一种窄分布羟乙基淀粉及其应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，更具体地，涉及一种窄分布羟乙基淀粉及其应用，该窄分布羟乙基淀粉尤其可在医药领域中应用。

背景技术：

羟乙基淀粉由支链淀粉衍生化反应而得，其化学结构与机体内的多糖及肝糖相似，副作用比阿拉伯胶、海藻酸钠等血浆代用品小。而且，由于羟乙基基团的存在，一方面，降低了体内淀粉酶对羟乙基淀粉的降解速度，使其具有一定的抗休克疗效；另一方面，极大地增加羟乙基淀粉在水中的溶解度，以便配成一定浓度的溶液，供临床使用。因此，羟乙基淀粉溶液是目前临床常用的血浆代用品。羟乙基淀粉的容量扩充效应和血液稀释效应，取决于分子量大小、取代度、取代方式和药物浓度，以及给药剂量和输注速度。

羟乙基淀粉按分子量大小和羟乙基取代度的不同，可分为：重均分子量Mw范围为2,000～100,000的低分子量高取代羟乙基淀粉(如：羟乙基淀粉20/0.8，羟乙基淀粉40/0.8)、重均分子量MW范围为100,000～300,000的中分子量低取代羟乙基淀粉(如：羟乙基淀粉130/0.4，羟乙基淀粉200/0.5)与重均分子量Mw范围为300,000～900,000的高分子量高取代羟乙基淀粉(如:羟乙基淀粉480/0.7)等。

传统常用的样本密度分离液为Ficoll(聚蔗糖400)-泛影酸钠分离液和右旋糖酐-泛影葡胺分离液等，Ficoll(聚蔗糖400)-泛影酸钠分离液其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，简称聚蔗糖，但在向保存液中加入Ficoll分离液后，在保存液与样本密度分离液分层处的未被保存液完全裂解的红细胞会与聚蔗糖接触而凝集成串钱状而沉积于管底与下沉的具有诊断学意义的细胞(上皮细胞、肿瘤细胞)混合，影响后续制片后对样品的观察。右旋糖酐-泛影葡胺分离液，由于葡聚糖是由葡萄糖经过菌种发酵而得，因此其内毒素水平较高，会影响淋巴细胞的表面蛋白活性，且分离液中含不通透的离子diatrizoate(泛影葡胺)，会影响离子通透膜的Gibbs-Donnan平衡(吉布斯一道南膜平衡)。所以，传统的细胞分离液对细胞有毒性，分得细胞状态不好，影响细胞活性，不利于所提取细胞的后续培养及临床治疗的应用。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种窄分布羟乙基淀粉及其应用，其中通过对羟乙基淀粉关键的分子量分布，如重均分子量Mw、摩尔取代度MS、以及C2/C6比等进行改进，与现有技术相比由于使得羟乙基淀粉能够作为动物组织或人体组织密度分离的新型介质，从而可以有效解决细胞分离液对细胞有毒性、影响细胞活性等问题，该窄分布羟乙基淀粉可替代聚蔗糖或右旋糖酐，用于制备样本密度分离液，分离各种细胞，其生物安全性高，无细胞毒性，内毒素含量低，分离的淋巴细胞状态好，活力高。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种窄分布的羟乙基淀粉，其特征在于，该羟乙基淀粉的重均分子量Mw为250000～400000，摩尔取代度MS为0.3～0.7，C2/C6比为4～12。

作为本发明的进一步优选，所述羟乙基淀粉的重均分子量Mw为280000～380000。

作为本发明的进一步优选，对于所述羟乙基淀粉，10％小分子部分重均分子量不小于该羟乙基淀粉重均分子量Mw的20％。

作为本发明的进一步优选，对于所述羟乙基淀粉，10％大分子部分重均分子量不大于该羟乙基淀粉重均分子量Mw的220％。

作为本发明的进一步优选，所述羟乙基淀粉的摩尔取代度MS为0.4～0.6。

作为本发明的进一步优选，所述羟乙基淀粉的C2/C6比为5～10。

作为本发明的进一步优选，所述羟乙基淀粉是由包括马铃薯淀粉、玉米淀粉中至少一种在内的原料制得的；优选的，所述玉米淀粉为蜡质玉米淀粉。

按照本发明的另一方面，本发明提供了一种药剂，其特征在于，包括上述窄分布的羟乙基淀粉；优选的，所述药剂为水溶液或胶体水溶液；所述窄分布的羟乙基淀粉在该药剂中的浓度为7～15％(w/v)。

