本发明涉及一种五味子多糖提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
传染性造血器官坏死病(infectioushematopoieticnecrosis，ihn)是目前影响我国鲑鳟鱼产业发展最为致命的病毒性疾病，其病原为传染性造血器官坏死病病毒(infectioushematopoieticnecrosisvirus，ihnv)。ihnv属于弹状病毒科(rhabdoviridae)诺拉弹状病毒属(novirhabdovirus)，主要感染鲑鳟鱼，包括虹鳟、大马哈鱼、大西洋鲑以及硬头鲑等。该病毒一旦侵入鱼体，首先在鱼体肾脏和脾脏造血组织增殖，进入血液循环后便会繁殖于鱼体的各个器官，引发鲑鳟鱼突发性死亡。根据鱼的种类、年龄、病毒株系以及环境条件的不同，ihn的暴发可导致鲑鳟鱼鱼苗死亡率接近100％、成鱼死亡率达到25-30％。中国已经将ihn列为二类疫病，同时是口岸鱼类必须检疫的第一类对象。上世纪九十年代，我国鲑鳟鱼主产区发生了多次大规模的ihnv暴发事件，对一些主产区造成了巨大的经济损失。随着水产养殖业的不断发展，水生动物及其产品进出口贸易急剧增加，ihnv逐渐蔓延开，严重威胁我国鲑鳟鱼主产区渔业的健康发展。由于缺乏有效的防治方法，ihn已成为制约中国冷水鱼养殖业健康发展的瓶颈问题。
多糖(polysaccharide)是一种天然的生物活性成分，能够参与生命现象中如细胞分裂、细胞识别、细胞间物质运输等重要生命过程，具有调节机体免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗感染等生物功能。多糖类化合物通常具有极小甚至无细胞毒性，不影响正常细胞的功能。研究表明，多糖可以激活t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤细胞等免疫细胞参与机体免疫，尤其是可以诱导干扰素的产生，活化补体进而抵抗病毒的侵袭。而多糖糖链中含有的模拟配体，其结构与病毒具有一定的相似性，能够阻断病毒与宿主细胞表面结合，并具有加强细胞修复及细胞膜稳定的能力，从而抑制病原体的侵入。此外，多糖还能够通过抑制反转录酶活性等方式阻止病毒在机体内的复制从而起到抗病毒的作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种五味子多糖提取物及其制备方法和应用。
本发明提供了一种五味子提取物的制备方法，依次包括如下步骤：
(a1)取五味子，进行水提，收集液相；所述水提前进行超声预处理；
(a2)去除蛋白质和小分子杂质，进行醇沉，得到五味子提取物。
所述步骤(a1)具体包括如下步骤：将五味子浸泡于水中，进行超声预处理，然后75℃浸提3h，收集液相。步骤(a1)中，所述五味子的存在形式为五味子干粉。所述五味子干粉的制备方法包括如下步骤：将五味子60℃恒温烘干至恒重，然后粉碎，过20目筛，得到五味子干粉。所述浸泡具体为室温浸泡2h。所述五味子干粉和水的配比关系具体为1g五味子：25ml水。所述超声预处理的超声功率为340-380w，具体可为360w。所述超声预处理的超声时间为25-35min，具体可为30min。
步骤(a1)中，所述“收集液相”具体通过离心实现。所述离心的参数具体可为4000rpm、10min。为了提取充分，可将收集液相后的残留物(五味子残渣)进行第二次提取。具体步骤如下：五味子残渣加入水中，75℃浸提3h，然后收集液相。五味子残渣和水的配比具体可为1g五味子残渣：10ml水。所述收集液相具体通过离心实现。所述离心的参数具体可为4000rpm、10min。最终将所有收集得到的液相混合。
为了降低后续步骤中的试剂成本，可将步骤(a1)得到的液相进行浓缩。所述浓缩具体可为减压浓缩。所述浓缩具体可为将所述液相减压浓缩至原来体积的1/4。
步骤(a2)中，醇沉采用的醇沉液为无水乙醇。具体可采用3倍体积的醇沉液。所述醇沉的参数具体可为：4℃静置12-16h。醇沉后，具体通过离心收集沉淀。所述离心的参数具体可为：4000rpm、10min。
步骤(a2)中，所述“去除蛋白质”具体通过sevag法实现。去除蛋白质的具体方法如下：将沉淀溶解于水中后采用sevag法去除蛋白质，收集上层液相。所述沉淀与水的配比关系为：1g沉淀：10ml水。
