修饰的肝炎转录后调节元件的制作方法
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本公开涉及表达重组分子的方法和用于这类方法的多核苷酸。具体地，本公开涉及含有转录后调节元件(pre)的多核苷酸，其增强与其可操作连接的重组分子的表达，如顺式作用转录后调节元件及其修饰变体。修饰的转录后调节元件包括衍生自肝炎病毒的那些，如土拨鼠肝炎病毒(whv)，包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)的修饰变体。修饰的pre一般包括一个或多个修饰，其降低了导入对象用于表达重组分子之后肿瘤发生和/或免疫原性的潜力，例如，通过防止某些蛋白质的表达。在一些实施方式中，这类修饰包括在编码病毒x蛋白质或其部分内的序列内的一个或多个终止密码子。在一些实施方式中，多核苷酸包括编码促翻译后修饰，如降解的位点，例如，泛素化位点的一个或多个序列。
背景
病毒载体可提供用于将遗传物质转移到细胞中的有效递送系统。许多病毒载体，如γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体内的核酸可整合到宿主细胞的基因组中。顺式作用元件，如病毒转录后调节元件(pre)，包括肝炎病毒pre及其变体，已经用于病毒载体中以增强基因表达。可获得含有这类元件的核酸、表达盒和载体。需要改善的含pre核酸、盒和载体。提供了满足上述需求的实施方式。
概述
提供了含有修饰的转录后调节元件(pre)的多核苷酸，该元件含有变体x基因，其包括终止密码子和/或翻译后降解序列，其不存在于未修饰的或野生型肝炎病毒x基因，如不存在于来自野生型哺乳动物肝炎病毒，如whv或hbv的x基因。提供的多核苷酸中是含有修饰的wpre的那些，其含有包括在未修饰或野生型whvx基因中不存在的终止密码子和/或翻译后降解序列的变体x基因。提供的多核苷酸包括含有这类修饰的pre的表达盒和病毒载体。在具体实施方式中，修饰的pre可操作地连接至编码重组蛋白质，例如异源蛋白质的核酸。
提供了含有修饰的pre的多核苷酸，其包括野生型肝炎病毒x基因的变体，其中变体x基因含有不存在于野生型x基因中的终止密码子，如至少一个终止密码子。在一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体x基因中存在的多个终止密码子的每个或第一终止密码子，在对应于野生型x蛋白质开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的36或24个核苷酸内的位置处开始。在一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体x基因中存在的多个终止密码子中的一个或多个或者第一终止密码子，对应于seqidno:1或seqidno:125所示的whvpre序列的残基411和/或seqidno:2所示的序列的残基1503的位置的3’方向上的36或24个核苷酸内的位置处开始。在一些这类实施方式中，变体x基因不含长度超过或约39个核苷酸或长度超过或约27个核苷酸的开放阅读框。
提供了含有修饰的pre的多核苷酸，其包括野生型肝炎病毒x基因的变体，其中变体x基因含有不存在于野生型x基因中的终止密码子，如至少一个终止密码子，并且在x基因的起始密码子的32或30个核苷酸内的位置处开始。在一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体x基因中存在的多个终止密码子的一个或多个或者第一终止密码子，在对应于野生型x蛋白质开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的32或30个核苷酸内的位置处开始。在一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体x基因中存在的多个终止密码子中的一个或多个或者第一终止密码子，对应于seqidno:1或seqidno:125所示的whvpre序列的残基411和/或seqidno:2所示的序列的残基1503的位置的3’方向上的32或30个核苷酸内的位置处开始。在一些这类实施方式中，变体x基因具有长度小于或等于33个核苷酸的开放阅读框。
在这类修饰的pre的实施方式的任一个中，不存在于野生型x基因的至少一个终止密码子包括多个终止密码子。提供了含有修饰的pre的多核苷酸，其含有野生型肝炎病毒x基因的变体，其中变体x基因含有不存在于野生型x基因中的多个终止密码子。在这类实施方式中的任一个中，修饰的pre含有2、3、4、5或6个终止密码子。在一些实施方式中，多个终止密码子包含在存在于变体x基因的各阅读框中的至少一个终止密码子。在一些实施方式中，多个终止密码子包含在相同阅读框中的至少2个终止密码子。
在含有多个终止密码子的修饰的pre的这类实施方式中的每一个中，多个终止密码子中的一个或多个或者多个终止密码子中的第一终止密码子在对应于野生型x蛋白质开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的36、30或24个核苷酸内的位置处。在含有多个终止密码子的修饰的pre的一些实施方式中，多个终止密码子中的一个或多个或者多个终止密码子中的第一终止密码子，在对应于seqidno:1或seqidno:125所示的whv转录后调节元件(wpre)序列的残基411和/或seqidno:2所示的whv序列的残基1503的位置处的3’方向上的36、30或24个核苷酸内的位置处开始。在一些这类实施方式中，变体x基因不含长度超过或约39个核苷酸，长度超过或约30个核苷酸，或长度超过或约27个核苷酸的开放阅读框。
