去除当归多糖提取物中蛋白质的吸附剂的制备方法与流程

本发明涉及吸附剂技术领域，尤其涉及去除当归多糖提取物中蛋白质的吸附剂的制备方法。

背景技术：

当归，主产于甘肃东南部，其根可入药，早在数千年前就已经被人们作为滋补、造血、抗炎的良药，随着现代植物化学和药理学的不断发展，发现其根的主要活性成分是多糖（Carbohyd. Polym., 2012, 89, 713–722）。研究表明当归多糖具有造血刺激、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病等多种生物活性，同时还能起到保护胃肠道和肝脏的作用（Carbohyd. Polym., 2012, 89, 713–722），但是其结构与生物活性的关系及作用机理尚不明确，为解决这一问题，首先应该分离出高纯度的当归多糖。

热水浸提法（Life Sci., 2001, 69, 637–646）、超声提取法（中国药业，2010，19，34–35）、酶提取法（中国药学报，2012，40, 96–100）和微波提取法（安徽农业科学，2012, 40，16573–16574）是提取当归多糖最常用的方法。但无论是采用哪种方式提取的当归多糖，均会含有蛋白质杂质，去除粗提物中的蛋白质是获得高纯度当归多糖必不可少的步骤。

目前常用的去除当归多糖中蛋白质的方法主要有：Sevag法（江西科学，2007，25，42–46）、三氯乙酸–正丁醇法（江西科学，2007，25，42–46）反复冻融法（时珍国医国药，2011，22（2））和澄清剂法（许会生，天津：天津大学，2007）。其中前两种方法均要用到有机试剂，三氯乙酸和正丁醇不仅气味大、毒性大，而且污染环境。三氯乙酸腐蚀性极强，容易对操作人员造成身体损伤。反复冻融法在去除蛋白质的同时会有部分多糖共沉淀，造成大量多糖的损失。此外，前三种方法需要多次脱蛋白，操作复杂，能耗和时耗均较大。而对于澄清剂法脱蛋白，残留的澄清剂为多糖的进一步纯化造成负担（许会生，天津：天津大学，2007）。因此，针对当归多糖及其他植物多糖提取物中蛋白质的去除，设计合成耗能低、绿色环保、简单快捷的吸附剂有着非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种反应条件温和、易于工业化生产的去除当归多糖提取物中蛋白质的吸附剂的制备方法。

为解决上述问题，本发明所述的去除当归多糖提取物中蛋白质的吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴制备介孔硅载体：

将乙烯基三氯硅烷溶于丙酮中，并在氮气保护下缓慢滴加超纯水；然后在氮气氛围下磁力搅拌，溶液变深红褐色，析出白色固体；该白色固体经冷却至室温后抽滤并用丙酮洗至纯白色，再于25~35℃真空干燥至恒重，即得产物八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS；所述乙烯基三氯硅烷与所述丙酮的体积比为10 mL：80~125 mL；所述乙烯基三氯硅烷与所述超纯水的体积比为10 mL：25~35 mL；

将所述八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS、四氢呋喃、聚乙二醇200按20：60：20的质量比加到可密封的玻璃瓶中，超声1.0 min使其混合均匀后，按所述八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS质量的0.16倍加入自由基聚合引发剂偶氮二异丁腈，再超声1.0 min使反应物充分混合，通氮气鼓泡除氧2 min，迅速密封后于58~62℃反应24 h，得到半透明晶体材料；所述半透明晶体材料用四氢呋喃索氏提取22~26 h后，于40~60℃干燥至恒重并研成粉末状，即得介孔硅载体PPOSS；

⑵制备环氧基功能化的介孔硅材料：

将所述介孔硅载体PPOSS以1 g ：25~35 mL的比例分散于三氯甲烷中，再按每克介孔硅移取0.8~1.2 mL 浓硫酸和15~25 mL的冰乙酸；然后按照每克介孔硅逐滴加入40~50 mL 质量分数为30%的双氧水，经磁力搅拌后冷却至室温抽滤，并用超纯水洗至中性，于60~80℃干燥至恒重，即得环氧基修饰的介孔硅材料；