步骤(a3)中，所述“去除小分子杂质”可通过透析实现。所述小分子杂质为分子量小于3500da的物质。所述“去除小分子杂质”的方法具体可为：将步骤(a2)收集到的液相转移到透析袋(透析袋规格为mw3500)中，然后将透析袋置于水中进行透析，然后收集透析袋内部的保留液。
步骤(a3)中，醇沉采用的醇沉液为无水乙醇。具体可采用3倍体积的醇沉液。所述醇沉的参数具体可为：4℃静置12-16h。醇沉后，具体通过离心收集沉淀。所述离心的参数具体可为：4000rpm、15min。醇沉后，还包括将产物进行冷冻干燥的步骤。
本发明还保护一种五味子提取物的制备方法，依次包括如下步骤：
(b1)取五味子，进行水提，收集液相；所述水提过程前进行超声预处理；
(b2)将步骤(b1)得到的液相或其浓缩液进行醇沉；
(b3)取步骤(b2)得到的沉淀，用水溶解后采用sevag法去除蛋白质，收集上层液相；
(b4)取步骤(b3)得到的上清液转移到规格为mw3500透析袋中进行透析，收集透析袋内部的保留液；
(b5)将步骤(b4)得到的保留液进行醇沉，得到五味子提取物。
所述步骤(b1)具体包括如下步骤：将五味子浸泡于水中，进行超声预处理，然后75℃浸提3h，收集液相。步骤(b1)中，所述五味子的存在形式为五味子干粉。所述五味子干粉的制备方法包括如下步骤：将五味子60℃恒温烘干至恒重，然后粉碎，过20目筛，得到五味子干粉。所述浸泡具体为室温浸泡2h。所述五味子干粉和水的配比关系具体为1g五味子：25ml水。所述超声预处理的超声功率为340-380w，具体可为360w。所述超声预处理的超声时间为25-35min，具体可为30min。
步骤(b1)中，所述“收集液相”具体通过离心实现。所述离心的参数具体可为4000rpm、10min。为了提取充分，可将收集液相后的残留物(五味子残渣)进行第二次提取。具体步骤如下：五味子残渣加入水中，75℃浸提3h，然后收集液相。五味子残渣和水的配比具体可为1g五味子残渣：10ml水。所述收集液相具体通过离心实现。所述离心的参数具体可为4000rpm、10min。最终将所有收集得到的液相混合。
为了降低后续步骤中的试剂成本，可将步骤(b1)得到的液相进行浓缩，得到浓缩液。所述浓缩具体可为减压浓缩。所述浓缩具体可为将所述液相减压浓缩至原来体积的1/4。
步骤(b2)中，醇沉采用的醇沉液为无水乙醇。具体可采用3倍体积的醇沉液。所述醇沉的参数具体可为：4℃静置12-16h。醇沉后，具体通过离心收集沉淀。所述离心的参数具体可为：4000rpm、10min。
步骤(b3)中，所述“去除蛋白质”具体通过sevag法实现。去除蛋白质的具体方法如下：将沉淀溶解于水中后采用sevag法去除蛋白质，收集上层液相。所述沉淀与水的配比关系为：1g沉淀：10ml水。
步骤(b5)中，醇沉采用的醇沉液为无水乙醇。具体可采用3倍体积的醇沉液。所述醇沉的参数具体可为：4℃静置12-16h。醇沉后，具体通过离心收集沉淀。所述离心的参数具体可为：4000rpm、15min。醇沉后，还包括将产物进行冷冻干燥的步骤。
本发明还保护一种五味子提取物的制备方法，依次包括如下步骤：
(c1)取五味子，进行水提，离心，分别收集沉淀和上清；所述水提过程前进行超声预处理；
(c2)取步骤(c1)得到的沉淀，进行水提，离心，收集上清；
(c3)将步骤(c1)得到的上清和步骤(c2)得到的上清混合，然后进行浓缩，得到浓缩液；
(c4)将步骤(c3)得到的浓缩液进行醇沉；
(c5)取步骤(c4)得到的沉淀，用水溶解后采用sevag法去除蛋白质，收集上层液相；
(c6)取步骤(c5)得到的液相转移到规格为mw3500透析袋中进行透析，收集透析袋内部的保留液；
(c7)将步骤(c6)得到的保留液进行醇沉，得到五味子提取物。
所述步骤(c1)具体包括如下步骤：将五味子浸泡于水中，进行超声预处理，然后75℃浸提3h，离心，分别收集沉淀和上清。步骤(c1)中，所述五味子的存在形式为五味子干粉。所述五味子干粉的制备方法包括如下步骤：将五味子60℃恒温烘干至恒重，然后粉碎，过20目筛，得到五味子干粉。所述浸泡具体为室温浸泡2h。所述五味子干粉和水的配比关系具体为1g五味子：25ml水。所述超声预处理的超声功率为340-380w，具体可为360w。所述超声预处理的超声时间为25-35min，具体可为30min。所述离心的参数具体可为4000rpm、10min。
步骤(c2)的具体步骤如下：将沉淀加入水中，75℃浸提3h，离心收集液相。沉淀和水的配比具体可为1g沉淀：10ml水。所述离心的参数具体可为4000rpm、10min。