在这类实施方式的任一个中，提供的多核苷酸也可包含编码重组蛋白质的核酸。在具体实施方式中，修饰的pre可操作地连接至编码重组蛋白质的核酸。
在提供的多核苷酸中任一个的一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体x基因中存在的多个终止密码子的一个或多个或者第一终止密码子，在对应于野生型x蛋白质开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的至少或等于9、12、15、18或21个核苷酸内的位置处开始。在提供的多核苷酸中任一个的一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体x基因中存在的多个终止密码子中的一个或多个或者第一终止密码子，对应于seqidno:1或seqidno:125所示的whvpre序列的残基411和/或seqidno:2所示的序列的残基1503的位置处的3’方向上的至少或等于9、12、15、18、21个核苷酸内的位置的开始。在一些实施方式中，修饰的pre含有至少一个终止密码子，如1、2、3、4或5个终止密码子，其中多个中的一个或多个终止密码子在对应于seqidno:1或125所示的序列的位置420、423、426、429或432的核苷酸位置处或至少内或内的位置处开始。在一些这类实施方式中，变体x基因不含长度超过或约24个核苷酸，长度超过或约21个核苷酸，长度超过或约18个核苷酸，长度超过或约15个核苷酸，或长度超过或约12个核苷酸的开放阅读框。
在提供的多核苷酸中任一个的一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体x基因中存在的多个终止密码子的一个或多个或者第一终止密码子，在对应于野生型x蛋白质开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的至少或等于9、13、17或21个核苷酸内的位置处开始。在提供的多核苷酸中任一个的一些实施方式中，至少一个终止密码子，例如，在变体x基因中存在的多个终止密码子中的一个或多个或者第一终止密码子，对应于seqidno:1或seqidno:125所示的whvpre序列的残基411和/或seqidno:2所示的序列的残基1503的位置处的3’方向上的至少或等于9、13、17、或21个核苷酸内的位置的开始。在一些实施方式中，修饰的pre含有至少一个终止密码子，如1、2、3或4个终止密码子，其中多个终止密码子中的一个或多个在对应于seqidno:1或seqidno:125所示的序列的位置420、424、428或432的核苷酸位置处或至少内或内的位置处开始。在一些这类实施方式中，变体x基因不含长度超过或约24个核苷酸，长度超过或约21个核苷酸，长度超过或约16个核苷酸，或长度超过或约12个核苷酸的开放阅读框。
在一些实施方式中，未修饰或野生型x基因包含seqidno:221所示核苷酸的序列，并且变体x基因含有至少一个终止密码子，如其中引入的1、2、3、4或5个终止密码子。在一些实施方式中，引入多个终止密码子，其中至少一个终止密码子在其中的各阅读框中引入。在一些实施方式中，引入多个终止密码子，其中至少2个终止密码子在其中存在的相同阅读框中引入。在一些实施方式中，修饰的pre含有变体x基因，其含有至少一个终止密码子，如1、2、3或4个终止密码子，其中一个或多个在对应于seqidno:221所示的atg起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的位置9、13、17或21处或至少内或内的位置处开始。在一些实施方式中，修饰的pre含有变体x基因，其包含seqidno:28所示核苷酸的序列。
在任意提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre含有对应于seqidno:1或seqidno:125的核苷酸残基448-470的β茎环。在任意提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre在对应于seqidno:1或seqidno:125的核苷酸448-470的β茎环内的位置中不含核苷酸变化。在任意提供的多核苷酸的一些实施方式中，一个或多个终止密码子在对应于seqidno:1或seqidno:125的核苷酸位置448-470中的一个或多个的β茎环内的位置中不含核苷酸。