⑶制备络合了铜离子的功能化介孔硅材料：

将2.0~2.8 g 的亚氨基二乙酸溶于100~150 mL 超纯水中，按照亚氨基二乙酸和氢氧化钠的物质的量比为2 ：1的比例加入氢氧化钠，超声溶解后，加入1.2~1.6 g 所述环氧基修饰的介孔硅材料，再超声5 min使其混合均匀，经磁力搅拌后冷却至室温抽滤，并用超纯水洗至中性；于60~80℃干燥至恒重，即得亚氨基二乙酸修饰的介孔硅材料PPOSS-IDA；

将所述亚氨基二乙酸修饰的介孔硅材料PPOSS-IDA按1 g ：80~120 mL 的比例分散于含有100 mmol/L硫酸铜的10 mmol/L 、pH 7.4~8.0的磷酸盐缓冲溶液中，室温下搅拌2.0~3.0 h后抽滤并用超纯水洗涤，去除多余的铜离子，于60~80℃干燥至恒重，即得络合了铜离子的功能化介孔硅材料PPOSS-IDA-Cu²⁺。

所述步骤⑴中磁力搅拌的温度为30~50℃，时间为70~74 h。

所述步骤⑵中磁力搅拌的温度为65~75℃，时间为7~8 h。

所述步骤⑶中磁力搅拌的温度为60~70℃，时间为6~8 h。

如上所述的去除当归多糖提取物中蛋白质的吸附剂的制备方法所制得的络合了铜离子的功能化介孔硅材料PPOSS-IDA-Cu²⁺的应用，其特征在于：首先配制采用考马斯亮蓝显色后吸光度为0.2~0.8的当归多糖溶液；然后测定该当归多糖溶液的蛋白质含量；其次，在每毫升所述当归多糖溶液中加入20~30mg的所述络合了铜离子的功能化介孔硅材料PPOSS-IDA-Cu²⁺；最后在室温下震荡40~60 min后1650~1750 g离心8~12 min，测定上层清液中的蛋白质去除率和多糖损失率即可。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明合成的吸附剂在制备过程中，反应条件均在100 ℃以下，较为温和，适合工业化批量生产。

2、采用本发明方法制得的吸附剂进行当归多糖提取物中蛋白质杂质的去除实验表明，本发明吸附剂对当归多糖中蛋白质的去除高于传统的Sevag法、澄清剂法和反复冻融法，同时多糖损失率小与传统的Sevag法、澄清剂法、反复冻融法和三氯乙酸法。对于5 mL 10%的当归多糖提取物水溶液，加入100 mg本发明吸附剂，蛋白质一次性去除率可达到80%以上，而多糖损失率小于5%。

3、本发明所得的吸附剂吸附多糖中蛋白质杂质后，能通过含有0.20~0.25 g mL^-1尿素和0.4~0.5 g mL^-1咪唑的混合溶液洗脱，达到重复利用的效果，且吸附试验表明，经过10次重复利用，蛋白质去除率几乎没有变化。

4、本发明所得的吸附剂在去除当归多糖提取物中的蛋白质杂质时，只需要将吸附剂加入到当归多糖提取物的水溶液中震荡40 min即可，操作简便，耗时短，便于工业化操作。

5、本发明所得的吸附剂在去除当归多糖提取物中的蛋白质杂质以及吸附剂重复利用时，未使用到任何有机溶剂，绿色环保；同时，室温吸附，条件温和，能有效地保持多糖活性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺的合成步骤示意图。

图2为本发明材料PPOSS (a)及吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺ (b)的扫描电镜表征图。

图3 为本发明材料PPOSS (a)及吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺ (b)的红外谱图。

