基于SNP位点鉴定糙果苋的CAPs分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于鉴定糙果苋的CAPs分子标记及其应用。

背景技术：

外来入侵植物糙果苋和西部苋隶属苋科苋属异株苋亚属，原产北美，是美国大豆、玉米农田的超级杂草。近几年，随着中美两国贸易增加，借助粮谷等货物传入我国风险加大，已在我国口岸多次截获。糙果苋和西部苋种子小，仅0.6～0.8mm，形态相近，难以区分。种间常发生杂交，产生一系列多态性复合群，是口岸检测鉴定以及植物分类学上的难题。Robertson(1981)和Pratt(2001)认为糙果苋和西部苋地理分布重叠，应属于同一个种。苋属植物ITS序列的研究也显示糙果苋和西部苋聚为一个进化支(自展支持率99％)，难以区分。但形态学上，西部苋胞果周裂、花被片1-2、雌花花序间生有小叶、叶片黄绿或绿色并长椭圆型的特征，与糙果苋胞果不裂、无花被片、雌花花序细长无小叶、叶片深绿色并狭长椭圆型的特征相区别，难以作为一个物种来处理。Sauer(1967、1972)便根据雌花花被片数目及等位酶实验，将两个种分别定义。糙果苋和西部苋为雌雄异株植物，虽然雌株可通过形态明显区分，雄株却缺乏充分的分类依据，常被误鉴。因此，借助新的方法来澄清两个物种的分类问题十分必要。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指由于单个核苷酸的变异所形成的遗传标记，其数量多、多态性丰富、适于快速、自动化分析。SNP的检测方法有多种，但是由于技术难度高、成本费用高，阻碍了其应用。酶切扩增多态性序列(C1eaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS)是一类以PCR为基础的共显性的分子标记，它的基本原理是先用已知SNP位点的DNA序列去设计一套特异性的PCR引物(19～27bp)。然后应用这些去扩增该位点上的某一DNA片段；接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得的扩增带并进行RFLP分析。CAPs标记的应用降低了SNP位点检测成本和难度。自1993年Konieczny和Ausubel在拟南芥上发展的CAPS标记以来,因具有共显性、位点特异性、操作简单、成本低、所需DNA样品量少和对DNA的纯度要求不高等优点成为现代生物学研究的一个非常重要的分子标记技术，在种质鉴定、辅助育种、基因鉴定和图谱构建等领域得到相当广泛的应用。

内源转录间隔区(Internally Transcribed Spacer)ITS,位于rRNA编码基因18S，5.8S和26/28S之间的小基因片段。这些rDNA高度保守地分布在染色体的不同位置，在每个单倍染色体基因组中的拷贝数超过200个,这使得保守区域能够很容易被扩增出来。同时包含保守与变异序列,能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较，rDNA在物种的鉴定应用中，具有检测种水平的多态性特征。苋属大部分植物可以通过ITS序列(629bp)相区分，但对于西部苋和糙果苋，以及绿穗苋复合群无法进一步辨识。只能根据序列内部SNP位点进行物种鉴定。多拷贝序列26SrDNA是编码核糖体亚基的基因，序列长度在600bp左右。Gutell等研究表明这段区域具有较高的变异率，可以用于亲缘关系较近的物种间的分类研究。该序列在酵母菌分类方面应用最多。苋属植物中26S位于ITS2下游，将ITS序列与26S相结合，可发现更有价值的分子标记，进而用于种下单元鉴定。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于鉴定糙果苋的基于SNP位点的CAPs分子标记及其应用。

本发明通过对苋属(Amaranthus L.)16个类群52份样本及2个外类群(青葙和空心莲子草)多拷贝核基因ITS序列进行扩增和测序，分析其系统进化关系及序列差异，得到用于区分鉴定糙果苋的SNP位点。用于糙果苋SNP位点分析的序列除来自本实验样本外，还含有Genbank中苋属植物ITS序列，共计34种177条。对序列进行比对分析后，根据糙果苋全基因组序列的contig00002片段(Genbank编号：ACQK01000002.1)，在SNP位点下游扩展寻找合适区间，通过Primer premier 5软件设计特异引物，扩增易于检测该位点的序列。并将扩增的目的片段命名为ITS616(SEQ ID NO.1)。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于区分鉴定糙果苋的特异性分子标记，其位于苋属植物多拷贝核基因ITS和26S序列上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的CAPs分子标记通过以下引物扩增得到:

正向引物347f：F5'-CCCGTGAACCATCGAGTT-3'，(SEQ ID NO.2)

反向引物807r：R5'-AACATCAGACCTCTTCGCAGG-3'(SEQ ID NO.3)。

本发明还提供用于鉴定西部苋和糙果苋的特异性PCR引物，包括正向引物F5'-CCCGTGAACCATCGAGTT-3'和反向引物R5'-AACATCAGACCTCTTCGCAGG-3'。

本发明还提供所述CAPs分子标记在鉴定糙果苋中的应用，其包括步骤：1)提取待测植株的基因组DNA；2)以待测植株的基因组DNA为模版，利用SEQ ID NO.2-3所示的引物进行PCR扩增反应；3)对PCR产物进行PCR-RFLP限制酶(StyI)切反应，并对反应产物凝胶电泳；4)检测PCR-RFLP反应PCR扩增产物，如果能够扩增出3个条带，且3个条带大小分别为461bp、273bp、188bp，则待测植株为糙果苋。

其中，2)中PCR反应体系以25μl计为：30ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，2.5mmol/L dNTP mix2.0μl，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 2μl，余量为水。

PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，24个循环；72℃10分钟。

3)中PCR-RFLP酶切反应体系为20μL：30ng/μl模板DNA 10μL，10X Buffer 2.0μL，StyI(Eco130I)酶1μL，余量为水。

PCR-RFLP酶切反应条件为：37℃水浴1小时。

本发明还提供含有SEQ ID NO.2-3所示引物的用于检测糙果苋的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明通过对苋属(Amaranthus L.)16个类群52份样本及2个外类群(青葙Celosia argentea和空心莲子草Alternanthera philoxeroides)多拷贝核基因ITS序列进行的序列扩增、测序和分析，得到用于鉴定糙果苋的SNP位点。同时结合26S rDNA序列，得到用于鉴定糙果苋的CAPs分子标记。为口岸快速鉴定外来入侵物种提供了可靠的检测方法。利用本发明提供的CAPs分子标记可实现对糙果苋的快速、准确检测鉴定。

附图说明

图1 ITS616(SEQ ID NO.1)段PCR-RFLP(StyI限制性内切酶)结果；其中，1：北美苋；2：反枝苋；3：菱叶苋；4：皱叶苋；5：胀果苋；6：刺苋；7：长芒苋；8-12：西部苋；13：糙果苋；14-15：西部苋；16-20：糙果苋；M：DNA marker DL2000。

图2 ITS基因系统发生树。

图3糙果苋、西部苋及其同属种植物ITS序列比对结果；方框部分为糙果苋特异碱基位点，方框内的1个碱基为SNP位点616。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1用于鉴定糙果苋的CAPs分子标记的获得

1、植物材料本实施例中所选材料的具体名称及材料来源见表1，用于实验的植物材料为硅胶干燥的叶片和种子。

表1植物材料及来源

2、试剂PCR扩增所用试剂均购自大连宝生物有限公司，引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，测序由上海生物工程技术服务有限公司完成。

3、方法

3.1DNA提取

硅胶干燥的植物叶片或种子100mg置于事先加入4mm钢珠的2mlEP管中，迅速放入液氮中冷冻30min,将EP管置于Geno/Grinder2000(SPEX SamplePrep)高通量研磨机上，研磨1.5min,1000rpm/min。按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒提取叶片总DNA。

3.2ITS基因扩增及测序

通用引物为ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反应体积25μL，体系包含MgCl₂ 2μL(25mmol/L)，dNTP 2μL(2.5mmol/L)，PCR缓冲液2.5μL(10×)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，聚合酶1.0U,总DNA1μL(约30ng)，余量为水。扩增程序：94℃变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s(进行30个循环)；72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，由上海生物工程技术服务有限公司测序，扩增引物同时作为测序引物进行双向测序。

3.3序列分析及系统树构建

序列编辑和拼接应用Lasergenev7.1软件中的SeqMan完成，用ClustalX进行序列比对，序列比对后，以青葙(Celosia argentea)和空心莲子草(Alternanthera philoxeroides)为外类群，使用MEGA6.0软件进行系统发育分析。空位(Gap)被处理为缺失(Missing)，以邻接法(NJ)构建系统分支树。NJ树序列间分化程度使用Kimura的二参数距离度量，每一分支的bootstrap支持率的计算设定为1000次重复取样的计算结果。

