本发明涉及独一味多糖的提取方法与检测方法。
背景技术：
：独一味来源于唇形科植物独一味Lamiophlomisrotata的全草，是重要的青藏高原药用植物和常用大宗藏药,为一级濒危藏药品种,主要分布在甘肃、青海、四川、云南、西藏等地[2]。《四部医典》和《晶珠本草》中记载本品有强筋骨,干黄水,止痛之功[3]。2010年版《中国药典》记载其功能与主治为：活血止血，祛风止痛。用于跌打损伤，外伤出血，风湿痹痛，黄水病。文献报道独一味中主要含有环烯醚萜苷、黄酮类、苯乙醇苷以及多糖、嘧啶等成分。但是对独一味中的多糖类成分鲜有报道，现有研究表明，独一味含有一定量多糖，对其进行含量测定对于独一味药材的质量控制具有参考意义。多糖polysacharides,PS,又称多聚糖，是一种广泛生物活性的大分子。广泛存在于许多动植物体内，不仅是生物的营养成分，而且还参与多种生命活动。据现代医学报道植物多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成作用。目前对多糖的研究报道有很多，有苯酚-硫酸比色法测定红毛五加皮的含量，对红毛五加皮多糖的提取、测定等有系统的研究；对枸杞多糖提取工艺的研究，主要对多糖的提取工艺有系统的研究。但是目前对独一味多糖的研究极少，主要有独一味多糖抗氧化性的研究，对其提取方法及含量测定的研究更是较少涉及。植物多糖的提取方法有水提法、超声提取法、微波辅助提取法以及酶法等，其中提取时间、次数、料液比以及温度等因素对提取的结果都有不同程度的影响，因此如何能够有效稳定的提取独一味多糖非常重要。目前植物多糖含量测定主要采用紫外分光光度法，以无水葡萄糖为对照品，常采用苯酚-硫酸法，或蒽酮-硫酸法。未见独一味多糖的提取方法以及其质量控制方法的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供独一味多糖的提取方法及其检测方法。本发明独一味多糖的提取方法，包括以下步骤：取独一味粉末，脱色，加水，回流提取，收提取液，即可。其中，所述脱色的方法是：用滤纸包裹独一味粉末，在85％乙醇中回流至提取液无色，取出，干燥，即可。优选地，所述脱色的方法是：用滤纸包裹独一味粉末，在粉末50～100倍v/w的85％乙醇中回流4～8h至提取液无色，取出，干燥，即可。v/w，即ml/g。优选地，加入的水的体积是独一味粉末重量的30倍。优选地，回流提取的温度为80～90℃，回流提取的时间为45～60min。优选地，回流提取的温度为80℃，回流提取的时间为60min。优选地，回流提取的次数是1～5次。优选地，回流提取的次数是4次。本发明还提供了前述检测独一味的多糖含量的方法，包括如下步骤：①、将前述提取方法得到的提取液，作为供试品溶液；②、取葡萄糖对照品，加水溶解，作为对照品溶液；③、取对照品溶液和供试品溶液，加入苯酚、浓硫酸，反应，测定488nm处的吸光度；根据对照品的吸光度建立标准曲线，确定供试品溶液中的多糖含量。优选地，步骤③中，溶液与苯酚的体积比为1:0.45，苯酚的浓度为7％，溶液与浓硫酸的体积比为1:2.5；所述反应是：40℃水浴15min，取出，冰水浴5min。本发明独一味多糖提取方法可以高效提取独一味样品中的多糖，以此为基础建立的检测方法可以有效、准确检测独一味中的多糖含量，重复性好，准确度高，能够客观反应独一味样品中的多糖含量，应用前景良好。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1本发明对照品浓度与吸光度的线性关系。具体实施方式本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。1、实验仪器紫外分光光度仪Biomate3S(ThermoScientific)；SHD-ⅢD型循环水式多用真空泵(河南省予华仪器有限公司)；BS224S型电子天平(北京赛多斯仪器系统有限公司)；电热显恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。2、实验药品独一味样品，经成都医学院药学院生药教研室钟世红副教授鉴定为独一味Lamiophlomisrotata的地上部分或全草，样品为自采和购买。