在任何这样的实施方式中，修饰的pre含有终止密码子，其选自以下中：从对应于野生型x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的变体x基因中的3'方向的位置9开始和/或在对应于seqidno：1或seqidno：125所示序列中的位置420的核苷酸位置的终止密码子型；从对应于野生型x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的变体x基因中的3'方向的位置13开始和/或在对应于seqidno：1或seqidno：125所示序列中的位置424的核苷酸位置的终止密码子型；从对应于野生型x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的变体x基因中的3'方向的位置17开始和/或在对应于seqidno：1或seqidno：125所示序列中的位置428的核苷酸位置的终止密码子型；和/或从对应于野生型x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的变体x基因中的3'方向的位置21开始和/或在对应于seqidno：1或seqidno：125所示序列中的位置432的核苷酸位置的终止密码子型。
在任何这样的实施方式中，终止密码子可以是琥珀(tag)、赭石(taa)或乳白(tga)终止密码子。在一些实施方式中，终止密码子可以是琥珀(tag)或乳白(tga)终止密码子。在任何这样的实施方式中，通过核苷酸取代、缺失或插入引入终止密码子，例如多个终止密码子中的每一个。
在任何这样的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre中的变体x基因的长度不超过180个核苷酸或长度不超过或约210个核苷酸。在任何这样的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因长度为至少或约90个核苷酸或长度为至少约120个核苷酸或长度为至少或约180个核苷酸。
在任何这样的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因可以是野生型或未修饰的哺乳动物肝炎x基因或其部分或截短部分的变体。在一些实施方式中，野生型或未修饰的x基因可以包括编码截短的x蛋白的部分x基因，例如存在于野生型或未修饰的pre中。在一些实施方式中，野生型或未修饰的哺乳动物肝炎x基因或部分x基因是或源自野生型土拨鼠肝炎病毒(whv)x基因。在一些实施方式中，野生型或未经修饰的whvx基因含有seqidno：9的核苷酸序列或是其部分x基因。在一些实施方式中，野生型或未修饰的whvx基因含有seqidno：1和12-20中任一个的核苷酸411-592或seqidno：125的核苷酸411-589所示的核苷酸序列。
在任何这样的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre可以包含野生型肝炎病毒pre的至少两个或至少三个顺式作用的转录后调控子元件或其功能变体。在一些这样的实施方式中，至少两个或至少三个子元件包含野生型preα子元件或其功能变体，野生型preβ子元件的功能变体，和/或野生型preγ子元件或其功能变体。在一些实施方式中，修饰的pre包含野生型肝炎病毒pre的α子元件或其功能变体和野生型preβ子元件的功能变体。在任何这样的实施方式中，α子元件可以包含seqidno：3、seqidno：4或seqidno：5的序列或其变体，β子元件可以包含seqidno：6或seqidno：7的序列的变体，和/或γ子元件可以包含seqidno：8的序列或其变体。
在任何这样的多核苷酸的一些实施方式中，野生型或未修饰的肝炎病毒pre可以是野生型哺乳动物肝炎pre。在一些实施方式中，野生型或未修饰的哺乳动物肝炎病毒pre含有seqidno：1和12-27中任一个所示的核苷酸序列，或其表现出转录后活性的功能部分。在一些情况下，可以删除或去除一个或多个n-或c-末端氨基酸残基，而对pre的活性没有实质影响。在一些实施方式中，野生型或未修饰的肝炎病毒pre具有seqidno：125所示的序列。在一些实施方式中，野生型哺乳动物肝炎pre是野生型土拨鼠肝炎病毒pre(wpre)。
在所提供的多核苷酸的任何这样的实施方式中，修饰的pre可以参考包含seqidno：1或seqidno：125所示的核苷酸序列的野生型或未修饰的肝炎pre，与seqidno：1或seqidno：125具有至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的核苷酸序列，或其表现出转录后活性的功能活性部分进行修饰，只要变体x基因含有至少一个相对应的野生型肝炎pre中不存在的终止密码子即可。
在所提供的多核苷酸的任何这样的实施方式中，野生型或未修饰的肝炎pre可以含有seqidno：1、12-20或125中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，野生型或未经修饰的肝炎pre可以含有seqidno：1的核苷酸序列。在一些实施方式中，野生型或未经修饰的肝炎pre可以含有seqidno：125的核苷酸序列。
在任何多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因可包含起始密码子，起始密码子从对应于seqidno：1或seqidno：125的位置411的位置开始。在一些实施方式中，起始密码子是atg起始密码子。
在任何多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因可进一步含有与变体x基因可操作地连接的启动子。在一些实施方式中，启动子是包含seqidno：11所示序列或野生型whvx基因启动子序列的野生型x基因启动子。
