的工业化操作性；液体冷冻干燥所得产物，避免热风干燥造成小分子多糖成分化学性质改变，提取物经检测蛋白质、淀粉残留极低，本工艺操作简单，成本低，产业化程度高。
本发明采用三七为原料进行提取制备，所得三七小分子多糖收率高、纯度高、色白；常规的多糖糖酸水解采用盐酸、硫酸、酶水解等所得产物大部分为单糖，彻底失去其多糖活性，采用三氟乙酸进行多糖分子切割或溶菌酶水解，反应较为温和所得产物为小分子多糖，其水解试剂溶液去除不带残留，不影响产品质量。
本发明所得提取物中蛋白质、淀粉、灰分、重金属脱除较为彻底，多糖药理活性较高；实验结果显示本发明所得提取物与三七总多糖对照组比较，在细胞增殖效应免疫试验和细胞吞噬效应免疫试验中免疫增强均有显著性差异，说明小分子三七多糖提取物比三七总多糖提取物更能促进免疫力提高，具有治疗免疫疾病的应用前景，且制备方法适于工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容。
实施例1：小分子三七多糖提取物的制备方法如下：
（1）在粉碎后的1kg三七粉末中加入其质量5倍的质量百分比浓度95%乙醇溶液提取3h，过滤滤渣重复提取2次，丢弃滤液得药渣；
（2）在步骤（1）药渣中加入药渣质量8倍的水并于90～93℃下提取2次，提取时间2小时后过滤得滤液，丢弃药渣；
（3）将步骤（2）滤液置于40℃下真空浓缩到波美度1.1后，加入无水乙醇，使得混合液中乙醇浓度为93%，静置3小时，过滤得沉淀；
（4）将步骤（3）中沉淀用其质量12倍的纯净水溶解，然后加入混合液质量4%的三氟乙酸于100℃密闭水解20min后，60℃下真空回收液体中三氟乙酸得小分子多糖粗提液；
（5）将步骤（4）小分子多糖粗提液过磺酸基强酸性阳离子交换树脂(001X10)柱，收集流出液体；
（6）将步骤（5）收集的液体过丙烯酸弱碱性阴离子交换树脂(D202)柱，收集无色流出液；
（7）步骤（6）收集的液体加入液体重量2%的活性炭粉末，混匀后60℃下浸泡半小时后，钛棒过滤器（滤蕊过滤精度0.5微米）过滤得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）将步骤（7）小分三七多糖溶液浓缩到原体积1/3后，冷冻干燥得活性小分子三七多糖提取物31g，多糖含量87%，灰分2ppm，含氮量未检出。
实施例2：小分子三七多糖提取物的制备方法如下：
（1）在粉碎后的1kg三七粉末中加入其质量4倍的无水乙醇提取2h，过滤滤渣重复提取1次，丢弃滤液得药渣；
（2）在步骤（1）药渣中加入药渣质量7倍的水并于90-93℃下提取2次，提取时间1.5小时后过滤得滤液，丢弃药渣；
（3）将步骤（2）滤液置于50℃下真空浓缩到波美度1.1后，加入无水乙醇，使得混合液中乙醇浓度为97%，静置4小时，过滤得沉淀；
（4）在步骤（3）的沉淀加入其质量10倍的纯净水溶解，然后加入混合物质量2%溶菌酶，于35℃水解5小时后，升温至100℃灭酶10分钟得小分子多糖粗提液；
（5）将步骤（4）小分子多糖粗提液过磺酸基强酸性阳离子交换树脂(001X4)柱，收集流出液体；
（6）将步骤（5）收集的液体过丙烯酸弱碱性阴离子交换树脂(D941)柱，收集无色流出液；
（7）步骤（6）收集的液体加入液体重量1%的活性炭粉末，混匀后60℃下浸泡半小时后用钛棒过滤器（滤蕊0.3微米）过滤得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）将步骤（7）小分子三七多糖溶液浓缩到原体积1/3后，冷冻干燥得小分子三七多糖提取物24克，多糖含量88%，灰分2ppm，含氮量未检出。
实施例3：小分子三七多糖提取物的制备方法如下：
（1）在粉碎后的1kg三七粉末中加入其质量4倍的无水乙醇提取2h，过滤滤渣重复提取1次，丢弃滤液得药渣；
（2）在步骤（1）药渣中加入药渣质量6倍的水并于90～95℃下提取1次，提取时间1.5小时后过滤得滤液，丢弃药渣；
（3）将步骤（2）滤液置于50℃下真空浓缩到波美度1.1后，加入无水乙醇，使得混合液中乙醇浓度为97%，静置4小时，过滤得沉淀；