无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用)；苯酚、乙醇、浓硫酸等试剂均为分析纯，水为蒸馏水。3、试剂的配制7％苯酚溶液：取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，蒸馏，收集182℃馏分。再取上述馏分约7g，精密称定，置100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀即得。葡萄糖标准溶液：精密称取在105℃下干燥4h的无水葡萄糖26.15mg，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，得到26.15μg/ml的标准溶液。实施例1本发明独一味多糖的提取方法1、提取方法(1)脱色每份称取独一味粉末1g，精密称定(n＝2)，用滤纸包裹，用置于索氏提取器中，加入50ml～100ml的85％乙醇，回流提取至提取液无色(4h～8h)，残渣呈褐色，自然挥干乙醇备用，得脱色后的残渣；(2)提取取脱色后的残渣，置于圆底烧瓶中，加入30ml蒸馏水，于80℃水浴锅中回流提取60min，重复3次，合并提取液，即可。2、提取率的检测2.1检测方法取提取液，抽滤，滤液定容至250ml，再量取5ml溶液于50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度。取2ml于试管中，加入7％苯酚0.9ml，摇匀，再加入浓硫酸5ml。40℃水浴15min，取出，冰水浴5min。测得其488nm处吸光度，利用以下公式计算其提取率(多糖百分含量)。提取率＝多糖浓度*提取液体积*稀释倍数*转换因子/样品质量*100％即：M％＝(A样/A对*C对)*V*D*f)/W*100％(2-2)其中，M％是指多糖百分含量；A样为样品溶液的吸光度；A对为对照品溶液的吸光度；C对为对照品溶液的浓度；V为提取溶液的体积(为第一次定容的体积250ml)；D为稀释倍数，稀释倍数为(50/5)*(7.9/2)；f为换算因子，本实验另行测定，为3.1048；W为样品质量。2.2检测结果经过检测，本发明方法提取独一味多糖的提取率为14.18％。实施例2本发明独一味多糖的提取方法的筛选一、提取次数1、提取方法(1)脱色每份称取独一味粉末1g，精密称定(n＝2)，用滤纸包裹，用置于索氏提取器中，加入50ml～100ml的85％乙醇，回流提取至提取液无色(4h～8h)，残渣呈褐色，自然挥干乙醇备用，得脱色后的残渣；(2)提取取脱色后的残渣，置于圆底烧瓶中，加入30ml蒸馏水，于80℃水浴锅中回流提取60min，不重复或者重复1次、重复2次、重复3次、重复4次，合并提取液，即可。2、提取率的检测2.1检测方法同实施例1。2.2检测结果检测结果如下表1：表1不同提取次数的多糖提取率提取次数12345提取率％13.2013.2913.7914.1814.23实验结果说明，采用本发明工艺提取独一味多糖，提取率高，为13.20～14.18％，重复的次数可以为0次到4次(即提取1次～5次)，其中，重复3次(即提取4次)的提取率最高。二、提取时间(1)脱色每份称取独一味粉末1g，精密称定(n＝2)，用滤纸包裹，用置于索氏提取器中，加入50ml～100ml的85％乙醇，回流提取至提取液无色(4h～8h)，残渣呈褐色，自然挥干乙醇备用，得脱色后的残渣；(2)提取取脱色后的残渣，置于圆底烧瓶中，加入30ml蒸馏水，于90℃水浴锅中回流提取45min或者60min，得提取液，即可。2、提取率的检测2.1检测方法同实施例1。2.2检测结果检测结果如下表2：表2不同时间的多糖提取率提取时间45min60min提取率％12.6813.19实验结果说明，采用本发明工艺提取独一味多糖，提取率高，为12.68～13.19％，提取时间可以为45～60min，其中，提取60min的提取率最高。三、提取温度(1)脱色每份称取独一味粉末1g，精密称定(n＝2)，用滤纸包裹，用置于索氏提取器中，加入50ml～100ml的85％乙醇，回流提取至提取液无色(4h～8h)，残渣呈褐色，自然挥干乙醇备用，得脱色后的残渣；(2)提取取脱色后的残渣，置于圆底烧瓶中，加入30ml蒸馏水，于80℃、90℃水浴锅中回流提取60min，得提取液，即可。