图4 为不同质量的本发明吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺，对当归多糖中蛋白质杂质的去除及多糖损失情况。

图5 为不同吸附时间时，本发明吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺对当归多糖中蛋白质杂质的去除及多糖损失情况。

图6 为本发明吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺的重复利用情况。

具体实施方式

实施例1 如图1所示，去除当归多糖提取物中蛋白质的吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴制备介孔硅载体：

将10 mL乙烯基三氯硅烷溶于80 mL丙酮中，并在氮气保护下缓慢滴加25 mL超纯水；然后在氮气氛围下于30℃磁力搅拌74 h，溶液变深红褐色，析出白色固体；该白色固体经冷却至室温后抽滤并用丙酮洗至纯白色，再于25℃真空干燥至恒重，即得产物八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS。

将八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS、四氢呋喃、聚乙二醇200按20：60：20的质量比（g/g）加到密封的玻璃瓶中，超声1.0 min使其混合均匀后，按八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS质量的0.16倍加入自由基聚合引发剂偶氮二异丁腈，再超声1.0 min使反应物充分混合，通氮气鼓泡除氧2 min，迅速密封后于58℃反应24 h，得到半透明晶体材料；半透明晶体材料用四氢呋喃索氏提取22 h后，于40℃干燥至恒重并研成粉末状，即得介孔硅载体PPOSS。

⑵制备环氧基功能化的介孔硅材料：

将介孔硅载体PPOSS以1 g ：25 mL的比例分散于三氯甲烷中，再按每克介孔硅移取0.8 mL 浓硫酸和15 mL的冰乙酸；然后按照每克介孔硅逐滴加入40 mL 质量分数为30%的双氧水，于65℃磁力搅拌8 h后冷却至室温抽滤，并用超纯水洗至中性，于60℃干燥至恒重，即得环氧基修饰的介孔硅材料。

⑶制备络合了铜离子的功能化介孔硅材料：

将2.0 g 的亚氨基二乙酸溶于100 mL 超纯水中，按照亚氨基二乙酸和氢氧化钠的物质的量比为2 ：1的比例加入氢氧化钠，超声溶解后，加入1.2 g 环氧基修饰的介孔硅材料，再超声5 min使其混合均匀，于60℃磁力搅拌8 h后冷却至室温抽滤，并用超纯水洗至中性；于60℃干燥至恒重，即得亚氨基二乙酸修饰的介孔硅材料PPOSS-IDA。

将亚氨基二乙酸修饰的介孔硅材料PPOSS-IDA按1 g ：80 mL 的比例分散于含有100 mmol/L硫酸铜的10 mmol/L 、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中，室温下搅拌2.0 h后抽滤并用超纯水洗涤，去除多余的铜离子，于60℃干燥至恒重，即得络合了铜离子的功能化介孔硅材料PPOSS-IDA-Cu²⁺。

实施例2 如图1所示，去除当归多糖提取物中蛋白质的吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴制备介孔硅载体：

将10 mL乙烯基三氯硅烷溶于125 mL丙酮中，并在氮气保护下缓慢滴加35 mL超纯水；然后在氮气氛围下于50℃磁力搅拌70 h，溶液变深红褐色，析出白色固体；该白色固体经冷却至室温后抽滤并用丙酮洗至纯白色，再于35℃真空干燥至恒重，即得产物八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS。

将八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS、四氢呋喃、聚乙二醇200按20：60：20的质量比（g/g）加到密封的玻璃瓶中，超声1.0 min使其混合均匀后，按八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS质量的0.16倍加入自由基聚合引发剂偶氮二异丁腈，再超声1.0 min使反应物充分混合，通氮气鼓泡除氧2 min，迅速密封后于62℃反应24 h，得到半透明晶体材料；半透明晶体材料用四氢呋喃索氏提取26 h后，于60℃干燥至恒重并研成粉末状，即得介孔硅载体PPOSS。