在任何多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre可以选自：a)修饰的pre，其包含显示与seqidno：1或seqidno：125至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的核苷酸序列，其中修饰的pre含有具有至少一个seqidno：1或seqidno：125中不存在的终止密码子的变体x基因；或b)修饰的pre，其包含a)的核苷酸序列的一部分，其中该部分含有包含至少一个终止密码子的变体x基因，并且该部分表现出转录后活性。在一些实施方式中，变体x基因含有至少2个终止密码子、至少3个终止密码子或至少4个终止密码子。在一些实施方式中，变体x基因包含存在于所述变体x基因中的每个阅读框中的终止密码子。
在一些实施方式中，变体x基因包含seqidno：44-58或141-155中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，修饰的pre包含seqidno：29-43或126-140中任一个所示的核苷酸序列。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre除了至少一种在野生型或未修饰的pre中不存在(例如seqidno：1或seqidno：125中不存在)的终止密码子之外不含任何修饰。在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，与野生型或未修饰的pre的序列相比，例如与seqidno：1或seqidno：125相比，修饰的pre除了与所述至少一个终止密码子以外还含有其他修饰。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，与野生型肝炎病毒x基因起始密码子相比，变体x基因还含有包含一个或多个核苷酸差异的变体起始密码子。在一些实施方式中，与对应于seqidno：1或seqidno：125的核苷酸位置411-413的起始密码子相比，变体起始密码子含有一个或多个核苷酸差异。在一些这样的实施方式中，一个或多个差异导致限制或阻止从所述起始密码子的翻译起始。在一些这样的实施方式中，变体x基因包含seqidno：74-88或171-185中任一个所示的核苷酸序列和/或修饰的pre包含seqidno：59-73或156-170中任一个所示的核苷酸序列。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因含有与变体x基因可操作地连接的变体启动子，其中与野生型肝炎病毒x基因启动子相比，变体启动子包含一个或多个核苷酸差异。在一些实施方式中，与seqidno：11所示的启动子相比，变体启动子含有一个或多个核苷酸差异。在一些实施方式中，所述一个或多个差异导致限制或防止从所述启动子的转录。在一些这样的实施方式中，修饰的pre包含seqidno：89-118或186-215中任一个所示的核苷酸序列。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，在将多核苷酸引入真核细胞中时，不产生长度大于12、11、10、9或8个氨基酸的由所述变体x基因编码的多肽。在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，多核苷酸不能产生长度大于12、11、10、9或8个氨基酸的由所述变体x基因编码的多肽。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre编码促进核rna输出和/或增加mrna稳定性的rna。在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre编码促进核rna输出和/或增加mrna稳定性的rna多核苷酸，其中所述促进核rna输出和/或mrna稳定性增加重组蛋白的表达。在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre保留了对应的野生型或未修饰的肝炎pre和/或seqidno：1、seqidno：125、seqidno：119、seqidno：120和/或seqidno：216所示的pre的转录后活性。在一些这样的实施方式中，修饰的pre显示了对应的野生型或未修饰的肝炎pre和/或seqidno：1、seqidno：125、seqidno：119、seqidno：120和/或seqidno：216所示的pre的转录后活性的至少75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％或130％。在一些实施方式中，修饰的pre的转录后活性可以通过监测编码重组蛋白的可操作地连接的核酸的基因表达来评估。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因还包含编码野生型肝炎病毒x基因中不存在的翻译后修饰信号的序列。
