本发明及微生物分子生物学检测试剂，具体涉及一种基于LAMP技术的干粉化产气荚膜梭菌核酸快速诊断试剂盒及其使用方法。
背景技术：
：产气荚膜梭菌曾称魏氏梭菌或产气荚膜杆菌，是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌。产气荚膜梭菌广泛分布于人畜粪便、土壤、污水等外环境中，其产生的肠毒素是引起食物中毒的主要因素，被产气荚膜梭菌污染的水在加热后，其芽孢仍可在较高温度、长时间贮存的过程中生长、繁殖，最后进入肠道并产生肠毒素而引起中毒。产气荚膜梭菌是指能够指示水体已有粪便污染，并可能伴存有肠道病原菌的一类细菌，根据规定饮用天然矿泉水中不得检出产气荚膜梭菌，现可用于瓶装水中产气荚膜梭菌检验的传统生化方法有涂布法、多试管MPN法和滤膜法，为提高检测效率，也可用酶联免疫技术、核酸探针技术、核酸扩增技术等分子生物学检测方法，进行快速检测和结果初筛。这些技术试图突破传统的形态学、生化反应等传统模式，不需要对目标菌进行分离提纯，而直接用样品或者样品的增菌液检测，使得检测向准确、快速和低成本方向发展。LAMP技术是2000年由日本研究人员Notomi等开发的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶。使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在等温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应。LAMP用于快速检测无需复杂仪器，具有结果判读简单、灵敏度高、特异性好、检测范围广泛以及应用成本低的优点。在实际应用中，检测前均要配制相应的溶液反应体系，且其中成分较多，极易导致频繁操作引起的试剂污染、检测区间污染以及结果误差等，加之该反应体系中部分试剂需要冷冻储存，如所需的BstDNA聚合酶需严格在-20℃条件下保存，温度过高会影响其酶活性，造成检测试剂失效。因此对该试剂的高温长途运输以及现场应用等造成不便，也提高了相应成本。同时，当前该检测方法尚未在食品安全、医药等领域推广开来，尤其在水体的快速检测上，作为非标方法，目前已有的LAMP产品仅仅针对检测流程，涉及到样品前处理的方式均无提及。且市场上基于环介导恒温扩增技术的产气荚膜梭菌快速诊断试剂盒较少，且能用于常温运输的干粉型同类产品尚未出现。干粉型LAMP快速检测试剂盒开发的难点主要有以下几个：1)保持冻干过程中BstDNA聚合酶的活力基本不损失；2)设计出合适的引物；3)显色不够明显，难以区分结果。为了保持BstDNA聚合酶的活力，添加冻干保护剂是比较常规的选择，常用的冻干保护剂是海藻糖，但是其保护效果比较有限，比较难以保证产品质量。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有产气荚膜梭菌检测技术以及其相关产品制备工艺的不足，提供一种适于常温运输的基于LAMP技术的干粉化产气荚膜梭菌快速诊断试剂盒以及其制备使用方法。该试剂盒和使用方法涵盖从取样到检测的整体解决方案，可满足食品安全中饮用水的生产流通各个环节的快速检测的需求。本发明所采取的技术方案是：一种应用于水中产气荚膜梭菌的快速检测试剂盒，包括冻干等温扩增剂，复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液，冻干等温扩增剂中含有dNTPs、BstDNA聚合酶、外引物、内引物、环引物和冻干保护剂，冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成。冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含3％～6％(w/v)海藻糖、0.01％-0.1％(w/v)甘氨酸、0.1％-1％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含4％～5％(w/v)海藻糖、0.04％-0.07％(w/v)甘氨酸、0.4％-0.7％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB的序列如下：产气荚膜梭菌-F3：CTAGATATGAATGGCAAAGAGG产气荚膜梭菌-B3：AGATATCAGCATAAAAATCCTCA产气荚膜梭菌-FIP：GGCAGTAACATTAGCAGGATGATATTAAACAAGCTACATTC-TATCTTGG产气荚膜梭菌-BIP：TGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGCAACCTGCTGTGTT产气荚膜梭菌-LF：CTCCAAAATAGTGCATAGCCTCT产气荚膜梭菌-LB：TGAAACTTTTGCAGAGGAAAGAAA。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl2的终浓度为120～360μmol/L。