3.4 347-807特异片段扩增

设计上游引物F(5'-CCCGTGAACCATCGAGTT-3')和下游引物R(5'-AACATCAGACCTCTTCGCAGG-3')，PCR反应体系以25μl计为：30ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl引物F和R各1μl，2.5mmol/L dNTP mix2.0μl，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，25mmol/L MgCl2 2μl，余量为水。

PCR扩增程序为：94℃5分钟；94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，24个循环；72℃10分钟。3％琼脂糖凝胶电泳检查结果。

3.5PCR-RFLP限制内切酶StyI反应结果

PCR-RFLP酶切反应体系为20μl：30ng/μl模板DNA 10μl，10X Buffer 2.0μl，StyI(Eco130I)酶1μl，余量为水。

PCR-RFLP酶切反应条件为：37℃水浴1小时。3％琼脂糖凝胶电泳检查结果。

4、结果

4.1植物材料DNA提取及ITS基因扩增

本实施例中，将多个植物样品同时在Geno/Grinder 2000高通量组织研磨仪内进行研磨，可以一次获得大规模的DNA样本，大大提高了实验效率。研磨后样品直接用TIANGEN试剂盒提取DNA效果较好，样品浓度均在50-100μg/μL,可用于后续试验。ITS基因的扩增产物为一条650bp的条带，该PCR产物纯化后送上海生工测序。

4.2ITS和26S基因序列分析和特异引物设计

用Lasergenev7.1软件进行序列的剪切、拼接和统计等分析，确保序列的准确性，保存成FASTA或纯文本格式。用ClustalX软件进行排序，个别位点手工校对，使用MEGA6.0软件进行系统发育分析。根据序列相似度绘制的系统发生树(图2)，由NJ树可以看出，西部苋和糙果苋呈明显的并系关系，二者聚类为一支(97％自展支持率)，属单系起源，与其它苋互为姊妹群。通过ITS序列，仅能将两种苋与其它苋区分，但不能区分西部苋和糙果苋。

在对16个苋属植物ITS基因序列的差异碱基进行比较后,发现糙果苋与西部苋以及其它苋在616位点存在变异，糙果苋在该位点为A且为杂合位点(A>G)，西部苋及其它苋在该位点为G，为纯合位点。该SNP位点与相邻碱基组成“CCA₆₁₆AGG”，为StyI内切酶识别位点。但该位点靠近ITS2序列末端，酶切后的片段长度差异小，电泳结果不检测。因此，通过Genbank核酸序列检索，根据糙果苋全基因组序列的contig00002片段(Genbank编号：ACQK01000002.1)，在SNP位点616的下游(26S)扩展寻找合适区间，即ITS与26S序列相结合，通过Primer premier 5软件设计特异引物347f(SEQ ID NO.2)、807r(SEQ ID NO.3)，扩增易于检测该位点的序列。

4.3ITS616基因(SEQ ID NO.1)的PCR-RFLP检测

用特异引物347f、807r，对糙果苋和西部苋以及其它苋进行PCR扩增试验，由图1可以看出，只有糙果苋有3条带，分别为461bp、273bp、188bp，其他的物种仅有461bp一个条带，可以达到区分糙果苋的目的。切胶纯化上述条带，测序得到扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国环境科学研究院

<120> 基于SNP位点鉴定糙果苋的CAPs分子标记及其应用

<130> KHP161118887.4C

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 461

<212> DNA

<213> 糙果苋

<400> 1

tcgagttttt gaacgcaagt tgcgcccgaa gcctttggcc agggcacgtc tgcctgggcg 60

tcacgcactg cgtctccccc aacccgccta gctgtgggag gggcgaggag gatggtctcc 120

catgcctcac cgggcgtgga tggcctaaaa caggagccca cggtttcgag ctgctgcggc 180

gattggtggt gtgcaaggcc tagcctagaa tgcaatcgcg tcgtacagcg cgtggacctt 240

gtggccttga ggaccctaga gtgttgcccg agggcgacca accactgcga ccccaggtca 300

ggcgggacta cccgctgagt ttaagcatat caataagcgg aggaaaagaa acttacaagg 360

attcccctag taacggcgag cgaaccggga atagcccagc tttaaaatcg ggcggctttg 420

ctgtctgaat tgtagtctgg agaagcgtcc tctgcggcgg a 461

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccgtgaacc atcgagtt 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacatcagac ctcttcgcag g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcctccgctt attgatatgc 20