一种兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖的制作方法

本发明涉及中药材深加工技术领域，具体涉及一种兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖。

背景技术：

铁皮石斛，是兰科多年生附生草本植物，为石斛之极品，一般生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒，因其表皮呈铁绿色而得名。。铁皮石斛具有独特的药用价值，以其茎入药，益胃生津，滋阴清热。一千多年前的道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首，国家卫生部已将铁皮石斛列为可用于保健食品的中药。

本发明人前期实验结果表明表明铁皮石斛多糖sdo-2是从铁皮石斛中提取的一种小分子的酸性多糖，其分子量为5.06×104da，具有与vc近似的抗氧化活性，可作为一种天然无毒抗氧化剂，应用于食品、医药和化妆品等领域。但该化合物仍然具有稳定性差、易变色等缺点。

目前，多糖因化学修饰后可以改善其固有的生物活性或获得新的功能特性而受到广泛关注。常用的修饰方法有硫酸化、乙酰化、羧甲基化等，其中，硫酸化是增强多糖的生物活性的经典方法。研究表明硫酸化多糖是人类免疫缺陷病毒（hiv）的强效抑制剂。灵芝多糖硫酸化后比之前更有效的抑制s-180细胞生长。多糖硫酸化不仅可以提高它们的抗氧化活性，也使它们具有抗菌的功效。硫酸化修饰的方法有很多，如氯磺酸法、浓硫酸法，其中氯磺酸遇水容易爆炸，浓硫酸腐蚀性太强。

考虑到试剂成本及方法的便捷、安全以及产物的得率，以实现工业化生产，本发明首次将三氧化硫-吡啶法运用到铁皮石斛多糖中活性最高的组分sdo-2的硫酸化修饰中，得到一种简单、温和、产物的产率高并且活性和稳定性强的硫酸化修饰方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足，提供一种兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖，解决了现有产品中安全性差的问题，其兼具抗肿瘤和抗氧化作用，并且sdos-2对helf细胞无毒副作用，在医疗保健等领域具有巨大的应用潜力。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖，该铁皮石斛多糖为硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2；所述硫酸化修饰铁皮石斛多糖sdos-2的分子量为9.53×104da、硫酸根含量为14.70%、取代度为1.29；所述硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖醛酸6种单糖组成。

优选地，所述硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2是以铁皮石斛多糖sdo-2为原料，利用三氧化硫-吡啶法进行硫酸化修饰获得，步骤如下：

（1）以纯度不低于95%的铁皮石斛多糖sdo-2为原料，加入原料质量35~50倍的溶剂甲酰胺，25℃水浴30min；

（2）再按原料质量的1~2倍加入三氧化硫-吡啶，60~80℃油浴下磁力搅拌3h，最后以4mol/l的naoh调ph至中性，透析，浓缩，醇沉过夜，沉淀经冷冻干燥得硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2，即为兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖。

本发明的有益效果为：（1）本发明以铁皮石斛多糖sdo-2为原料，利用三氧化硫-吡啶法进行硫酸化修饰，得到了硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2；该方法步骤简便、易于操作，sdo-2的转化率为33%，产物中硫酸根含量为14.70%、取代度为1.29，最终产品纯度高达99%以上；（2）本发明所得sdos-2在清除dpph和•o2-自由基的ic50值已经超过了阳性对照抗坏血酸；sdos-2对hela细胞的抑制率比sdo-2的高2倍；sdos-2对mcf-7细胞的抑制率几乎比sdo-2多6倍；在10μg/ml的浓度，5-fu（一个著名的抗癌药物，可在很大程度上使癌细胞致死，但同时也对正常细胞有巨大的副作用）对helf细胞的存活率仅为50％左右，但在400μg/ml时的sdos-2，其对helf细胞的存活率比5-fu对helf细胞的存活率高6倍以上，且修饰后对细胞有一定的促进生长作用；sdos-2兼具抗肿瘤功能和抗氧化能力，功效显著，其市场应用前景十分广阔。