还提供了含有修饰的pre的多核苷酸，其包括野生型或未修饰的肝炎病毒x基因的变体，其中变体x基因含有编码不存在于野生型或未修饰的肝炎病毒x基因中的翻译后修饰信号的序列。在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，翻译后修饰信号含有泛素化位点。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，翻译后修饰信号含有从位于变体x基因中对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置的3'方向的至少2、3、4、5或6个核苷酸内或之内的位置开始的第一密码子，其中第一密码子编码甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、或亮氨酸残基，根据n端规则；以及任选的从对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的变体x基因中的位置的3'方向的至少2、3、4、5或6个核苷酸内或之内的位置开始的第二密码子，其中第二密码子编码谷氨酸或天冬酰胺残基，根据n端规则。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，翻译后修饰信号含有一个或多个pest序列。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，多核苷酸含有编码与修饰的pre可操作地连接的重组蛋白的核酸和含有编码未存在于野生型或未修饰的肝炎病毒x基因的翻译后修饰信号的序列的变体x基因。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因含有编码翻译后修饰信号的序列，其含有对应于seqidno：1或seqidno：125的核苷酸残基448-470的β茎环。在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因含有编码翻译后修饰信号的序列，其不包含对应于seqidno：1或seqidno：125的核苷酸448-470的β茎环内的位置的核苷酸变化。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因的长度不超过180个核苷酸或长度不超过或约210个核苷酸。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因长度为至少或约90个核苷酸或长度为至少约120个核苷酸或长度为至少或约180个核苷酸。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因是野生型或未修饰的哺乳动物肝炎x基因或其部分或截短部分的变体。在一些实施方式中，野生型或未修饰的x基因可以包括编码截短的x蛋白的部分x基因，例如存在于野生型或未修饰的pre中。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，野生型或未修饰的哺乳动物肝炎x基因或部分x基因是或源自野生型土拨鼠肝炎病毒(whv)x基因。在一些实施方式中，野生型或未修饰的whvx基因含有seqidno：9的核苷酸序列，seqidno：2的核苷酸1503-1928所示的核苷酸序列或是其部分x基因。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，野生型或未修饰的whvx基因含有seqidno：1和12-20中任一个的核苷酸411-592或seqidno：125的核苷酸411-589所示的核苷酸序列。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre包含野生型肝炎病毒pre的至少两个或至少三个顺式作用的转录后调控子元件或其功能变体。在任何提供的多核苷酸的一些这样的实施方式中，至少两个或至少三个子元件包含野生型preα子元件或其功能变体，野生型preβ子元件的功能变体，和/或野生型preγ子元件或其功能变体。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre包含野生型肝炎病毒pre的α子元件或其功能变体和野生型preβ子元件的功能变体。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，α子元件包含seqidno：3、seqidno：4或seqidno：5的序列或其变体，β子元件包含seqidno：6或seqidno：7的序列的变体，和/或γ子元件包含seqidno：8的序列或其变体。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，野生型或未修饰的肝炎病毒pre是野生型哺乳动物肝炎pre。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，野生型或未修饰的哺乳动物肝炎病毒pre含有seqidno：1、12-27或125中任一个所示的核苷酸序列。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，野生型哺乳动物肝炎pre是野生型土拨鼠肝炎病毒pre(wpre)。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre选自：a)修饰的pre，其包含野生型或未修饰的肝炎pre的变体x基因，野生型或未修饰的肝炎pre，其含有seqidno：1或seqidno：125所示或显示与seqidno：1或seqidno：125至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的核苷酸序列，其中变体x基因含有编码不存在于野生型或未修饰的肝炎病毒x基因中的翻译后修饰信号的序列；和b)包含a)的核苷酸序列的一部分的修饰的pre，所述部分包含含有编码翻译后修饰信号的序列的变体x基因，其中所述部分显示转录后活性。