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为液体石蜡。一种水中产气荚膜梭菌的快速检测方法，包括如下步骤：1)取水样抽滤，滤膜置于产气荚膜梭菌增菌培养基中增菌培养；2)增菌培养完成后分离微生物，裂解后提取核酸；3)将复溶液加入冻干等温扩增剂中，使冻干等温扩增剂完全溶解，得到反应液；4)按等温扩增操作分别在不同管内的反应液中加入提取得到的样品核酸、阳性对照和阴性对照，反应结束后加入显色液，对结果进行判断。本发明的有益效果是：1)该试剂的干粉化制备工艺加入复合冻干保护剂，大大增加试剂稳定性，试剂的保质期时间可以延长到2年，便于常温运输，节约运输成本，临用前暴露于室温72小时后基本不影响使用效果。2)该干粉化试剂已将反应体系中部分组分试剂按相应比例组合，并经复溶液即溶即用，减少溶液配置步骤，使用更加便捷、准确，更适于基层现场检测；3)该反应过程在等温条件下即可进行，无需特殊配套试剂以及仪器，大大降低了检测成本；4)反应所需模板量少，灵敏度高，最低检验限可低至11CFU/Test；5)利用靶基因序列设计并筛选三对引物，特异性地识别靶序列上的八个独立区域，具有高度特异性，实现反应在30～45min内完成，高效而快速；6)通过反应前加入由钙黄绿素和氯化锰按照一定比例混合的显色液，可通过肉眼颜色变化或者荧光监测仪器对荧光图谱的变化对结果进行判读，阴阳性的颜色变化差异明显，判读直观方便，且避免反应后开盖造成的气溶胶污染。具体实施方式一种应用于水中产气荚膜梭菌的快速检测试剂盒，包括冻干等温扩增剂，复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液，冻干等温扩增剂中含有dNTPs、BstDNA聚合酶、外引物、内引物、环引物和冻干保护剂，冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成。冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含3％～6％(w/v)海藻糖、0.01％-0.1％(w/v)甘氨酸、0.1％-1％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，冻干等温扩增剂在冻干前的组成为：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L内引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含4％～5％(w/v)海藻糖、0.04％-0.07％(w/v)甘氨酸、0.4％-0.7％牛血清白蛋白，余量为无菌超纯水。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，复溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜碱。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB的序列如下：产气荚膜梭菌-F3：CTAGATATGAATGGCAAAGAGG产气荚膜梭菌-B3：AGATATCAGCATAAAAATCCTCA产气荚膜梭菌-FIP：GGCAGTAACATTAGCAGGATGATATTAAACAAGCTACATTC-TATCTTGG产气荚膜梭菌-BIP：TGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGCAACCTGCTGTGTT产气荚膜梭菌-LF：CTCCAAAATAGTGCATAGCCTCT产气荚膜梭菌-LB：TGAAACTTTTGCAGAGGAAAGAAA。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，显色液由0.3～1.5mmol/L的钙黄绿素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2混合得到，钙黄绿素的终浓度为15～75μmol/L，MnCl2的终浓度为120～360μmol/L。作为上述快速检测试剂盒的进一步改进，封闭液为液体石蜡。一种水中产气荚膜梭菌的快速检测方法，包括如下步骤：1)取水样抽滤，滤膜置于产气荚膜梭菌增菌培养基中增菌培养；2)增菌培养完成后分离微生物，裂解后提取核酸；3)将复溶液加入冻干等温扩增剂中，使冻干等温扩增剂完全溶解，得到反应液；4)按等温扩增操作分别在不同管内的反应液中加入提取得到的样品核酸、阳性对照和阴性对照，反应结束后加入显色液，对结果进行判断。