本发明属于水产品深加工领域，特别涉及一种贻贝多糖的工业化提取方法。
背景技术：
贻贝(Mytilus sp.)属于双壳类的一种贝类，是海洋贝类养殖中的重要种类，又名海红，俗称“海中鸡蛋”，味道鲜味，营养丰富。由于贻贝产量大，收获后不易保存，历来多煮熟后加工成干品——淡菜。淡菜营养价值很高，并有一定的药用价值，在《本草纲目》、《本草拾遗》及《日华子本草》中均有记载。现代药理学研究表明，贻贝具有提高免疫力、抗肿瘤、清除氧自由基、抗动脉粥样硬化、降血脂、抑制血栓的形成、改善心肌供氧及保护实验性心肌缺血、改善微循环和降血压等功效。其体内的多糖成分在贻贝的药用功效中起重要作用，贻贝多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、降血脂、预防心脑血管疾病等多种功效，因此贻贝多糖在药品和保健品领域具有巨大的市场前景。
现有贻贝多糖提取工艺多以新鲜贻贝为材料，经匀浆或干燥粉碎后进行多糖提取，在多糖纯化过程中大量应用离心、萃取、冷冻干燥等操作，大量使用氯仿、正丁醇等毒性较大的有机试剂。具有原料易腐烂变质、操作复杂、多糖收率低、能耗高、污染重等缺陷，不适于工业化放大。因此迫切需要对现有工艺进行改进，开发绿色高效的贻贝多糖提取方法。
技术实现要素：
为了克服上述不足，本发明提供一种贻贝多糖的工业化提取方法。采用冻煮贻贝干作为多糖提取材料，利用冻煮贻贝干可长期存放的优点，有效解决了鲜贻贝不易存放导致的贻贝多糖无法量产的问题。同时，冻煮贻贝干在加工过程可大量除去贻贝肉中的脂肪成分，在贻贝多糖提取过程中不需要再去除脂肪，简化了处理流程。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种贻贝多糖的工业化提取方法，包括：
将预处理后的冻煮贻贝干粉末高温浸提、除渣，得多糖提取液；
将多糖提取液酶解、过滤Ⅰ、沉淀，得多糖沉淀；
将多糖沉淀脱水、过滤Ⅱ、干燥，即得。
本发明所述“高温”是指：处理温度为80～100℃。
现有的贻贝多糖实验室提取方法浸提温度一般为30～60℃，浸提时间10～30h，不适合工业化应用。本发明研究发现：80～100℃条件下提取贻贝多糖收率高、时间短(1-5h)，且贻贝多糖未发生降解。同时，高温浸提可使大部分蛋白质变性沉淀，简化了后续除蛋白步骤。
优选的，所述预处理的步骤为：用粉碎机对冻煮贻贝干进行粉碎，粉碎机筛网为20～40目。
优选的，所述高温浸提的条件为80～100℃下提取1～5小时。
优选的，所述酶解处理采用碱性蛋白酶。为除蛋白，常规的贻贝多糖提取方法采用sevage法(氯仿/正丁醇＝5:1)或蛋白酶水解与sevage法联用，所选蛋白酶包括胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等等。本发明对比了贻贝多糖提取过程中不同蛋白酶除蛋白的效果，选择不同厂家不同种类的蛋白酶进行实验，发现胰蛋白酶和碱性蛋白酶均可以单独完全除去蛋白，其他蛋白酶除蛋白效果较差。胰蛋白酶虽然可以完全除去蛋白，但对多糖收率有影响，会使多糖收率降低50％以上。碱性蛋白酶不仅可完全除去蛋白，而且对多糖收率没有影响。同时，由于前期的高温浸提过程中大部分蛋白已变性沉淀，因此碱性蛋白酶可以完全除去蛋白，所以本发明中除蛋白仅采用酶解的方法，而不需要再加入sevage法这种使用有机溶剂的步骤，避免了氯仿等有机试剂的使用，不仅降低了成本，而且工艺更加绿色环保。
更优选的，所述碱性蛋白酶的加入量为多糖提取液质量的0.05％～0.5％。当碱性蛋白酶的加入量小于0.05％时，蛋白质的去除不完全，多糖纯度下降；当碱性蛋白酶的加入量大于0.5％时，多糖纯度不变，硅藻土用量显著增加。
优选的，所述过滤Ⅰ处理的具体步骤为：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对酶解液进行过滤。
常规的贻贝多糖提取方法中固液分离普遍采用高速离心的方法，离心机尤其是高速离心机设备昂贵，样品处理量小，工业上的固液分离多采用易于放大，成本低的过滤方法。因此，本发明中优选的固液分离有3处，第一为除渣步骤，这一步的作用是除去贻贝肉蒸煮后剩余的肉渣(肉渣中主要成分为蛋白质)，若不去除将会影响后续的除蛋白效果，由于肉渣较大，采用孔径较大的筛网便可以将肉渣滤出。第二为酶解除蛋白后，从贻贝干粉末蒸煮到除蛋白中间只除去了大块的肉渣，提取液仍是浑浊的，其中包含贻贝肉中存在的细沙、灰尘、少量脂类、变性蛋白等多种不溶性杂质。这一步骤要除去所有不溶性物质，因此选用板框过滤，用颗粒较细的硅藻土作为助滤剂，可得到澄清的多糖提取液。第三为多糖沉淀后过滤，乙醇沉淀多糖后要将多糖沉淀分离出来，这一步骤需要选取合适孔径的筛网或滤膜，孔径太小的话过滤速度慢，孔径太大则多糖沉淀能通过，经试验选择400目筛网进行多糖沉淀过滤。
更优选的，所述硅藻土用量为1～4公斤/平方米。
优选的，所述沉淀处理为乙醇沉淀法。
本发明还提供了一种较优的贻贝多糖的工业化提取方法，步骤如下：
