本发明涉及一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法。
背景技术：
茯苓是我国传统的用于利尿和镇定的中药，茯苓多糖是茯苓的主要有效成分，占干燥菌核90％以上，开发利用茯苓多糖资源有极大的经济价值。茯苓多糖为带有少量β-1，6分支的β-1，3葡聚糖，主链每50个葡萄糖残基单位中有1个β-1，6结合的葡萄糖糖苷支链和1～2个β-1，6葡萄糖糖苷间隔。众多文献报导食药用菌多糖通过作用于淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统而调节机体的免疫功能，在治疗肿瘤、心血管疾病、肝炎、糖尿病、甚至爱滋病方面显示出特殊的疗效，其中β-D-(1-3-1-6)葡聚糖显示出更显著的调理作用，但和茯苓多糖一样，很多葡聚糖的水溶性很差，只有对这些多糖进行结构修饰，增加其水溶性，才可以更好地利用它们。将天然多糖进行硫酸酯化修饰也是多糖结构改造的一个研究热点，多糖硫酸化后可以增强原有的生物活性或产生新的功能。多糖硫酸化方法主要有浓硫酸法、三氧化硫、吡啶法和氯磺酸，吡啶法(woLFRoM&SHEN法)等，其中氯磺酸，吡啶法因磺化效率高、成本低而得到广泛使用。
技术实现要素：
本发明提出一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法。
一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）称取100g茯苓粉，分3次溶于总共为10倍体积的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀过夜，在4℃环境中、5000g离心20min，收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3次，用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；
（2）将附有冷凝管和搅拌装置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力搅拌器搅拌，使之充分冷却，用分液漏斗按10：1体积比慢慢加入氯磺酸10mL；
（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖样品，迅速将容量瓶移入沸水浴中，电动搅拌器100℃恒温搅拌反应1h；
（4）反应结束后，将反应液倒入圆底烧瓶中，旋转蒸发仪上减压蒸馏回收吡啶50mL；
（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍体积无水乙醇沉淀；
（6）沉淀重新溶于100mL水中；
（7）于透析袋中对自来水透析，再对蒸馏水透析；
（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微变酸的透析液，保证最终硫酸化产物为钠盐；在45℃减压浓缩后冷冻干燥后即得。
优选地，所述步骤（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min。
优选地，所述多糖样品中，氯磺酸/单糖残基的摩尔比为4：1。
优选地，所述步骤（7）的自来水透析的温度为20℃，时间为2d。
优选地，所述步骤（7）的蒸馏水透析的温度为20℃，时间为1d。
本发明所述方法制备的茯苓多糖硫酸酯磺化效率高，分子量小，生产成本低、环境污染小。
具体实施方式
实施例1。
一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取100g茯苓粉，分3次溶于总共为10倍体积的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀过夜，在4℃环境中、5000g离心20min，收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3次，用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；
（2）将附有冷凝管和搅拌装置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力搅拌器搅拌，使之充分冷却，用分液漏斗按10：1体积比慢慢加入氯磺酸10mL；
（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖样品，迅速将容量瓶移入沸水浴中，电动搅拌器100℃恒温搅拌反应1h；
（4）反应结束后，将反应液倒入圆底烧瓶中，旋转蒸发仪上减压蒸馏回收吡啶50mL；
（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍体积无水乙醇沉淀；
（6）沉淀重新溶于100mL水中；
（7）于透析袋中对自来水透析，再对蒸馏水透析；
（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微变酸的透析液，保证最终硫酸化产物为钠盐；在45℃减压浓缩后冷冻干燥后即得。
实施例2。
一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取100g茯苓粉，分3次溶于总共为10倍体积的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀过夜，在4℃环境中、5000g离心20min，收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3次，用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；
（2）将附有冷凝管和搅拌装置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力搅拌器搅拌，使之充分冷却，用分液漏斗按10：1体积比慢慢加入氯磺酸10mL；
（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖样品，迅速将容量瓶移入沸水浴中，电动搅拌器100℃恒温搅拌反应1h；