本试剂盒基于环介导恒温扩增技术快速检测产气荚膜梭菌，是利用三对特殊引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶，特异性识别靶序列上的八个独立区域，并实现在恒温条件下(60～65℃)进行链置换扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过热变性过程获得单链模板、检测时间长、易污染以及成本高等缺点，同时该方法在温和温度条件进行，操作简便，对检测人员的技术素质要求也低，便于对大样本实现成本低廉的快速筛选。目前国内主要以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化鉴定和血清学分型鉴定等通行方法进行食品微生物学相关检验，其初步鉴定一般需要2～3天，而最终完成鉴定报告则需10～15天，但采用本试剂盒检测从收集样本到检测完成仅需12～14小时，且本试剂盒采用钙黄绿素显色液，使得通过肉眼即可判读结果，更加直观清晰。如无特别说明，本发明中的w/v为质量体积比，组成中的百分比如无特别说明，均指质量百分比。下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。引物的筛选发明人设计了6组引物，分别如下：表1、不同产气荚膜梭菌LAMP引物序列注：表中，组1中6条引物cpa-F3、cpa-B3、cpa-FIP、cpa-BIP、cpa-LF、cpa-LB依次编号为1～6，组2中的6条引物cpa-F3、cpa-B3、cpa-FIP、cpa-BIP、cpa-LF、cpa-LB依次编号为7～12，其他组的编号类似。采用最优的6组引物序列组合，均含有环引物，经过统一的优化的反应体系测试，通过琼脂糖凝胶电泳观察反应产物，引物组1仅需35min即有明显的扩增条带，引物组2和引物组5在40min左右，引物组3、引物组4和引物组6在45min左右。试剂盒的制备：引物：表1中的引物组1。冻干等温扩增剂：冻干前的组成如表2:表2、不同冻干检测剂的组成表冻干检测剂的制备方法：无菌环境下混合需要冻干处理的相关组分混合液，封装于容器中，按照常规冷冻干燥程序进行干燥，即可得到冻干等温扩增剂。复溶液：组成如下，组分终浓度KCl8mmol/LTris-HCl,，pH8.816mmol/L(NH4)2SO49mmol/LMgSO46mmol/LTritonX-1000.2％甜菜碱1.2mol/L水余量无菌环境下混合复溶液组分，置于容器中。阳性对照干粉：向提纯的产气荚膜梭菌基因组DNA溶液分别加入3％(w/v)的海藻糖，分装与容器中，同样经上述冻干程序制备阳性对照干粉。显色液：由0.3mmol/L的钙黄绿素和7.2mmol/L的MnCl2等体积混合得到，钙黄绿素的终浓度为15μmol/L，MnCl2的终浓度为360μmol/L，置于容器中。封闭液：液体石蜡，无菌分装，置于容器。裂解液：含有10～20mmol/LTris-HCl(pH8.3)、1mmol/LEDTA、0.3～1％(w/v)SDS，置于容器中。稳定性实验分别取例1～6的冻干等温扩增剂进行稳定性实验，4℃保存，每隔3个月利用试剂盒进行产品的反应效果验证，结果见表3：表3、不同冻干等温扩增剂的稳定性采用例1复合冻干保护剂进行反应试剂的冻干，经过液氮预冻和冷冻干燥后，试剂冻干粉能保持较高的稳定性，最长的保质期时间为21-24个月，远高于同类型产品的12个月保质期，24个月保质期时其检验限略有下降，灵敏度仍然可达到58CFU/Test左右。除含5％海藻糖的单一保护剂有吸潮现象外，其余复合保护剂冻干成粉状制剂后在各自保质期范围内均保持良好形态，没有塌陷和镂空现象。最低检验限和灵敏度的比较1)用无菌接种环分别挑取产气荚膜梭菌(ATCC13124)的纯菌菌落，用灭菌生理盐水进行梯度稀释(稀释倍数分别为100，101，102，103，104，105，106，107，108)，并分别取各个稀释菌液100μL螺旋接种到TSA平板进行培养和计数；2)分别取以上稀释菌液100μL，6000r/min离心5min，弃上清，加入10μL裂解液充分悬浮菌体沉淀，99℃加热裂解菌体10min，菌体裂解液12000r/min离心15min，取上清即为粗提的菌体模板基因；3)以上粗提DNA为模板进行PCR和LAMP反应，产气荚膜梭菌PCR引物为：PF-5’-GCTGGGACATCAACTAAAGTC-3’(SEQIDNO：37)，PR-5’-CGCTATCA-ACGGCAGTAAC-3’(SEQIDNO：38)；4)扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，35个循环；5)以上粗提DNA为模板进行LAMP反应，取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各个稀释菌液对应的粗提DNA模板2.5μL，无菌超纯水2.5μL，充分混匀后加入20μL/管封闭液，紧盖，设置64℃恒温反应50min；6)以上PCR与LAMP扩增产物用琼脂糖凝胶电泳来判读，平板菌落计数确定最低检验限。