（4）将步骤（3）中沉淀用其质量10倍的纯净水溶解，然后加入混合液质量3%的三氟乙酸于90℃密闭水解30min后，50℃下真空回收液体中三氟乙酸得小分子多糖粗提液；
（5）将步骤（4）小分子多糖粗提液过磺酸基强酸性阳离子交换树脂(001X4)柱，收集流出液体；
（6）将步骤（5）收集的液体过丙烯酸弱碱性阴离子交换树脂(D941)柱，收集无色流出液；
（7）步骤（6）收集的液体加入液体重量1%的活性炭粉末，混匀后60℃下浸泡半小时后，钛棒过滤器（滤蕊过滤精度0.25微米）过滤得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）将步骤（7）小分三七多糖溶液浓缩到过滤后体积积1/3后，冷冻干燥得活性小分子三七多糖提取物25g，多糖含量84%，灰分2ppm，含氮量未检出。
采用MTT法检测本实施例3提取物对RAW264.7细胞的增殖效应：
1、实验细胞：小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自上海细胞所，培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中（含100 mg·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素），置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，每天换液，隔2天传代1次；
2、药品的制备：小分子三七多糖提取物溶于一定量细胞培养液中，使得溶液中三七多糖终浓度为5、10、20、40、80、160 µg/mL，过滤（0.22µm滤膜）除菌，-20℃分装保存；
3、实验方法
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3 - ( 4,5 ) - dimethylthiahiazo ( - z - y1 ) - 3,5 – di – phenytetrazoliumromide，MTT四甲基偶氮唑盐为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四唑环开裂，生成蓝色的甲臜结晶，甲臜结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）；还原生成的甲臜结晶可在DMSO溶解液中溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
4、分析方法：调节RAW264.7细胞浓度为5×104个/mL，每孔加入细胞悬浮液100µL，培养4小时后洗去未贴壁细胞，然后分别加入不同浓度的小分子三七多糖、三七总多糖（终浓度为5、10、20、40、80、160 µg/mL），同时设置1 µg/mL的LPS，空白对照孔；每组均设6个复孔；5%CO2，37℃孵育24小时，倒置显微镜观察，加入含5% MTT的培养液20µL，4小时后终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150 µL二甲亚砜震荡10分钟，使结晶充分溶解，酶标仪570 nm 波长检测吸光值，计算细胞相对存活率。
细胞相对增殖率=（实验组吸光值-对照组吸光值）/对照组吸光值×100%；
5、实验结果见表1：
表1：本实施例小分子三七多糖提取物对RAW264.7细胞的增殖影响
；
6、结论
MTT实验结果显示，无论三七总多糖、小分子三七多糖提取物、不同剂量（5，10，20，40，80，160 µg/mL）作用RAW264.7细胞24h后均可促进巨噬细胞的生长，且随着剂量的增加，增殖率逐渐升高，达到最高点（40 mg·L-1）后增殖率逐渐下降，但仍表现为促进细胞生长，说明小分子三七多糖提取物无细胞毒作用；比较低浓度的三七总多糖，小分子三七多糖提取物具有促进细胞增殖的效果，尤其是低浓度组明显优于总多糖。
实施例4：小分子三七多糖提取物的制备方法如下：