作为本发明的进一步优选，所述药剂是用作动物组织或人体组织密度分离的介质；优选的，所述人体组织为血液。

按照本发明的又一方面，本发明提供了上述窄分布的羟乙基淀粉在制备用于动物组织或人体组织密度分离的介质上的应用。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于对羟乙基淀粉中的分子量分布进行控制，使得羟乙基淀粉能够作为动物组织或人体组织密度分离的新型介质。本发明中的窄分布羟乙基淀粉，其重均分子质量Mw为250,000～400,000；优选的，最低10％处重均分子量不小于该窄分布羟乙基淀粉重均分子量的20％，最高10％处重均分子量不大于该窄分布羟乙基淀粉重均分子量的220％；摩尔取代的MS优选为0.3～0.7；C2/C6比优选为4～12。该窄分布羟乙基淀粉可替代聚蔗糖或右旋糖酐，用于制备样本密度分离液等细胞分离液药剂，可用于分离各种细胞(如各种动物组织及人体组织)，其生物安全性高，无细胞毒性，内毒素含量低，分离的淋巴细胞状态好，活力高，操作中也可缩短分离时间，提高分离效率。例如，含有本发明窄分布羟乙基淀粉的药剂，可作为细胞分离液，尤其可通过密度分离作用，将血液样本中不同成分分离。包含本发明中窄分布羟乙基淀粉的药剂(该药剂尤其可以采用水溶液或胶体水溶液的形式)除应用于科学研究外还可应用于临床诊断，具有良好市场前景。

目前在售的羟乙基淀粉有羟乙基淀粉130/0.4，羟乙基淀粉200/0.5，主要用作代血浆产品，如羟乙基淀粉200/0.5，要求最低10％处重均分子量(即，10％小分子部分的重均分子量)不得小于15,000，即相应重均分子量的10％，最高10％处重均分子量(即，10％大分子部分的重均分子量)不得大于600,000，即相应重均分子量的300％，分子量分布较宽，作为细胞分离液不能满足要求，无法作为细胞分离液。另外，羟乙基淀粉的分子量大小也影响其分离细胞的效果，若羟乙基淀粉的分子量太小，无法达到细胞分离液所需的密度梯度，使得分离效果不好，若羟乙基淀粉分子量过大，则容易造成细胞凝集，且易在体内积蓄；本发明通过控将羟乙基淀粉的重均分子量Mw控制为250000～400000(优选为280000～380000)，能够有效实现细胞分离液所需的密度梯度，确保分离效果，并避免细胞凝集等不利影响。

本发明中窄分布羟乙基淀粉是由优选蜡质玉米淀粉，经水解、分子量分级、羟乙基化、精制制得。窄分布羟乙基淀粉制备的难点在于特定分子量的分级筛选。本发明可以先将淀粉原料与去离子水混合配制浓度为10％～30％(w/v)的淀粉悬浊液，然后将淀粉悬浊液在90～100℃下糊化25～35分钟得到淀粉糊化物，接着在酸性条件下对淀粉糊化物进行水解得到淀粉水解液；然后，对淀粉水解液进行分子量筛选得到筛选后的淀粉水解液；接着，在保护性气体的氛围下将筛选后的淀粉水解液与羟乙基取代剂(如氯乙醇或环氧乙烷)在氢氧化钠催化的条件下进行羟乙基取代反应得到反应液，羟乙基取代反应的反应温度30～40℃，反应时间8～12小时；然后，对反应液进行活性炭脱色处理、过滤处理、以及干燥处理，即得到窄分布羟乙基淀粉。其中，在酸性条件下对淀粉糊化物进行水解得到淀粉水解液，可以是先用盐酸调节淀粉糊化物的酸度至0.3～0.7mol/L，然后在40～70℃的温度下进行水解反应，即得到淀粉水解液；优选的，以水解反应得到的淀粉水解液进行凝胶渗透色谱检测时，该淀粉水解液中的水解产物在色谱柱中的保留时间为15～17分钟；优选的，水解反应的时间为2～5小时。分子量筛选是利用膜分离法，膜分离法是采用超滤膜，该超滤膜的截留分子量为30,000～100,000Da，优选为40,000～60,000Da；超滤膜的材料为聚氯乙烯(PVC)、聚偏氟乙烯(PVDF)、或聚醚砜(PES)，优选为聚醚砜(PES)。

目前，羟乙基淀粉系列产品(如羟乙基淀粉130/0.4、羟乙基淀粉200/0.5等)报道的工艺中，对于分子量的筛选多是在水解步骤完成，水解方式主要有酸水解和酶解两种方式。但这两种水解方式选择性较差，其水解产物的分子量分布范围较宽，无法达到窄分布羟乙基淀粉的分子量分布要求。本发明可以采用水解与膜分离相结合的方式，首先在酸水解步骤将水解产物分子量控制到一定范围，然后采用特定截留分子量的膜分离系统对水解产物进行截留，去除不在分子量分布范围内的片段，最终得到具备窄分布分子量的羟乙基淀粉。该工艺没有使用有机溶剂，避免了溶剂回收的工艺步骤，且生产设备常见，利于工业化生产。

据记载，羟乙基淀粉是血浆扩容剂，具备较好的血液流变学特性，适用于临床使用，可使促凝血酶原激酶时间快速降低，使血小板功能降低，对红细胞集聚性沉降率有影响，有抑制红细胞集聚作用，能增加细胞膜负电荷，使已集聚细胞解聚的作用，现有的细胞分离液中也常加入羟乙基淀粉以加速红细胞沉降。