(1)原料处理：以冻煮贻贝干为原料，粉碎机粉碎，过20～40目筛，得贻贝干粉；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的贻贝干粉投入提取罐中，加入4～10倍体积的水，在80～100℃提取1～5小时，搅拌桨转速20～100转/分钟；
(3)除渣：用50～100目筛网分离贻贝肉渣与多糖提取液；
(4)酶解：将步骤(3)制得的多糖提取液用HCl调pH至8.0，加入质量比为0.05％～0.5％的碱性蛋白酶，50℃酶解0.5～3小时，酶解完成后在80～100℃条件下灭活10～20分钟，得酶解液；
(5)过滤：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对步骤(4)制得的酶解液进行过滤，得到澄清的多糖溶液；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入1.5～3倍体积质量分数为90％～95％的酒精进行多糖沉淀，静置3～10小时，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1倍体积质量分数为90％～95％的酒精对多糖沉淀进行脱水；
(8)过滤干燥：用400目筛网对脱水后的多糖沉淀进行过滤，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品。
其中，上述步骤(1)中的冻煮贻贝干又称“淡菜干”，为鲜贻贝经蒸煮、冷却、去壳、漂洗、干燥等步骤加工而成的贻贝干品。
上述步骤(5)中的硅藻土用量为1～4公斤/平方米。
以上操作步骤、实验条件及试剂如无特别说明，均采用本领域常规操作和常用试剂。
本发明还提供了任一上述的方法制备的贻贝多糖，采用上述方法生产贻贝多糖，其产量可达10吨/年以上。
本发明还提供了上述制备的贻贝多糖在制备调血脂药物或食品中的应用。
本发明的有益效果
1)本发明所述方法选用冻煮贻贝干为原料，冻煮贻贝干为干品，可长期存放，能有效解决鲜贻贝不易存放的问题。同时，冻煮贻贝干的加工过程可大量除去贻贝肉中的脂肪成分，在贻贝多糖提取过程中不需要再去除脂肪；
2)采用高温提取多糖，可有效提高多糖得率，缩短提取时间，同时高温使蛋白质变性，可简化蛋白去除步骤；
3)采用碱性蛋白酶水解蛋白，避免了氯仿等有机试剂的使用，不仅降低了成本，而且工艺更加绿色环保；
4)采用筛网过滤和板框过滤代替离心，使工艺更适于工业化放大。
5)本发明制备方法简单、多糖收率高、实用性强，易于推广。
附图说明
图1：利用本发明所述方法制备的贻贝多糖。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明特征及其它相关特征作进一步详细说明，以便于同行业技术人员的理解：
实施例1：厚壳贻贝多糖工业化提取
贻贝多糖提取：
(1)原料处理：以浙江省嵊泗县产冻煮厚壳贻贝干为原料，粉碎机粉碎，过20目筛，得贻贝干粉；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的贻贝干粉投入提取罐中，加入6倍体积的水，在100℃提取2小时，搅拌桨转速60转/分钟；
(3)除渣：用50目筛网分离贻贝肉渣与多糖提取液；
(4)酶解：将步骤(3)制得的多糖提取液用NaOH调pH至8.0，加入质量比为0.2％的碱性蛋白酶，50℃酶解2小时，酶解完成后在80℃条件下灭活15分钟，得酶解液；
(5)过滤：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对步骤(4)制得的酶解液进行过滤，得到澄清的多糖溶液，硅藻土用量为2公斤/平方米；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入1.5倍体积质量分数为93％的酒精进行多糖沉淀，静置6小时，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1倍体积质量分数为93％的酒精对多糖沉淀进行脱水；
(8)过滤干燥：用400目筛网对脱水后的多糖沉淀进行过滤，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品(附图1)，多糖得率12.4％，经苯酚-硫酸法测定贻贝多糖含量为92％。
贻贝多糖调血脂实验
选雄性Wistar大鼠60只(由山东鲁抗医药集团有限公司提供，合格证号SCXK鲁20130001)，体重180±20g，随机分为5组，分别为空白组，模型组，高剂量组(400mg/kg)，中剂量组(200mg/kg)和低剂量组(100mg/kg)。全部大鼠喂养基础饲料观察1周，禁食12h后称重，眼内眦取血，室温25℃静置1h，3000rpm离心10min，取血清，用自动生化分析仪测定TC，TG，HDL-C和LDL-C水平。空白组始终基础饲料喂养，其余各组大鼠均用高脂饲料喂养(高脂饲料购于北京科澳协力饲料有限公司)，2周后眼内眦取血(取血前禁食12h)，测定血清TC(总胆固醇)，TG(甘油三酯)，HDL-C(高密度脂蛋白胆固醇)和LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)水平，用高脂饲料喂养2周后各组大鼠血清总胆固醇水平和甘油三酯水平与空白组比较有显著性差异(p<0.05)，表明脂代谢紊乱模型成功建立。
