一种用于铁柱冬瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及鉴定方法与流程

本发明属于杂交种子纯度鉴定技术领域，具体涉及一种用于铁柱冬瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR327及鉴定方法。

技术背景

种子纯度是衡量种子质量的一项重要指标。快速准确鉴定种子纯度，对于种子生产者、销售者和使用者均具有重要应用价值。

铁柱冬瓜是广东省农业科学院蔬菜研究所育成的杂交一代冬瓜品种。由于其具有丰产、抗病、耐贮运的特点，深受种植者欢迎，种子常常供不应求。冬瓜种子纯度鉴定的传统鉴定方法是形态鉴定法，通过鉴定植株和果实的形态特征，分辨出因种子生产过程中隔离措施不够造成的花粉混杂个体、母本去雄不彻底造成的母本自交个体，以及种子收获或加工过程中混入的机械混杂的个体，进而计算杂交种子纯度。这种方法的不足之处是鉴定时间长，通常需要3个月左右待冬瓜植株结果后才能得到鉴定结果，而且由于瓜类生长受季节和气候条件限制，通常无法在种子收获后立即进行纯度鉴定，导致新生产种子的销售时间延后。因此急需探索一种可以快速准确且不受季节气候限制的纯度鉴定方法。

分子标记技术的发展为冬瓜品种纯度快速鉴定提供了全新的手段。分子标记技术包括AFLP(扩增片段长度多态性)技术、RAPD(随机引物扩增多态性)技术、SRAP(相关序列扩增多态性)技术、RFLP(限制性片段长度多态性)技术等，其中SSR技术采用PCR扩增方法，仅需采集微量组织提取DNA，且对样品DNA质量要求不高，样品处理技术简便；由于SSR标记呈共显性遗传，且多态性丰富，重复性好，结果稳定可靠，非常适合用于杂交种子纯度检测。分子标记法在杂交种种子纯度鉴定中应用越来越广泛，有逐渐取代传统的形态鉴定法的趋势，目前已在水稻、黄瓜、南瓜、节瓜等作物杂交种纯度鉴定中应用，但在冬瓜中尚未见应用。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供用于铁柱冬瓜种子纯度鉴定的SSR引物，该引物能产生母本特异性标记和父本特异性标记(即共显性分子标记)，重复性好、特异性强。

本发明的目的还在于提供一种铁柱冬瓜种子纯度的鉴定方法，该方法利用上述SSR引物，能准确、快速、便捷、有效的鉴定铁柱冬瓜种子纯度。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种用于铁柱冬瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物，所述引物SSR327包括上游引物SSR327-F和下游引物SSR327-R，所述引物SSR327上游引物SSR327-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物SSR327的下游引物SSR327-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

引物SSR327的上游引物SSR327-F和下游引物SSR327-R的具体核苷酸序列分别如下：

SSR327-F：5’-AAACAACACCGTTTCTTCCG-3’(SEQ ID NO.1)；

SSR327-R：5’-TCAGCGACATCAGAAACACC-3’(SEQ ID NO.2)；

以上标记带型清晰、重复性好，经特异性片段(聚丙烯酰胺非变性胶)回收DNA-PCR扩增-琼脂糖胶回收-TA克隆测序后，分析结果得知：引物SSR327能产生184bp的母本特异性标记SSR327₁₈₄(SEQ ID NO.3)和199bp的父本特异性标记SSR327₁₉₉(SEQ ID NO.4)。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种铁柱冬瓜种子纯度的鉴定方法，含以下步骤：

(1)取冬瓜子叶，提取冬瓜基因组DNA；

(2)以冬瓜基因组DNA为模板，使用上述引物SSR327进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，显色，统计电泳结果；

(4)对电泳结果进行分析，只有同时具有两个亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带或为非亲本特异性条带的单株记为假杂种，计算种子纯度，其中引物SSR327能产生184bp的如SEQ ID NO.3所示的母本特异性标记SSR327₁₈₄以及199bp的如SEQ ID NO.4所示的父本特异性标记SSR327₁₉₉。

在上述铁柱冬瓜杂交种子纯度鉴定步骤中：

步骤(2)中PCR扩增时采用的20μL反应体系为：150ng·μL^-1基因组DNA 1μL、含Mg²⁺10×PCR buffer 2μL、2.5mmol·L^-1dNTPs 1.5μL、0.25mmol·L^-1SSR327-F 1μL、0.25mmol·L^-1SSR327-R 1μL、2U/μL Taq酶1μL、ddH₂O 12.5μL。

步骤(2)中PCR扩增时扩增程序为：95℃预变性3min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。

步骤(3)中凝胶电泳时采用质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明中的SSR引物SSR327在杂种一代中能同时产生母本特异性标记和父本特异性标记，且特异性强；

(2)本发明的方法可将铁柱冬瓜种子与其亲本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；

(3)本发明方法具有准确、快速、成本低、鉴定周期短操作简便等优点，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例2中铁柱冬瓜种子纯度鉴定中引物SSR327的PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，其中M：100bp Ladder Ⅰ分子量标准；P₁：铁柱冬瓜母本，P₂：铁柱冬瓜父本；F₁：铁柱冬瓜杂交种；

图2为实施例3中从广东遂溪基地所取的第1-46个铁柱冬瓜杂交种样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图3为实施例3中从广东遂溪基地所取的第47-57个铁柱冬瓜杂交种样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图4为实施例4中从广东清远基地所取的第1-46个铁柱冬瓜杂交种样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图5为实施例4中从广东清远基地所取的第47-92个铁柱”、冬瓜杂交种样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图6为实施例4中从广东清远基地所取的第93-138个铁柱冬瓜杂交种样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图7为实施例4中从广东清远基地所取的第139-159个铁柱冬瓜杂交种样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种。