附图说明

附图1为本发明实施例1所用原料铁皮石斛多糖sdo-2及所得产品硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2的高效液相色谱（hplc）检测图谱；

附图2为本发明实施例4中样品对dpph自由基的清除能力的测试结果；

附图3为本发明实施例4中样品对超氧阴离子(•o2−)的清除能力的测试结果；

附图4为本发明实施例4中样品对羟基自由基（•oh）的清除能力的测试结果；

附图5为本发明实施例4中样品还原力的测试结果；

附图6为本发明实施例4中样品对hela及mcf-7细胞的抑制能力的测试结果；

附图7为本发明实施例4中样品对对helf细胞的毒性作用的测试结果。

具体实施方式

为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例及附图配合详细的说明，说明如下：

实施例1：

一种兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖，该铁皮石斛多糖为硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2；所述硫酸化修饰铁皮石斛多糖sdos-2的分子量为9.53×104da、硫酸根含量为14.70%、取代度为1.29；所述硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖醛酸6种单糖组成。

所述硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2是以铁皮石斛多糖sdo-2为原料，利用三氧化硫-吡啶法进行硫酸化修饰获得，步骤如下：

（1）取纯度不低于95%的铁皮石斛多糖sdo-2为100mg原料，加入5g的溶剂甲酰胺（pf），25℃水浴30min；

（2）再加入质量为200mg三氧化硫-吡啶（so3-py），70℃油浴下磁力搅拌3h，最后以4mol/l的naoh调ph至中性，透析，浓缩，醇沉过夜，沉淀经冷冻干燥得硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2，即为兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖。

附图1为本实施例1所用原料铁皮石斛多糖sdo-2及所得产品硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2的高效液相色谱（hplc）检测图谱。

实施例2：

本实施例兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖为硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2，其分子量为9.53×104da、硫酸根含量为14.70%、取代度为1.29；由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖醛酸6种单糖组成。；其制备步骤如下：

取纯度不低于95%的铁皮石斛多糖sdo-2100mg，加入4g的溶剂甲酰胺（pf），25oc水浴30min，再加入100mg的so3-py，80℃油浴下磁力搅拌3h，naoh（4mol/l）调ph至中性，透析，浓缩，醇沉过夜，沉淀经冷冻干燥得硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2。

实施例3：

本实施例兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖为硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2，其分子量为9.53×104da、硫酸根含量为14.70%、取代度为1.29；由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖醛酸6种单糖组成。；其制备步骤如下：

取纯度不低于95%的铁皮石斛多糖sdo-2100mg，加入4.5g的溶剂甲酰胺（pf），25oc水浴30min，再加入200mg的so3-py，60℃油浴下磁力搅拌3h，naoh（4mol/l）调ph至中性，透析，浓缩，醇沉过夜，沉淀经冷冻干燥得硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2。

实施例4：

本实施例兼具抗肿瘤和抗氧化作用的铁皮石斛多糖为硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2，其分子量为9.53×104da、硫酸根含量为14.70%、取代度为1.29；由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖醛酸6种单糖组成。；其制备步骤如下：

取纯度不低于95%的铁皮石斛多糖sdo-2100mg，加入3.5g的溶剂甲酰胺（pf），25oc水浴30min，再加入200mg的so3-py，72℃油浴下磁力搅拌3h，naoh（4mol/l）调ph至中性，透析，浓缩，醇沉过夜，沉淀经冷冻干燥得硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2。

针对实施例4所得产品的抗氧化活性测试：

（1）对dpph自由基的清除作用

配制不同浓度（25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml）的铁皮石斛多糖sdo-2和硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2的水溶液，分别取2ml与2mldpph的甲醇溶液（0.13mmol/l）混和。将反应混合物用快速混匀器混合均匀并在室温25oc下孵育30min，静置，在517nm处用紫外可见光分光光度计测定吸光值；每组实验设置三个平行，取吸光值的平均值。以vc作阳性对照代替铁皮石斛多糖按上述步骤操作；

dpph自由基的清除能力按照以下公式计算：

其中，a0为2mldpph溶液加入2ml甲醇中的吸光度值；a1是2ml甲醇加2ml不同浓度的样品的混合物的吸光度值；a2为2mldpph的甲醇溶液加2ml不同浓度的样品的吸光度值。