步骤(c3)中，所述浓缩具体可为减压浓缩。所述浓缩具体可为将所述液相减压浓缩至原来体积的1/4。
步骤(c4)中，醇沉采用的醇沉液为无水乙醇。具体可采用3倍体积的醇沉液。所述醇沉的参数具体可为：4℃静置12-16h。醇沉后，具体通过离心收集沉淀。所述离心的参数具体可为：4000rpm、10min。
步骤(c5)中，所述沉淀与水的配比关系为：1g沉淀：10ml水。
步骤(c7)中，醇沉采用的醇沉液为无水乙醇。具体可采用3倍体积的醇沉液。所述醇沉的参数具体可为：4℃静置12-16h。醇沉后，具体通过离心收集沉淀。所述离心的参数具体可为：4000rpm、15min。醇沉后，还包括将产物进行冷冻干燥的步骤。
以上任一所述“sevag法去除蛋白质”的方法具体可为：与0.5体积份的sevag试剂混合，充分振荡后离心，收集上层溶液。弃掉中间层，中间层富含白色的蛋白质。将1体积份的sevag试剂和2体积份所述上层溶液混合，充分振荡后离心，收集上层溶液，弃掉中间层(重复进行本步骤，直至中间层无蛋白质出现)。取最终收集的上层溶液。所述sevag试剂为4体积份氯仿和1体积份正丁醇的混合液。所述充分振荡具体可为置于恒温空气振荡器中剧烈震荡30min。
以上任一所述水为蒸馏水。
本发明还保护以上任一所述方法制备得到的五味子提取物。
本发明还保护所述的五味子提取物的应用；为如下(d1)和/或(d2)：
(d1)制备抑制ihnv的产品；
(d2)抑制ihnv。
本发明还保护一种产品，活性成分为所述五味子提取物；所述产品的用途为抑制ihnv。
以上任一所述抑制ihnv具体可为抑制ihnv在鲤鱼上皮瘤细胞中的增殖。
以上任一所述ihnv具体可为虹鳟传染性造血器官坏死病毒hlj-15。
虹鳟传染性造血器官坏死病毒hlj-15于2016年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为cctccno：v201622。
ihnv能在大马哈鱼胚细胞系(chinooksalmonembryo，chse-214)、鲤鱼上皮瘤细胞系(epc)、肥头鲦鱼细胞(fatheadminnow，fhm)、虹鳟性腺细胞系(rainbowtroutgonad，rtg-2)等鱼类细胞系中进行增殖，其中在细胞系epc中生长速度较快。因此，本发明以epc细胞系为体外筛选细胞模型，研究了五味子多糖提取物对ihnv所致细胞病变的抑制作用。结果表明，适宜浓度下的五味子多糖提取物对epc细胞无细胞毒性作用。当五味子多糖的浓度为100μg/ml时，五味子多糖提取物对细胞培养中ihnv的抑制率达到90.88％。本发明为筛选新型抗ihnv药物提供了一定的理论依据。
附图说明
图1为五味子多糖提取物对细胞毒性的检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
虹鳟传染性造血器官坏死病毒hlj-15于2016年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为cctccno：v201622。虹鳟传染性造血器官坏死病毒hlj-15简称为hlj-15。
鲤鱼上皮瘤细胞(epitheliomapapulossumofcarp，epc)：美国典型培养物保藏中心(atcc)，编号：crl-2872。
五味子：黑龙江中医药大学门诊部。
超声波振荡器：深圳市深华泰超声洗净设备有限公司，ps-60a。
实施例1、五味子多糖提取物的制备
1、将五味子置于恒温箱中60℃烘干至恒重，然后粉碎，过20目筛，得到五味子干粉。
2、将步骤1得到的五味子干粉加入蒸馏水中，室温浸泡2h(每1g五味子干粉配比25ml蒸馏水)后进行超声处理(将整个体系置于超声波振荡器中，采用360w功率超声处理30min)，然后置于恒温水浴锅中进行高温浸提(75℃、3h)，然后4000rpm离心10min，分别收集上清液和沉淀。
3、将步骤2得到的沉淀加入蒸馏水中(每1g湿重的沉淀配比10ml蒸馏水)，然后于恒温水浴锅中进行高温浸提(75℃、3h)，然后4000rpm离心10min，收集上清液。
4、将步骤2得到的上清液和步骤3得到的上清液合并，然后减压浓缩至1/4体积，得到浓缩液。
5、将步骤4得到的浓缩液和3倍体积的无水乙醇混合，进行醇沉(4℃静置过夜)，然后4000rpm离心10min，收集沉淀。
6、将步骤5得到的沉淀(五味子粗提物)溶解于蒸馏水中(每1g五味子粗提物配比10ml蒸馏水)，得到五味子粗提物溶液。