⑵制备环氧基功能化的介孔硅材料：

将介孔硅载体PPOSS以1 g ：35 mL的比例分散于三氯甲烷中，再按每克介孔硅移取1.2 mL 浓硫酸和25 mL的冰乙酸；然后按照每克介孔硅逐滴加入50 mL 质量分数为30%的双氧水，于75℃磁力搅拌7 h后冷却至室温抽滤，并用超纯水洗至中性，于80℃干燥至恒重，即得环氧基修饰的介孔硅材料。

⑶制备络合了铜离子的功能化介孔硅材料：

将2.8 g 的亚氨基二乙酸溶于150 mL 超纯水中，按照亚氨基二乙酸和氢氧化钠的物质的量比为2 ：1的比例加入氢氧化钠，超声溶解后，加入1.6 g 环氧基修饰的介孔硅材料，再超声5 min使其混合均匀，于70℃磁力搅拌6h后冷却至室温抽滤，并用超纯水洗至中性；于80℃干燥至恒重，即得亚氨基二乙酸修饰的介孔硅材料PPOSS-IDA。

将亚氨基二乙酸修饰的介孔硅材料PPOSS-IDA按1 g ：120 mL 的比例分散于含有100 mmol/L硫酸铜的10 mmol/L 、pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液中，室温下搅拌3.0 h后抽滤并用超纯水洗涤，去除多余的铜离子，于80℃干燥至恒重，即得络合了铜离子的功能化介孔硅材料PPOSS-IDA-Cu²⁺。

实施例3 如图1所示，去除当归多糖提取物中蛋白质的吸附剂的制备方法，包括以下步骤：

⑴制备介孔硅载体：

将10 mL乙烯基三氯硅烷溶于100 mL丙酮中，并在氮气保护下缓慢滴加30 mL超纯水；然后在氮气氛围下于40℃磁力搅拌72 h，溶液变深红褐色，析出白色固体；该白色固体经冷却至室温后抽滤并用丙酮洗至纯白色，再于30℃真空干燥至恒重，即得产物八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS。

将八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS、四氢呋喃、聚乙二醇200按20：60：20的质量比（g/g）加到密封的玻璃瓶中，超声1.0 min使其混合均匀后，按八乙烯基多面体低聚倍半硅氧烷ovPOSS质量的0.16倍加入自由基聚合引发剂偶氮二异丁腈，再超声1.0 min使反应物充分混合，通氮气鼓泡除氧2 min，迅速密封后于60℃反应24 h，得到半透明晶体材料；半透明晶体材料用四氢呋喃索氏提取24 h后，于50℃干燥至恒重并研成粉末状，即得介孔硅载体PPOSS。

⑵制备环氧基功能化的介孔硅材料：

将介孔硅载体PPOSS以1 g ：30 mL的比例分散于三氯甲烷中，再按每克介孔硅移取1.0 mL 浓硫酸和20 mL的冰乙酸；然后按照每克介孔硅逐滴加入45 mL 质量分数为30%的双氧水，于70℃磁力搅拌7.5 h后冷却至室温抽滤，并用超纯水洗至中性，于70℃干燥至恒重，即得环氧基修饰的介孔硅材料。

⑶制备络合了铜离子的功能化介孔硅材料：

将2.4 g 的亚氨基二乙酸溶于125 mL 超纯水中，按照亚氨基二乙酸和氢氧化钠的物质的量比为2 ：1的比例加入氢氧化钠，超声溶解后，加入1.4 g 环氧基修饰的介孔硅材料，再超声5 min使其混合均匀，于65℃磁力搅拌7 h后冷却至室温抽滤，并用超纯水洗至中性；于70℃干燥至恒重，即得亚氨基二乙酸修饰的介孔硅材料PPOSS-IDA。