2、提取率的检测2.1检测方法同实施例1。2.2检测结果检测结果如下表3：表3不同温度的多糖提取率提取温度80℃90℃提取率％13.2013.18实验结果说明，采用本发明工艺提取独一味多糖，提取率高，为13.18～13.20％，提取温度可以为80～90℃，其中，提取80℃的提取率最高。对比例独一味多糖提取方法一、料液比(1)脱色每份称取独一味粉末1g，精密称定(n＝2)，用滤纸包裹，用置于索氏提取器中，加入50ml～100ml的85％乙醇，回流提取至提取液无色(4h～8h)，残渣呈褐色，自然挥干乙醇备用，得脱色后的残渣；(2)提取取脱色后的残渣，置于圆底烧瓶中，分别加入10ml、20ml、40ml、50ml蒸馏水，于80℃水浴锅中回流提取60min，得提取液，即可。2、提取率的检测2.1检测方法同实施例1。2.2检测结果检测结果如下表4：表4不同料液比的多糖提取率料液比1：101:201:401:50提取率％10.0110.8010.759.55实验结果说明，采用本发明范围以外的其他料液比进行独一味多糖的提取，提取率低，低于10.8％。二、提取时间(1)脱色每份称取独一味粉末1g，精密称定(n＝2)，用滤纸包裹，用置于索氏提取器中，加入50ml～100ml的85％乙醇，回流提取至提取液无色(4h～8h)，残渣呈褐色，自然挥干乙醇备用，得脱色后的残渣；(2)提取取脱色后的残渣，置于圆底烧瓶中，加入30ml蒸馏水，于90℃水浴锅中回流提取30min或者90min，得提取液，即可。2、提取率的检测2.1检测方法同实施例1。2.2检测结果检测结果如下表5：表5不同时间的多糖提取率提取时间30min90min提取率％11.8011.56实验结果说明，采用本发明范围以外的其他时间进行独一味多糖的提取，提取率低，低于11.8％。三、提取温度(1)脱色每份称取独一味粉末1g，精密称定(n＝2)，用滤纸包裹，用置于索氏提取器中，加入50ml～100ml的85％乙醇，回流提取至提取液无色(4h～8h)，残渣呈褐色，自然挥干乙醇备用，得脱色后的残渣；(2)提取取脱色后的残渣，置于圆底烧瓶中，加入30ml蒸馏水，于80℃、90℃水浴锅中回流提取60min，得提取液，即可。2、提取率的检测2.1检测方法同实施例1。2.2检测结果检测结果如下表6：表6不同温度的多糖提取率提取温度60℃70℃提取率％8.7310.20实验结果说明，采用本发明范围以外的其他温度进行独一味多糖的提取，提取率低，低于10.2％。实验结果说明，只有在本发明特定范围的参数条件下，才能高效提取得到独一味多糖，提取率高，而采用本发明范围以外的参数，则提取率低。实施例3本发明独一味多糖的检测方法1、检测方法对照品溶液的制备：精密吸取0.2615mg/ml的葡萄糖标准溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml置25ml容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度，得对照品溶液。供试品溶液的制备：可以按照实施例1和实施例2得多糖提取方法制备，本实施例按照实施例1得方法制备，具体地：每份称取独一味粉末1g，精密称定(n＝2)，用滤纸包裹，用置于索氏提取器中，加入50ml～100ml的85％乙醇，回流提取至提取液无色(4h～8h)，残渣呈褐色，自然挥干乙醇备用，得脱色后的残渣；取脱色后的残渣，置于圆底烧瓶中，加入30ml蒸馏水，于80℃水浴锅中回流提取60min，重复3次，合并提取液，得供试品溶液。检测：分别量取2ml对照品溶液和供试品溶液于试管中，加入7％苯酚0.9ml，摇匀，快速加入浓硫酸5ml，40℃水浴15min,取出后冰水浴5min。照比色法(《中国药典》2010年版一部附录VB)在488nm处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，建立回归方程和标准曲线，根据回归方程和标准曲线计算供试品中多糖含量。