测试结果如图2所示，从图中可以看出，在测试浓度范围内，所有样品对dpph清除能力呈明显的浓度依赖性。相同浓度下，硫酸化多糖sdos-2的清除能力比sdo-2显著增强。值得一提的是，sdos-2在低剂量25μg/ml时的活性比sdo-2几乎高两倍，甚至比阳性对照组（vc）更高。sdo-2、sdos-2和vc的ic50值分别是65.4μg/ml、10.1μg/ml和22.3μg/ml。。

（2）清除超氧阴离子(•o2−)的能力

配制不同浓度（25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml）的铁皮石斛多糖sdo-2和硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2的水溶液。

配制0.5ml的tris-hcl缓冲液（50mm，ph值8.3），和0.4ml的样品水溶液混合，室温25oc下震荡摇匀，静置20min，加入0.1ml邻苯三酚（3mmol），充分混合；在325nm处每30s测定一次吸光值，持续5min，测得最终吸光值。以蒸馏水代替样品作对照组，vc作阳性对照进行上述实验操作。每组实验设置三个平行，取平均值。

•o2−的清除能力按照如下公式计算：

其中，δa1为每个浓度的多糖水溶液的最终吸光值，δa0为以蒸馏水代替样品的对照组的吸光值。

测试结果如图3所示，从图中可以看出，sdo-2、sdos-2和vc的ic50值分别是148.7μg/ml、35.1μg/ml和37.1μg/ml。sdos-2在测试浓度范围内表现出比阳性对照还要高的清除能力。

（3）对羟基自由基（•oh）的清除作用

分别精确配制不同浓度（10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml，500μg/ml）的铁皮石斛多糖sdo-2、硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2及vc样品的水溶液，6mm的feso4溶液，2.4mm的h2o2溶液，6mm的乙醇-水杨酸溶液。

各取1mlfeso4溶液、1ml乙醇-水杨酸溶液，加入1ml样品溶液，将反应混合物在试管中震荡混匀，静置10min。再加入1mlh2o2溶液反应30min。以vc作为阳性对照，用锡箔纸分别包裹阳性对照、sdo-2和sdos-2在37oc条件下恒温水浴30min。反应产生的2,3-二羟基苯甲酸在510nm处有吸光值。以双蒸水代替多糖溶液作为空白组，以双蒸水代替水杨酸作为对照组，每组实验设三组平行。

•oh的清除能力按照如下公式计算：

其中，a0为空白组的吸光值，a2为不同浓度多糖样品的吸光值，a1为对照组的吸光值。

测试结果如图4所示，从图中可以看出，sdos-2和vc的•oh清除能力比sdo-2强很多。所有样品对•oh的清除活性具有明显浓度依赖性。sdo-2、sdos-2和vc的ic50值分别为188.9μg/ml、68.7μg/ml和50.1μg/ml。很显然，硫酸多糖sdos-2清除•oh能力比sdo-2更有效。

（4）还原力

配制不同浓度（10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml，500μg/ml）的铁皮石斛多糖sdo-2、硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2的水溶液；配制0.2mol/lph为6.6的pbs缓冲液，取0.2ml后加入质量浓度为1%的k3fe(cn)6溶液1.0ml，再加入1ml的样品，将混合物置于50oc水浴20min。然后，加入1.0ml质量浓度为10％的三氯乙酸（tca）溶液，3000转/分下离心10min。取1.5ml上清液，加入1.5ml双蒸水和0.2ml的1％的氯化铁（fecl3）溶液。混合物在25oc下避光反应30min。700nm处检测吸光值。以抗坏血酸（vc）作阳性对照，以双蒸水代替样品作空白。根据以下公式计算样品的还原力：