将亚氨基二乙酸修饰的介孔硅材料PPOSS-IDA按1 g ：100 mL 的比例分散于含有100 mmol/L硫酸铜的10 mmol/L 、pH 7.7的磷酸盐缓冲溶液中，室温下搅拌2.5 h后抽滤并用超纯水洗涤，去除多余的铜离子，于70℃干燥至恒重，即得络合了铜离子的功能化介孔硅材料PPOSS-IDA-Cu²⁺。

如图2 (a)和(b)所示，由热引发OvPOSS自由基聚合生成的PPOSS材料的扫描电镜表明材料表面凹凸不平，呈现多孔状，修饰后得到的吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺的结构与载体PPOSS的形貌相似，基本维持载体PPOSS的形貌。表 1显示载体PPOSS经后修饰，平均孔径由4.28 nm增大到6.79 nm，比表面积由738 m² g^-1变为408 m² g^-1。

表 1本发明材料PPOSS及吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺的氮吸附分析数据

图3是材料PPOSS和PPOSS-IDA-Cu²⁺的红外谱图。修饰前后均能明显观察到1121、774 cm^-1附近Si-O-Si特征峰；对比发现1630 cm^-1处C=C的伸缩振动峰明显减弱，表明材料的双键参与了反应；1724 cm^-1附近的峰是载体PPOSS经亚氨基二乙酸与环氧基开环反应后引入羧基的C=O产生的伸缩振动峰。

此外，原子吸收法测定的材料络合铜离子的量为70.56 mg/g，进一步表明材料的成功修饰，络合上的大量铜离子，有助于提高材料对蛋白质杂质的去除率。

实施例4 对吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺去除当归多糖提取物中蛋白质杂质的条件进行优化，确定了材料用量和吸附时间。

a) 首先考察吸附剂的用量对当归多糖提取物中蛋白质杂质去除率和多糖损失率的影响：将市场上销售的10%的当归多糖提取物配成20 mg mL^-1的水溶液（为确保准确度，所配的当归多糖溶液用考马斯亮蓝显色后吸光度应在0.2~0.8），在1698 g离心10 min，除去多糖中的不溶物。分别称取10 mg、20 mg、40 mg、60 mg、80 mg、100 mg和120 mg的吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺于可密封的容器中，并各加入5 mL配好的当归多糖水溶液。室温下震荡240 min后1698 g离心10 min，测定上层清液中的蛋白质去除率和多糖损失率，具体测定方法如下：

当归多糖中多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法：1 mL的稀释合适倍数后的待测溶液（使得吸光度在0.2~0.8）置于25 mL的玻璃管中，加入1 mL 5%的苯酚水溶液，然后快速加入5 mL的浓硫酸（与液面垂直加入，并避免接触管壁），室温静置10 min后，震荡使充分反应，并置于30 ℃的水浴中20 min。测定其在490 nm处的吸光度。

当归多糖中蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法：0.5 mL的待测样品加入到2.5 mL考马斯亮蓝溶液（100 mg的考马斯亮蓝G-250溶于50 mL 95%的乙醇和100 mL的磷酸（85%）中，用超纯水定容至1000 mL并过滤即得）中，并在5~20 min内测定其在595 nm处的吸光度。

蛋白质去除率(%) =

多糖损失率(%) =

其中A₀和B₀分别为未经吸附剂处理的当归多糖溶液中测定的蛋白质和多糖含量的吸光度；A和B分别为经吸附剂处理后的当归多糖溶液中测定的蛋白质和多糖含量的吸光度。

如图4所示，当吸附剂的质量小于100 mg时，随着吸附剂质量的增加，蛋白质去除率不断增大，而120 mg吸附剂的去除率与100 mg的一样，可见已经达到吸附饱和。而对于多糖而言，随吸附剂量的增加，多糖损失率变化不大，均在5%以下，因此采用100 mg进行接下来的试验。

b) 吸附时间对蛋白质去除率和多糖损失率的影响：将市场上销售的10%的当归多糖提取物配成20 mg mL^-1的水溶液（为确保准确度，所配的当归多糖溶液用考马斯亮蓝显色后吸光度应在0.2~0.8），在1698 g离心10 min，除去多糖中的不溶物。称取100 mg吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺于可密封的容器中，并加入5 mL配好的当归多糖水溶液。密封后，在室温下震荡不同时间后1698 g离心10 min，测定上层清液中的蛋白质去除率和多糖损失率，具体测定方法同a)。