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示产气荚膜梭菌PCR的最低检验限在105倍数稀释处，LAMP最低检验限制在106倍数稀释处。对应的菌落计数采用GB4789.2-2010食品微生物学检验菌落总数测定标准，产气荚膜梭菌在106倍数稀释处为11CFU，结果显示LAMP检测的灵敏度远高于PCR。纯菌的检测1)样品处理：用于纯菌的筛选鉴定中，用接种环挑取单菌落半环，转移到含有30μL裂解液的无菌PCR管中，充分混匀后水浴或者金属浴99℃热裂解10min；裂解结束后转到离心机中12000r/min离心10min，取上清即为样品粗提基因组DNA，选用的菌株见表4：表42)恒温扩增反应：取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各类菌粗提的DNA模板2.5μL，其中，取1管作为阴性对照，1管作为阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色液2.5μL，充分混匀后加入20μL封闭液，紧盖，经BiometraprofessionalPCR仪进行恒温扩增，64℃恒温反应50min；3)反应后判读：反应结束后，对比反应前后颜色变化，若呈现荧光绿则为阳性，淡橙色则为阴性，若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测，整个观察过程不得打开反应管盖。检测结果见表5：结果，经本发明检测，以上所选的产气荚膜梭菌和非产气荚膜梭菌的核酸快速检测中，产气荚膜梭菌的标准菌株在各自的检测体系中出现明显荧光绿，而所选非产气荚膜梭菌属各菌反应前后均未出现明显颜色变化，仍为淡橙色，可见本发明具有极好的特异性，能有效检出产气荚膜梭菌。本发明所述的包装饮用水中产气荚膜梭菌的检测方法如下：1)样品处理：取250mL待检水样进行抽滤，后将滤膜浸泡于100mL梭菌增菌培养基，37±1℃条件下增菌8-12h。吸增菌液1mL到1.5mL规格的无菌离心管中，6000r/min离心5min，弃上清。加入30μL裂解液，充分悬浮菌体，轻弹管壁消除气泡，99℃加热10min，12000r/min离心15min，上清即为粗提的DNA；2)恒温扩增反应：取出干粉化检测反应管，每管分别加入上述复溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分别加入以上各样品粗提的DNA模板2.5μL，其中，取1管作为阴性对照，1管作为阳性对照，分别加入对应的对照试剂2.5μL，后分别向所有各管中加入显色液2.5μL，充分混匀后加入20μL封闭液，紧盖，经BiometraprofessionalPCR仪进行恒温扩增，64℃恒温反应45min；3)反应后判读：反应结束后，观察反应管中溶液由检测前的淡橙色变为荧光绿色，与阳性对照管变化相同，表示有产气荚膜梭菌检出，反之，无颜色变化，表示无检出。通过增加前增菌步骤，对比其他方法的效果，可使产气荚膜梭菌检出率更高，避免漏检现象。SEQUENCELISTING<110>广东环凯生物科技有限公司广东环凯微生物科技有限公司<120>产气荚膜梭菌干粉化LAMP快速检测试剂盒及其使用方法<130>cpa<160>38<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工引物<400>1ctagatatgaatggcaaagagg22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>2agatatcagcataaaaatcctca23<210>3<211>49<212>DNA<213>人工引物<400>3ggcagtaacattagcaggatgatattaaacaagctacattctatcttgg49<210>4<211>40<212>DNA<213>人工引物<400>4tgatagcgcaggacatgttaagtttgcaacctgctgtgtt40<210>5<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>5ctccaaaatagtgcatagcctct23<210>6<211>24<212>DNA<213>人工引物<400>6tgaaacttttgcagaggaaagaaa24<210>7<211>22<212>DNA<213>人工引物<400>7ctagatatgaatggcaaagagg22<210>8<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>8agatatcagcataaaaatcctca23<210>9<211>49<212>DNA<213>人工引物<400>9ggcagtaacattagcaggatgatattaaacaagctacattctatcttgg49<210>10<211>40<