产气荚膜梭菌干粉化LAMP快速检测试剂盒及其使用方法与流程

文档序号:12109250阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种应用于水中产气荚膜梭菌的快速检测试剂盒,包括冻干等温扩增剂,复溶液、阳性对照干粉、阴性对照、显色液、裂解液和封闭液,冻干等温扩增剂中含有dNTPs、Bst DNA聚合酶、外引物、内引物、环引物和冻干保护剂,其特征在于:冻干保护剂由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白组成。

2.根据权利要求1所述的快速检测试剂盒,其特征在于:冻干等温扩增剂在冻干前的组成为:0.9~1.6 mmol/L dNTPs、0.3~0.4 U/μL Bst DNA聚合酶、0.1~0.5 μmol/L外引物F3/B3、1.0~2.0 μmol/L内引物FIP/BIP、0.5~1.5 μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含3% ~ 6% ( w/v)海藻糖、0.01%-0.1% (w/v)甘氨酸、0.1%-1% 牛血清白蛋白,余量为无菌超纯水。

3.根据权利要求2所述的快速检测试剂盒,其特征在于:冻干等温扩增剂在冻干前的组成为:0.9~1.6 mmol/L dNTPs、0.3~0.4 U/μLBst DNA聚合酶、0.1~0.5 μmol/L外引物F3/B3、1.0~2.0 μmol/L内引物FIP/BIP、0.5~1.5 μmol/L环引物LF/LB以及冻干复合保护剂含4% ~ 5% (w/v)海藻糖、0.04%-0.07% (w/v)甘氨酸、0.4%-0.7%牛血清白蛋白,余量为无菌超纯水。

4.根据权利要求1~3任意一项所述的快速检测试剂盒,其特征在于:复溶液含有2~9 mmol/L MgSO4、8~12 mmol/L KCl、15~20 mmol/L Tris-HCl、8~12 mmol/L (NH4)2SO4、0.1~0.3% Triton X-100以及0.5~1.5 mol/L甜菜碱。

5.根据权利要求1~3任意一项所述的快速检测试剂盒,其特征在于:外引物F3/B3、内引物FIP/BIP以及环引物LF/LB的序列如下:

产气荚膜梭菌-F3:CTAGATATGAATGGCAAAGAGG

产气荚膜梭菌-B3:AGATATCAGCATAAAAATCCTCA

产气荚膜梭菌-FIP:GGCAGTAACATTAGCAGGATGATATTAAACAAGCTACATTC- TATCTTGG

产气荚膜梭菌-BIP:TGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGCAACCTGCTGTGTT

产气荚膜梭菌-LF:CTCCAAAATAGTGCATAGCCTCT

产气荚膜梭菌-LB:TGAAACTTTTGCAGAGGAAAGAAA。

6.根据权利要求1~3任意一项所述的快速检测试剂盒,其特征在于:显色液由0.3~1.5 mmol/L的钙黄绿素和2.4~7.2 mmol/L的MnCl2混合得到,钙黄绿素的终浓度为15~75 μmol/L,MnCl2的终浓度为120~360 μmol/L。

7.根据权利要求1~3任意一项所述的快速检测试剂盒,其特征在于:裂解液含有:10~20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、1 mmol/L EDTA、0.3~1%(w/v)SDS。

8.根据权利要求1~3任意一项所述的快速检测试剂盒,其特征在于:封闭液为液体石蜡。

9.一种水中产气荚膜梭菌的快速检测方法,包括如下步骤:

1)取水样抽滤,滤膜置于产气荚膜梭菌增菌培养基中增菌培养;

2)增菌培养完成后分离微生物,裂解后提取核酸;

3)将复溶液加入冻干等温扩增剂中,使冻干等温扩增剂完全溶解,得到反应液;

4)按等温扩增操作分别在不同管内的反应液中加入提取得到的样品核酸、阳性对照和阴性对照,反应结束后加入显色液,对结果进行判断。

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