脂代谢紊乱模型建立成功后，空白组与模型组每日灌胃蒸馏水1mL，贻贝多糖高、中、低剂量组分别按照相应的剂量每天灌胃给药1次，连续6周。给药6周后大鼠隔夜禁食12h，眼内眦取血，测定血清TC，TG，HDL-C和LDL-C水平。
检测结果均以表示，采用SPSS13.0软件进行统计，并进行组间差异性分析。
与模型组相比，贻贝多糖高、中、低剂量组给药6周后均能降低大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平，且呈剂量相关性，剂量越高，降低程度越显著，各剂量组对高密度脂蛋白胆固醇水平无明显作用(表1)。其中，高、中剂量组能显著降低大鼠血清总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平(p<0.05)；低剂量组能显著降低大鼠血清中甘油三酯水平(p<0.05)。贻贝多糖能使脂代谢紊乱大鼠的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平明显降低，表明贻贝粗多糖有一定的调血脂功能。
表1 各组大鼠血清中血脂水平测定结果(n＝8-10)
*与空白组比较p<0.05,#与模型组比较p<0.05
实施例2：
(1)原料处理：以浙江省嵊泗县产冻煮紫贻贝干为原料，粉碎机粉碎，过20目筛，得贻贝干粉；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的贻贝干粉投入提取罐中，加入6倍体积的水，在100℃提取2小时，搅拌桨转速60转/分钟；
(3)除渣：用50目筛网分离贻贝肉渣与多糖提取液；
(4)酶解：将步骤(3)制得的多糖提取液用HCl调pH至8.0，加入质量比为0.2％的碱性蛋白酶，50℃酶解2小时，酶解完成后在80℃条件下灭活15分钟，得酶解液；
(5)过滤：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对步骤(4)制得的酶解液进行过滤，得到澄清的多糖溶液，硅藻土用量为2公斤/平方米；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入1.5倍体积质量分数为93％的酒精进行多糖沉淀，静置6小时，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1倍体积质量分数为93％的酒精对多糖沉淀进行脱水；
(8)过滤干燥：用400目筛网对脱水后的多糖沉淀进行过滤，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品，多糖得率9.4％，经苯酚-硫酸法测定贻贝多糖含量为87％。
实施例3：
(1)原料处理：以浙江省嵊泗县产冻煮紫贻贝干为原料，粉碎机粉碎，过40目筛，得贻贝干粉；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的贻贝干粉投入提取罐中，加入5倍体积的水，在90℃提取4小时，搅拌桨转速30转/分钟；
(3)除渣：用80目筛网分离贻贝肉渣与多糖提取液；
(4)酶解：将步骤(3)制得的多糖提取液用HCl调pH至8.0，加入质量比为0.1％的碱性蛋白酶，50℃酶解3小时，酶解完成后在80℃条件下灭活20分钟，得酶解液；
(5)过滤：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对步骤(4)制得的酶解液进行过滤，得到澄清的多糖溶液，硅藻土用量为3公斤/平方米；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入2倍体积质量分数为90％的酒精进行多糖沉淀，静置8小时，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1倍体积质量分数为90％的酒精对多糖沉淀进行脱水；
(8)过滤干燥：用400目筛网对脱水后的多糖沉淀进行过滤，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品，多糖得率10.1％，经苯酚-硫酸法测定贻贝多糖含量为84％。
实施例4：
(1)原料处理：以浙江省嵊泗县产冻煮紫贻贝干为原料，粉碎机粉碎，过40目筛，得贻贝干粉；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的贻贝干粉投入提取罐中，加入8倍体积的水，在100℃提取2小时，搅拌桨转速100转/分钟；
(3)除渣：用50目筛网分离贻贝肉渣与多糖提取液；
(4)酶解：将步骤(3)制得的多糖提取液用HCl调pH至8.0，加入质量比为0.2％的碱性蛋白酶，50℃酶解2小时，酶解完成后在80℃条件下灭活15分钟，得酶解液；