如图5所示，前40 min蛋白质去除率不断增大，之后基本上保持不变，达到了吸附平衡。图5显示，多糖损失率随时间几乎没有变化，并且均保持在5%以下。在节省时间且保证效率的情况下，我们选用40 min进行下面的试验。

综合考虑，随材料用量增大和吸附时间的延长，蛋白质去除率不断增大，直至达到平衡，而多糖损失情况基本没有变化，且保持在5%以下，可见本发明吸附剂能用于当归多糖提取物中蛋白质的去除，且多糖损失率低，而实际应用时，应根据提取物中蛋白质杂质的含量选择合适的吸附剂用量，以保证在蛋白质杂质充分去除的情况下，尽量的节约资源。

实施例5 实施例1~3中所制得的络合了铜离子的功能化介孔硅材料PPOSS-IDA-Cu²⁺的应用是指：首先配制采用考马斯亮蓝显色后吸光度为0.2~0.8的当归多糖溶液；然后测定该当归多糖溶液的蛋白质含量；其次，在每毫升当归多糖溶液中加入20~30mg的络合了铜离子的功能化介孔硅材料PPOSS-IDA-Cu²⁺；最后在室温下震荡40~60 min后1650~1750 g离心8~12 min，测定上层清液中的蛋白质去除率和多糖损失率即可。

实施例6 为验证本发明吸附剂能用于工业化大批量当归中蛋白质杂质的去除，将实施例4扩大了10倍：

市场上销售的10%的当归多糖提取物配成20 mg mL^-1的水溶液（为确保准确度，所配的当归多糖溶液用考马斯亮蓝显色后吸光度应在0.2~0.8），在1698 g离心10 min，除去多糖中的不溶物。称取1.0 g吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺于塑料杯中，并加入50 mL配好的当归多糖水溶液。在室温下震荡40 min后1698 g离心10 min，测定上层清液中的蛋白质去除率和多糖损失率，具体测定方法同实施例4。

三次试验结果表明，蛋白质杂质的平均去除率为81.58%，标准偏差小于3%，多糖平均损失率为4.94%，标准偏差小于1%，可见本发明吸附剂能用于工业化大批量去除当归多糖提取物中的蛋白质杂质。

此外，申请人比较了本发明吸附剂和传统的去除当归多糖提取物中蛋白质的方法（见表2）。本发明吸附剂对当归多糖中蛋白质的去除高于传统的Sevag法、澄清剂法和反复冻融法，同时多糖损失率小与传统的Sevag法、澄清剂法、反复冻融法和三氯乙酸法，占有绝对优势。

表2本发明吸附剂与传统的去除当归多糖提取物中的蛋白质杂质方法的比较

实施例7 吸附剂PPOSS-IDA-Cu²⁺的重复利用研究：

将吸附了蛋白质杂质的材料用含有0.2 g mL^-1尿素和0.4 g mL^-1咪唑的混合溶液抽滤洗涤，直至上清液无色后用超纯水洗去残余的尿素和咪唑，并分散于含有100 mmol/L硫酸铜的10 mmol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中，室温搅拌2.0 h，抽滤并用超纯水洗涤，去除多余的铜离子，在温度为65 ℃的真空干燥箱中干燥至恒重，再进行第二次吸附实验，如此重复10次。

如图6所示，经过10次重复利用后吸附剂对蛋白质的去除率仍在80%左右，多糖损失率保持在5%以下，可见本发明吸附剂能够通过简单的洗涤，无需使用任何有机溶剂，就能达到较好的重复利用效果，绿色环保。