其中a0表示没有样品的空白组吸光值，a2表示样品的吸光值，a1表示没有k3fe(cn)6溶液的吸光值。

测试结果如图5所示，从图中可以看出，所有样品表现出一定程度的还原力。sdo-2、sdos-2和vc的ic50值分别为198.6μg/ml、88.7μg/ml和64.8μg/ml。sdos-2的还原能力相比sdo-2显著改善，并接近vc。

实施例4所得产品的体外抗肿瘤活性测试：

（1）细胞培养

helf细胞、hela细胞和mcf-7细胞均在dmem高糖型培养基中培养。dmem中加有100ml/l胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素，在37oc、5％co2的培养箱的湿润气氛中温育。

（2）mtt检测

铁皮石斛多糖sdo-2和硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2对hela细胞、mcf-7细胞和helf细胞的细胞毒性检测方法：在96孔板中分别加入0.1ml的105细胞/ml密度的hela细胞、mcf-7细胞和helf细胞培育24小时后，将不同浓度的sdo-2和sdos-2（100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml；100μl）分别加入到各培养基，37oc在co2培养箱中孵育24小时。mtt溶液（5mg/ml，20μl）加入到每个孔中，再次温育4小时。除去培养基加入100μl的dmso静置10min。在570nm下用微量滴定板读数器检测吸光度。肿瘤细胞hela及mcf-7的抑制率和正常细胞helf的存活率公式如下：

其中a和b分别是阴性对照和测试样品的平均吸光度。

测试结果如图6和图7所示，从图6中可以看出，随着样品的浓度增加，样品的抑制能力都呈剂量依赖性。对hela细胞的抑制生长能力方面，多糖sdos-2明显的比sdo-2有更强的抑制能力。在200μg/ml时，sdos-2对hela细胞的抑制率比sdo-2的高2倍。另外，sdos-2也表现出对mcf-7细胞有明显的细胞毒性，在400μg/ml，sdos-2的抑制率几乎比sdo-2多6倍。sdos-2对hela细胞的ic50值为216.7μg/ml，对mcf-7细胞的ic50值为233.9μg/ml。通过与其他多糖相比，sdos-2具有肿瘤细胞毒活性方面有相当好的优势。从图7中可以看出，用多糖培养细胞24小时后仍然保持很高的成活率，既sdo-2和sdos-2都没有毒副作用。反观5-fu的细胞存活力逐渐降低，在10μg/ml的浓度，5-fu对helf细胞的存活率仅为50％左右。在400μg/ml时，5-fu对细胞活力的影响是sdos-2的6倍以上。

本发明的有益效果为：（1）本发明以铁皮石斛多糖sdo-2为原料，利用三氧化硫-吡啶法进行硫酸化修饰，得到了硫酸化修饰的铁皮石斛多糖sdos-2；该方法步骤简便、易于操作，sdo-2的转化率为33%，产物中硫酸根含量为14.70%、取代度为1.29，最终产品纯度高达99%以上；（2）本发明所得sdos-2在清除dpph和•o2-自由基的ic50值已经超过了阳性对照抗坏血酸；sdos-2对hela细胞的抑制率比sdo-2的高2倍；sdos-2对mcf-7细胞的抑制率几乎比sdo-2多6倍；在10μg/ml的浓度，5-fu（一个著名的抗癌药物，可在很大程度上使癌细胞致死，但同时也对正常细胞有巨大的副作用）对helf细胞的存活率仅为50％左右，但在400μg/ml时的sdos-2，其对helf细胞的存活率比5-fu对helf细胞的存活率高6倍以上，且修饰后对细胞有一定的促进生长作用；sdos-2兼具抗肿瘤功能和抗氧化能力，功效显著，其市场应用前景十分广阔。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。