(5)过滤：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对步骤(4)制得的酶解液进行过滤，得到澄清的多糖溶液，硅藻土用量为1公斤/平方米；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入1.5倍体积质量分数为95％的酒精进行多糖沉淀，静置6小时，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1倍体积质量分数为95％的酒精对多糖沉淀进行脱水；
(8)过滤干燥：用400目筛网对脱水后的多糖沉淀进行过滤，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品，多糖得率9.2％，经苯酚-硫酸法测定贻贝多糖含量为89％。
实施例5：
(1)原料处理：以山东省烟台市产冻煮紫贻贝干为原料，粉碎机粉碎，过20目筛，得贻贝干粉；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的贻贝干粉投入提取罐中，加入10倍体积的水，在100℃提取5小时，搅拌桨转速20转/分钟；
(3)除渣：用50目筛网分离贻贝肉渣与多糖提取液；
(4)酶解：将步骤(3)制得的多糖提取液用HCl调pH至8.0，加入质量比为0.05％的碱性蛋白酶，50℃酶解3小时，酶解完成后在80℃条件下灭活10分钟，得酶解液；
(5)过滤：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对步骤(4)制得的酶解液进行过滤，得到澄清的多糖溶液，硅藻土用量为4公斤/平方米；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入1.5倍体积质量分数为92％的酒精进行多糖沉淀，静置6小时，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1倍体积质量分数为92％的酒精对多糖沉淀进行脱水；
(8)过滤干燥：用400目筛网对脱水后的多糖沉淀进行过滤，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品，多糖得率8.5％，经苯酚-硫酸法测定贻贝多糖含量为82％。
实施例6：
(1)原料处理：以江苏省连云港市产冻煮厚壳贻贝干为原料，粉碎机粉碎，过40目筛，得贻贝干粉；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的贻贝干粉投入提取罐中，加入4倍体积的水，在100℃提取2小时，搅拌桨转速60转/分钟；
(3)除渣：用80目筛网分离贻贝肉渣与多糖提取液；
(4)酶解：将步骤(3)制得的多糖提取液用HCl调pH至8.0，加入质量比为0.5％的碱性蛋白酶，50℃酶解1小时，酶解完成后在80℃条件下灭活20分钟，得酶解液；
(5)过滤：以硅藻土为助滤剂，用板框过滤对步骤(4)制得的酶解液进行过滤，得到澄清的多糖溶液，硅藻土用量为3公斤/平方米；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入1.5倍体积质量分数为93％的酒精进行多糖沉淀，静置6小时，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1倍体积质量分数为93％的酒精对多糖沉淀进行脱水；
(8)过滤干燥：用400目筛网对脱水后的多糖沉淀进行过滤，收集沉淀，60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品，多糖得率7.9％，经苯酚-硫酸法测定贻贝多糖含量为86％。
对比例1：厚壳贻贝多糖常规方法提取(1)原料处理：以浙江省嵊泗县产鲜厚壳贻贝为原料，洗净后去壳、匀浆、脱脂，5000rpm离心10分钟，取沉淀备用；
(2)多糖提取：将步骤(1)制得的沉淀投入提取罐中，加入6倍体积的水，在60℃提取10小时，搅拌桨转速60转/分钟，得多糖提取液；
(3)酶解：将步骤(2)制得的多糖提取液用NaOH调pH至8.0，加入质量比为0.2％的碱性蛋白酶，50℃酶解2小时，酶解完成后在80℃条件下灭活15分钟，得酶解液
(4)离心：步骤(3)制得的酶解液12000rpm离心15分钟，弃沉淀，取上清液；
(5)除蛋白：采用sevage法脱蛋白，在步骤(3)得到的上清液中加入1/2体积的氯仿/异戊醇(5:1，v/v)，剧烈震荡20分钟，12000rpm离心10分钟，取上层水相。该步骤重复2-5次至水相-有机相交界处无变性蛋白质为止，得到多糖溶液；
(6)乙醇沉淀：在步骤(5)制得的多糖溶液中加入4倍体积质量分数为95％的酒精进行多糖沉淀，静置6小时，抽出上清液，得到多糖沉淀；
(7)脱水：在步骤(6)制得的多糖沉淀中加入1倍体积质量分数为95％的酒精对多糖沉淀进行脱水，12000rpm离心10分钟，收集沉淀；
(8)干燥：步骤(7)制得的多糖沉淀经60℃真空干燥，得到白色贻贝多糖成品，多糖得率4.5％，经苯酚-硫酸法测定贻贝多糖含量为72％。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。