（1）在粉碎后的1kg三七粉末中加入其质量5倍的质量百分比浓度95%乙醇溶液提取3h，过滤滤渣重复提取2次，丢弃滤液得药渣；
（2）在步骤（1）药渣中加入药渣质量8倍的水并于90～93℃下提取2次，提取时间2小时后过滤得滤液，丢弃药渣；
（3）将步骤（2）滤液置于40℃下真空浓缩到波美度1.1后，加入无水乙醇，使得混合液中乙醇浓度为93%，静置3小时，过滤得沉淀；
（4）将步骤（3）中沉淀用其质量12倍的纯净水溶解，然后加入混合液质量4%的三氟乙酸于100℃密闭水解20min后，60℃下真空回收液体中三氟乙酸得小分子多糖粗提液；
（5）将步骤（4）小分子多糖粗提液过磺酸基强酸性阳离子交换树脂(001X10)柱，收集流出液体；
（6）将步骤（5）收集的液体过丙烯酸弱碱性阴离子交换树脂(D202)柱，收集无色流出液；
（7）步骤（6）收集的液体加入液体重量2%的活性炭粉末，混匀后60℃下浸泡半小时后，钛棒过滤器（滤蕊过滤精度0.4微米）过滤得低粘性小分子三七多糖溶液；
（8）将步骤（7）小分三七多糖溶液浓缩到过滤后体积1/3，冷冻干燥得活性小分子三七多糖提取物30g，多糖含量89%，灰分1ppm，含氮量未检出。
采用中性红法检测实施例4小分子三七多糖提取物对RAW264.7细胞的吞噬效应；
1、实验细胞：小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自上海细胞所，培养于含10% 胎牛血清的RPMI1640培养液中（含100 mg·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素），置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，每天换液，隔2天传代1次；
2、药品的制备：小分子三七多糖提取物溶于一定量细胞培养液中，使得三七多糖多糖终浓度为5、10、20、40、80、160 µg/mL，过滤（0.22µm滤膜）除菌，-20℃分装保存；
3、实验方法：
正常情况下，巨噬细胞处于静息状态，被激活后吞噬活性增加，可以通过检测期吞噬活性来衡量其免疫活性的增加。静息状态的巨噬细胞受到刺激后，吞噬功能增强，吞噬活性的大小反映了药物的药理活性。中性红法检测巨噬细胞吞噬功能是通过巨噬细胞对中性红的吞噬量来反映巨噬细胞的吞噬能力，是快速筛选巨噬细胞吞噬功能调节成分的常用细胞模型。
4、分析方法：三七总多糖、小分子三七多糖提取物（终浓度为5、10、20、40、80、160 µg/mL）作用于终浓度为106 /mL RAW264.7巨噬细胞24 h，同时设置1 µg/mL的LPS，空白对照孔。弃上清，加入0.1%中性红（100 mg中性红/100 mL生理盐水）溶液100 µL /孔，培养3小时后以温PBS洗3次，加入细胞裂解液（醋酸：乙醇=1：1）200 µL/孔，静置30 min，用酶标仪测定巨噬细胞吞噬的中性红，以A540值表示，计算吞噬指数。
吞噬指数=（实验组吸光值/对照组吸光值-1）×100%；
5、实验结果见表2：
巨噬细胞在机体特异性免疫、非特异性免疫中发挥着重要而不可缺少的作用，对侵入机体的异物及衰老死亡的细胞具有吞噬功能，也是机体抗肿瘤的第一道防线，而且吞噬能力作为检测巨噬细胞功能的重要指标。为了检测在三七多糖是否可增强巨噬细胞的吞噬活性，因此在体外测定了三七多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响。
表2：三七多糖对RAW264.7细胞的增殖影响
；
6、结论：
实验结果显示，无论三七总多糖、小分子三七多糖提取物（5，10，20，40，80，160 µg/mL）处理RAW264.7巨噬细胞24h后，都能促进巨噬细胞细胞活化，显著提高吞噬中性红的能力，并且随着药物浓度的增加，巨噬细胞的吞噬能力也显著增加，高浓度时促进活性逐渐下降。纵向比较发现：总多糖和小分子三七多糖提取物（57.34%＞小分子纯多糖54.76%＞三七总多糖53.96%），这表明小分子三七多糖能够刺激巨噬细胞，使巨噬细胞进一步分化成熟，成为活化的巨噬细胞，并使其吞噬能力得到显著增强。