（4）反应结束后，将反应液倒入圆底烧瓶中，旋转蒸发仪上减压蒸馏回收吡啶50mL；
（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍体积无水乙醇沉淀；
（6）沉淀重新溶于100mL水中；
（7）于透析袋中对自来水透析，再对蒸馏水透析；
（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微变酸的透析液，保证最终硫酸化产物为钠盐；在45℃减压浓缩后冷冻干燥后即得；
（9）所述步骤（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min。
实施例3。
一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，于包括以下步骤：
（1）称取100g茯苓粉，分3次溶于总共为10倍体积的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀过夜，在4℃环境中、5000g离心20min，收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3次，用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；
（2）将附有冷凝管和搅拌装置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力搅拌器搅拌，使之充分冷却，用分液漏斗按10：1体积比慢慢加入氯磺酸10mL；
（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖样品，迅速将容量瓶移入沸水浴中，电动搅拌器100℃恒温搅拌反应1h；
（4）反应结束后，将反应液倒入圆底烧瓶中，旋转蒸发仪上减压蒸馏回收吡啶50mL；
（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍体积无水乙醇沉淀；
（6）沉淀重新溶于100mL水中；
（7）于透析袋中对自来水透析，再对蒸馏水透析；
（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微变酸的透析液，保证最终硫酸化产物为钠盐；在45℃减压浓缩后冷冻干燥后即得；
（9）所述步骤（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min；
（10）所述多糖样品中，氯磺酸/单糖残基的摩尔比为4：1。
实施例4。
一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取100g茯苓粉，分3次溶于总共为10倍体积的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀过夜，在4℃环境中、5000g离心20min，收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3次，用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；
（2）将附有冷凝管和搅拌装置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力搅拌器搅拌，使之充分冷却，用分液漏斗按10：1体积比慢慢加入氯磺酸10mL；
（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖样品，迅速将容量瓶移入沸水浴中，电动搅拌器100℃恒温搅拌反应1h；
（4）反应结束后，将反应液倒入圆底烧瓶中，旋转蒸发仪上减压蒸馏回收吡啶50mL；
（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍体积无水乙醇沉淀；
（6）沉淀重新溶于100mL水中；
（7）于透析袋中对自来水透析，再对蒸馏水透析；
（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微变酸的透析液，保证最终硫酸化产物为钠盐；在45℃减压浓缩后冷冻干燥后即得；
（9）所述步骤（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min；
（10）所述多糖样品中，氯磺酸/单糖残基的摩尔比为4：1；
（11）所述步骤（7）的自来水透析的温度为20℃，时间为2d。
实施例5。
一种茯苓多糖硫酸酯的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取100g茯苓粉，分3次溶于总共为10倍体积的0.5mol/LNaoH中，每次4℃浸提多糖8h，合并3次浸提上清液，10％醋酸中和至pH6～7，4℃冰箱中沉淀过夜，在4℃环境中、5000g离心20min，收集沉淀，去离子水洗涤沉淀3次，用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤3次，于70℃干燥得白色茯苓多糖，研成粉末待用；
（2）将附有冷凝管和搅拌装置的容量瓶置冰浴中，加入吡啶100mL，磁力搅拌器搅拌，使之充分冷却，用分液漏斗按10：1体积比慢慢加入氯磺酸10mL；
（3）加人6g待硫酸化干燥的多糖样品，迅速将容量瓶移入沸水浴中，电动搅拌器100℃恒温搅拌反应1h；
（4）反应结束后，将反应液倒入圆底烧瓶中，旋转蒸发仪上减压蒸馏回收吡啶50mL；
（5）然后加人100mL水，用2．5mol/LNaoH中和至pH7～8，再加入3倍体积无水乙醇沉淀；
（6）沉淀重新溶于100mL水中；
（7）于透析袋中对自来水透析，再对蒸馏水透析；
（8）用0．5mol/LNaoH中和稍微变酸的透析液，保证最终硫酸化产物为钠盐；在45℃减压浓缩后冷冻干燥后即得；
（9）所述步骤（2）氯磺酸的加入速度<0.3mL/min；
（10）所述多糖样品中，氯磺酸/单糖残基的摩尔比为4：1；
（11）所述步骤（7）的自来水透析的温度为20℃，时间为2d；
所述步骤（7）的蒸馏水透析的温度为20℃，时间为1d。