2、方法学考察2.1线性关系考察精密吸取0.2615mg/ml的葡萄糖标准溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml置25ml容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度。再分别量取2ml溶液于试管中，加入7％苯酚0.9ml，摇匀，快速加入浓硫酸5ml，40℃水浴15min,取出后冰水浴5min,作为供试品溶液。空白溶液的制备方法同上。照比色法(《中国药典》2010年版一部附录VB)在488nm处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程。计算得到的回归方程为Y＝0.0635X+0.0006，R2＝0.9994(n＝8)r＝0.9997表明线性良好。数据见表7，标准曲线见图1。表7对照品浓度与吸光度的线性关系浓度μg/ml2.653.975.306.627.949.2710.5911.92吸光度0.1670.2550.3430.4140.5010.5900.6750.7592.2精密度试验精密量取2ml浓度为26.15μg/ml的对照品溶液5份，分别加入7％苯酚溶液0.9ml，摇匀，加浓硫酸5ml，水浴加热15min，取出，置冰水中冷却5min，作为供试品溶液。空白溶液的制备同上法。照比色法(《中国药典》2010年版一部附录VB)在488nm处分别测定吸光度，结果见表8。表8精密度实验结果取样量ml22222RSD吸光度0.4250.4240.4230.4220.4220.31％结果表明，平均值为0.423，相对标准偏差0.31％，精密度良好。2.3稳定性试验精密量取2ml浓度为26.15μg/ml的对照品溶液1份，加入7％苯酚溶液0.9ml，摇匀，加浓硫酸5ml，水浴加热15min，取出，置冰水中冷却5min，分别在5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min照比色法(《中国药典》2010年版一部附录VB)在488nm处分别测定吸光度，结果见表9。表9稳定性实验结果时间min5101520253040RSD吸光度0.4220.4210.4210.4210.4220.4220.4230.18％结果表明，标准品在40min内稳定性良好。2.4重复性试验称取独一味粉(9号样)约1g，精密称定6份，按照上述提取方法制备供试品溶液备用。分别吸取上述溶液5ml置50ml的容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度备用。制备浓度为26.15μg/ml的葡萄糖对照品溶液备用。精密量取上述供试品溶液和对照品溶液各2ml，按上述显色方法在488nm处测定对照品的吸光度为A对＝0.422。多糖含量按多糖含量公式计算，结果见表10。表10重复性实验结果结果表明，本发明方法的重复性良好。2.5加样回收率试验称取独一味粗粉(9号样)约0.5g，精密称定6份，分别加入精多糖适量，按照上述方法制备供试品溶液。精密吸取供试品溶液5ml置50ml的容量瓶中，蒸馏加水稀释至刻度备用。吸取上述溶液和对照品溶液(26.15μg/ml)各2ml，按上述显色方法在488nm处测定吸光度。回收率公式见式2-5。回收率(％)＝(测得量-样品中多糖含量)/多糖加入量*100％(2-5)结果见表11。表11加样回收实验结果结果表明，独一味中多糖平均含量为19.1％，加样回收率的平均值为102.3％，RSD为1.44％(n＝6)，表明本发明检测结果的准确性高。2.6测定不同产地样品中独一味多糖的含量按照本发明方法对15批样品进行测定，计算公式见(2-6)：多糖的含量/g＝(A样/A对)*C*D*f*100％(2-6)其中，C：供试品溶液的葡萄糖浓度(μg·ml-1)；D：供试品溶液的稀释倍数；f：换算因子(经本实验组另行测定为3.1048)。含量测定结果见表12。表12独一味样品中多糖含量测定结果(n＝2)实验结果说明，本发明检测方法可以有效检测实际独一味样品中的多糖含量。综上，本发明独一味多糖提取方法可以高效提取独一味样品中的多糖，以此为基础建立的检测方法可以有效检测独一味中的多糖含量，应用前景良好。当前第1页1 2 3