具体实施实例

实施例1

本实施例提供的铁柱冬瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR327的筛选过程如下：

根据冬瓜转录组测序结果设计的引物若干对在亲本(铁柱冬瓜父本和母本)及F1(铁柱冬瓜杂交种)间进行筛选，选出共显性差异标记条带的引物SSR327，该标记带型清晰、重复性好，序列如下所示：

SSR327-F：5’-AAACAACACCGTTTCTTCCG-3’(SEQ ID NO.1)；

SSR327-R：5’-TCAGCGACATCAGAAACACC-3’(SEQ ID NO.2)。

以冬瓜基因组DNA为模板，使用上述SSR引物SSR327进行PCR扩增—对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳—特异性片段(聚丙烯酰胺非变性胶)回收DNA—PCR扩增—琼脂糖胶回收—TA克隆测序后，分析结果得知：引物SSR327能产生184bp的母本特异性标记SSR327₁₈₄(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)和199bp的父本特异性标记SSR327₁₉₉(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4)。

母本特异性标记SSR327₁₈₄，如SEQ ID NO.3所示：

父本特异性标记SSR327₁₉₉，如SEQ ID NO.4所示：

实施例2

本实施例提供的“铁柱”冬瓜杂交种子纯度鉴定方法，包括以下步骤：

(1)冬瓜DNA的提取

实验材料为铁柱冬瓜杂交种及其父本、母本的子叶，提取子叶DNA步骤如下：

①取一片子叶放入2mL离心管中，加入液氮用研磨杵研磨，在液氮快蒸干时迅速加入800μL 2％CTAB提取液，混匀后置于65℃水浴45min(每隔10min摇匀一次)；

②静置至室温后，加入800μL的氯仿：异戊醇(24:1)，轻柔混匀，静置2min后离心，12000rmp，15min，取上清(约510μL)转移至新的1.5mL离心管；

③加入上清液1/3体积的NaAc(3mol/l)，加入上清液1.5倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，轻柔混匀后置于-20℃30min～1h；

④12000rmp，离心10min，弃上清；

⑤向离心管中加入75％乙醇(预冷的)洗涤DNA沉淀2次，再用无水乙醇洗1次，放在超净工作台上吹干；

⑥加入50μL TE(或ddH₂O)溶解，作为冬瓜子叶基因组DNA备用。

(2)以冬瓜子叶基因组DNA为模板，采用实施例1中设计出的引物SSR327进行PCR扩增。

PCR体系(20μL)

PCR扩增的程序为：95℃预变性3min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环后，72℃终延伸7min，置于4℃保存。

(3)对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测

①将PCR产物加入4μL 6×Loading buffer，甩下后涡旋混匀；

②取2μL扩增产物用8％(质量百分比)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180V稳压60min；

③将PAGE胶拆下，先用蒸馏水洗一遍，再用0.1％AgNO₃溶液染色10min；

④用蒸馏水洗2遍，再用2％NaOH、0.04％Na₂CO₃、0.4％甲醛显色10min，显色后用自来水洗两遍，然后在灯箱上拍照分析。

(4)扩增结果

引物SSR327在铁柱冬瓜杂交种中扩增出184bp和199bp两条带，在父本B96扩增出199bp的条带，母本B96扩增出184bp的条带(见图1)。

回收特异条带，送生工公司测序。结果表明铁柱冬瓜杂交种中分别扩增出184bp、199bp条带，与母本、父本扩增产物的序列相符。

实施例3

采用实施例2的方法对广东遂溪种植的铁柱冬瓜杂交种进行田间种植和取样，样品共计57株，对其单株编号，提取单株DNA进行检测(见图2，图3)；同时利用形态检测法进行纯度鉴定。检测结果：杂交种子54株，母本3株，种子纯度为95％，与田间检测结果一致。

实施例4

采用实施例2的方法对广东清远种植的铁柱冬瓜杂交种进行田间种植和取样，样品共计159株，对其单株编号，提取单株DNA进行检测(见图4-图7)；同时利用形态检测法进行纯度鉴定。检测结果：杂交种子139株，母本20株，种子纯度为87.42％，与田间检测结果一致。

以上实施例表明，本发明的方法可将铁柱冬瓜种子与其亲本种子进行有效区分，准确并快速检测出种子纯度。

以上列举具体实施例对本发明进行补充说明，需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 一种用于铁柱冬瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物及鉴定方法

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<221> 上游引物SSR327-F

<400> 1

AAACAACACC GTTTCTTCCG 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<221> 下游引物SSR327-R

<400> 2

TCAGCGACAT CAGAAACACC 20

<210> 3

<211> 184

<212> DNA

<221> 铁柱冬瓜母本特异性标记SSR327184

TCAGCGACAT CAGAAACACC TTTACTACAG TAGTGTCCCA TGGAGGAAGA GTTAAGGTGG 60

AAGTTGCAAG ATCAGAGAAT GGGGAAGAAG AAGAAGAAGA AAGAGGAGAA GGTAGGCGTT 120

GAAAATGAAG GTTGGAAAGT GGGAGGGAGA AAGAAGGCAG TAATCGGAAG AAACGGTGTT 180

GTTT 184

<210> 4

<211> 199

<212> DNA

<221> 铁柱冬瓜父本特异性标记SSR3271994

TCAGCGACAT CAGAAACACC TTTACTATAG TAGTGTCCCA TGGAGGAAGA GTTAAGGTGG 60

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