212>DNA<213>人工引物<400>10tgatagcgcaggacatgttaagtttgcaacctgctgtgtt40<210>11<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>11ctccaaaatagtgcatagcctct23<210>12<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>12gcagaggaaagaaaagaacag21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>13gctatgcactattttggagat21<210>14<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>14ttccctgttttagcaaaacc20<210>15<211>48<212>DNA<213>人工引物<400>15actgttcttttctttcctctgcaaatatcatcctgctaatgttactgc48<210>16<211>48<212>DNA<213>人工引物<400>16caggttgcaaaactaatgaggattttcttgcatattcttttgaccatg48<210>17<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>17catgtcctgcgctatcaacg20<210>18<211>22<212>DNA<213>人工引物<400>18tcaatatactatagtcatgcta22<210>19<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>19tttctcaaaggataatagttggt23<210>20<211>18<212>DNA<213>人工引物<400>20atgtcctgcgctatcaac18<210>21<211>49<212>DNA<213>人工引物<400>21gccattcatatctagctaatgctgattattctatacctgatacagggga49<210>22<211>47<212>DNA<213>人工引物<400>22caagctacattctatcttggagaggattagcaggatgatatggagta47<210>23<211>19<212>DNA<213>人工引物<400>23aaattttcttatttgtgat19<210>24<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>24tatgcactattttggagata20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>25tgggatgattgggattatgc20<210>26<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>26tccatcctttgttttgattcc21<210>27<211>47<212>DNA<213>人工引物<400>27accctctgatacatcgtgtaagaatagcaaaggtaactctagctaac47<210>28<211>44<212>DNA<213>人工引物<400>28tgatccatcagttggaaagaatgtagtagtcatctgttccagca44<210>29<211>20<212>DNA<213>人工引物<400>29cccgctgttcctttttgaga20<210>30<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>30agaactagtagcttacatatc21<210>31<211>22<212>DNA<213>人工引物<400>31cagaggaaagaaaagaacagta22<210>32<211>21<212>DNA<213>人工引物<400>32tgagagttagctagagttacc21<210>33<211>46<212>DNA<213>人工引物<400>33ttgcatattcttttgaccatgcattcaggttgcaaaactaatgagg46<210>34<211>45<212>DNA<213>人工引物<400>34gaggttttgctaaaacagggaaatctttgctgcataatcccaatc45<210>35<211>24<212>DNA<213>人工引物<400>35tctttgtttttaagatatcagcat24<210>36<211>25<212>DNA<213>人工引物<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