7、从步骤6得到的五味子粗提物溶液中提纯粗多糖。
将1体积份的sevag试剂(4体积份氯仿和1体积份正丁醇的混合液)和2体积份五味子粗提物溶液混合，置于恒温空气振荡器中剧烈震荡30min(目的是充分震荡混匀)，然后4000rpm离心10min，收集上层(富含多糖)，弃掉中间层(富含白色的蛋白质)。
将1体积份的sevag试剂(4体积份氯仿和1体积份正丁醇的混合液)和2体积份前一步骤收集的上层混合，置于恒温空气振荡器中剧烈震荡30min，然后4000rpm离心10min，收集上层，弃掉中间层。重复进行本步骤，直至中间层无蛋白质出现。
最终收集的上层，即为五味子粗多糖溶液。
8、将步骤7得到的五味子粗多糖溶液转移到透析袋(透析袋规格为mw3500，产品编号jm-md34-3.5，usa)中，然后将透析袋置于蒸馏水中进行透析(每小时更换1次新的蒸馏水，更换4-5次)，然后收集透析袋内部的保留液。
本步骤的目的是：去除小分子杂质。
9、将步骤8收集的保留液和3倍体积的无水乙醇混合，进行醇沉(4℃静置12-16h)，然后4000rpm离心15min，收集沉淀并进行冷冻干燥，得到五味子多糖提取物。
每克步骤1的五味子干粉得到142.53毫克步骤9的五味子多糖提取物。
10、取步骤9得到的五味子多糖提取物，采用苯酚硫酸法测定总糖含量，采用3，5二硝基水杨酸法测定还原糖含量，通过计算得出提取物中五味子多糖含量为37.58％(多糖＝总糖-还原糖)。每1g五味子多糖提取物中五味子多糖的含量为375.82mg。
实施例2、五味子多糖提取物对细胞毒性的检测
本实施例中五味子多糖的浓度是根据实施例1步骤10中五味子多糖提取物中五味子多糖的占比计算得到的。
1、取实施例1制备的五味子多糖提取物和m199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)，配制如下工作液：
工作液a(正常细胞对照组)：m199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)。
工作液b(实验组i)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的浓度为25μg/ml。
工作液c(实验组ii)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的浓度为50μg/ml。
工作液d(实验组iii)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的浓度为100μg/ml。
工作液e(实验组iv)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的浓度为200μg/ml。
工作液f(实验组v)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的浓度为400μg/ml。
工作液g(实验组vi)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的浓度为800μg/ml。
2、将鲤鱼上皮瘤细胞(epc)接种至96孔板中(每孔104个细胞)，采用m199培养基(含10％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)，25℃培养至细胞长成单层。设置不接种细胞的空白对照组。
3、完成步骤2后，取所述96孔板，弃掉培养基，每孔加入100μl步骤1制备的工作液，每个工作液设6个重复。空白对照组每孔加入100μlm199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)。25℃培养7天后采用mtt法检测细胞活性。
结果如图1所示。图1中，横坐标为五味子多糖的浓度，纵坐标为细胞活力值(odt/odm×100％，odt：实验组吸光度值-空白对照组吸光度值；odm：正常细胞组-空白对照组吸光度值)。五味子多糖浓度为25-400μg/ml时，epc细胞仍然可以保持95％以上的活性。结果表明，当五味子多糖在此浓度范围内对epc细胞无细胞毒性作用。
实施例3、五味子多糖提取物抗ihnv活性研究
本实施例中五味子多糖的浓度是根据实施例1步骤10中五味子多糖提取物中五味子多糖的占比计算得到的。