本发明经研究发现，特定重均分子量的羟乙基淀粉在细胞分离过程中的效果显著，并且分子量分布越窄，效果越好，如具备本发明所载的重均分子量Mw为250000～400000(优选为280000～380000，且10％小分子部分重均分子量不小于该羟乙基淀粉重均分子量Mw的20％，10％大分子部分重均分子量不大于该羟乙基淀粉重均分子量Mw的220％)的窄分布羟乙基淀粉，较其他羟乙基淀粉(如羟乙基淀粉480/0.7、羟乙基淀粉550)，分离效果显著提高。

本发明制备所得窄分布羟乙基淀粉，与聚蔗糖和右旋糖酐使用效果比较，结果表明：使用以上三种化合物为主要成分的药剂作为密度分离介质，经过密度梯度离心，均可使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，达到将各种血细胞分离的目的。以窄分布羟乙基淀粉为主要成分的药剂分离血细胞生物安全性高，无细胞毒性，内毒素含量低，分离的淋巴细胞状态好，活力高，且使用中耗时短，分离效率高，用于细胞治疗领域中过敏反应发生率低。

附图说明

图1是窄分布羟乙基淀粉的重均分子量及分子量分布图；

图2是样本密度分离液分离图示例。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明中窄分布羟乙基淀粉的制备方法，概括来说，包括以下步骤：使悬浮于水中的淀粉，优选蜡质玉米淀粉，通过糊化、水解、分子量分级、羟乙基化、脱色、精制和干燥等步骤获得。

以下为具体实施例：

实施例1

配制浓度为15％(w/v)的玉米淀粉悬浮液，95℃糊化30min，用盐酸调节体系酸度0.5mol/L，温度为60℃，反应时间4小时，得淀粉水解液；淀粉水解液经过截留分子量为50,000Da的超滤膜分离得到浓缩液；浓缩液在N₂保护下与环氧乙烷在氢氧化钠催化下进行羟乙基取代反应，其中淀粉水解物:氢氧化钠:氯乙醇的反应摩尔比为1:0.8:0.5，反应时间为10小时，反应温度为35℃；反应液经过活性炭脱色、过滤后进行喷雾干燥，得到窄分布羟乙基淀粉的粉末产品。依据Ph.Eur.2.2.30and monograph(01/2011:1785)的方法测定产物的重均分子质量Mw为2.883e+5，最低10％处重均分子量为63756.2，最高10％处重均分子量为627466.3，依据Ph.Eur.2.2.28and monograph(01/2011:1785)的方法测定产物的摩尔取代的MS为0.58和C2/C6比为5.6。

实施例2

以市售Ficoll-泛影酸钠分离液为对照样，分别以含有本发明中窄分布羟乙基淀粉、羟乙基淀粉130/0.4、羟乙基淀粉200/0.5和羟乙基淀粉480/0.7的药剂为试验样。

(i)取新鲜抗凝血，按体积1:1小心的加在Ficoll-泛影酸钠分离液上层，室温(18-22℃)以500g离心30分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层，如图2所示。第一层为血浆层(含血小板)。第二层为环状乳白色淋巴细胞(单核/单个核细胞层)。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层(含大量中性粒细胞)。收集细胞放入含清洗液10mL的试管中，充分混匀后，以250g，离心10分钟。沉淀经反复洗2次，弃上清，即得所需细胞。

(ii)取新鲜抗凝血以基础培养基1：1混匀，按体积比2-3：1小心的加在含有本发明中窄分布羟乙基淀粉的药剂上层，室温(18-22℃)以1000g离心20分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为血浆层(含血小板)。第二层为环状乳白色淋巴细胞(单核/单个核细胞层)。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层(含大量中性粒细胞)。收集细胞放入含基础培养基10mL的试管中，充分混匀后，以600g，离心5分钟。沉淀经反复洗2次，即得所需细胞。

(iii)分别采用含有羟乙基淀粉130/0.4、羟乙基淀粉200/0.5和羟乙基淀粉480/0.7的药剂为密度离心介质，照实验方案(ii)的操作，进行细胞分离。

试验结果如表1所示。

表1

上述采用羟乙基淀粉(包括窄分布羟乙基淀粉、以及其他羟乙基淀粉，如羟乙基淀粉130/0.4)的药剂中，各种羟乙基淀粉的浓度均是9％(w/v)。试验结果表明，含有窄分布羟乙基淀粉的药剂作为细胞分离介质效果显著，优于常用的两种细胞分离液，对比不同分子量羟乙基淀粉产品作为细胞分离介质，除含有羟乙基淀粉480/0.7的药剂对细胞分离表现出一定效果外，含有羟乙基淀粉130/0.4和200/0.5的药剂并没有在细胞分离操作中产生效果。

本发明中的窄分布的羟乙基淀粉，其制备方法可参考现有的羟乙基淀粉制备方法，除了分子量分级这一步骤不同外，其他步骤均可参考现有技术。

本发明中的窄分布羟乙基淀粉可替代聚蔗糖或右旋糖酐，用于制备样本密度分离液等药剂。

本发明中，针对羟乙基淀粉，其10％小分子部分重均分子量、以及10％大分子部分重均分子量的具体计算测量方法可参考现有技术，如《欧洲药典》7.0版等。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。