1、取实施例1制备的五味子多糖提取物和m199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)，配制如下工作液：
工作液a(处理组i)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基(2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液a；工作液a中五味子多糖的浓度为3.12μg/ml。
工作液b(处理组ii)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基(2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液b；工作液b中五味子多糖的浓度为6.25μg/ml。
工作液c(处理组iii)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液c；工作液c中五味子多糖的浓度为12.50μg/ml。
工作液d(处理组iv)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液d；工作液d中五味子多糖的浓度为25.00μg/ml。
工作液e(处理组v)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液e；工作液e中五味子多糖的浓度为50.00μg/ml。
工作液f(处理组vi)：将五味子多糖提取物溶解于m199培养基2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)中，得到工作液f；工作液f中五味子多糖的浓度为100.00μg/ml。
2、将鲤鱼上皮瘤细胞(epc)接种至96孔板中(每孔104个细胞)，采用m199培养基(含10％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)，25℃培养至细胞长成单层。设置不接种细胞的空白对照组。
3、完成步骤2后，取所述96孔板，弃掉培养基，进行如下分组处理：
处理组：每孔加入含有100tcid50的hlj-15病毒液及步骤1制备的含不同浓度五味子多糖的的工作液100μl，15℃培养2h，吸弃孔内液体，加入100μlm199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)。
正常细胞组：每孔加入100μlm199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)，15℃培养2h后吸弃孔内液体，加入100μlm199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)。
病毒对照组：每孔加入含100tcid50hlj-15病毒液100μl，15℃培养2h后吸弃孔内液体，每孔加入100μlm199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)。
空白对照组：每孔加入100μlm199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)，15℃培养2h，吸弃孔内液体，每孔加入100μlm199培养基(含2％fbs、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素)。
每组设6个重复。15℃培养观察细胞病变情况(cytopathiceffect，cpe)，当病毒对照组cpe达到75％以上时，记录各组cpe情况(cpe判定标准：记录“-”为正常细胞，“+”为25％以上的细胞出现cpe，“++”为50％以上的细胞出现cpe。“+++”为75％以上细胞出现cpe)，并采用mtt法测定细胞活性。
结果如表1所示。
抑制率＝odtv-odcv/odm-odcv，
odtv：处理组吸光度值-空白对照组吸光度值；
odcv：病毒对照组-空白对照组吸光度值；
odm：正常细胞组-空白对照组吸光度值。
表1五味子多糖提取物抗ihnv活性
注：同列数据后不同小写字母间表示t检验差异达显著水平(p＜0.05)。
结果表明，五味子多糖提取物浓度为100μg/ml时，提取物对ihnv的抑制能力达到90.88％，随着五味子多糖提取物浓度的不断降低，其对ihnv的抑制能力逐渐下降。