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因含有起始密码子，起始密码子从对应于seqidno：1或seqidno：125的位置411的位置开始。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，起始密码子是atg起始密码子。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因含有与所述变体x基因可操作地连接的启动子。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，启动子是含有seqidno：11所示序列或野生型whvx基因启动子序列的野生型x基因启动子。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre选自：a)修饰的pre，其包含显示与seqidno：1或seqidno：125至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的核苷酸序列，其中修饰的pre含有具有编码seqidno：1或seqidno：125中不存在的翻译后修饰信号的序列的变体x基因；和b)修饰的pre，其含有a)的核苷酸序列的一部分，该部分含有编码翻译后修饰的序列的变体x基因，其中该部分表现出转录后活性。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体x基因含有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸变化。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre除了编码翻译后修饰信号的序列之外不含任何修饰。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre除了编码未存在于野生型或未修饰的肝炎病毒x基因中的翻译后修饰信号的序列之外还含有其他修饰。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，其他修饰在变体x基因中。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，其他修饰导致编码非活性x蛋白和/或截短的x蛋白的变体x基因。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre编码促进核rna输出和/或增加mrna稳定性的rna。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，促进核rna输出和/或mrna稳定性增加重组蛋白的表达。
在任何所提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的pre保留了对应的野生型或未修饰的肝炎pre和/或seqidno：1、seqidno：119、seqidno：120、seqidno：125、或seqidno：216所示的pre的转录后活性。在一些这样的实施方式中，修饰的pre显示了对应的野生型或未修饰的肝炎pre和/或seqidno：1、seqidno：125、seqidno：119、seqidno：120和/或seqidno：216所示的pre的转录后活性的至少75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％或130％。在一些实施方式中，修饰的pre的转录后活性可以通过监测编码重组蛋白的可操作地连接的核酸的基因表达来评估。
在一些实施方式中，提供的多核苷酸中的任何一个还可以包含含有变体flap的病毒核酸，其中所述变体flap含有对应于野生型或未修饰flap序列的中心聚嘌呤区(cppt)和/或中心终止序列(cts)区域的全部或部分核苷酸缺失。在这样的实施方式中，多核苷酸含有修饰的pre和变体flap。在一些实施方式中，与不存在这些元件相比，这样的元件可操作地连接到编码重组蛋白的核酸和/或导致编码重组蛋白的异源核酸的基因转移效率的提高。
还提供了含有变体flap的多核苷酸，其中所述变体flap含有对应于野生型或未修饰flap序列的中心聚嘌呤区(cppt)和/或中心终止序列(cts)区域的全部或部分核苷酸缺失。在一些实施方式中，含有变体flap的多核苷酸还可含有编码重组蛋白的核酸。在一些实施方式中，虽然参与形成flap结构的cppt和cts的全部或部分缺失，含有变体flap的多核苷酸的存在但仍能够成功地转导或转移到具有编码重组蛋白的核酸的细胞中。
在含有变体flap的任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体flap含有对应于cppt和cts的核苷酸的全部或部分缺失。在一些实施方式中，对应于cppt的所有核苷酸残基和对应于cts的所有核苷酸残基都缺失，和/或变体flap不含有对应于cppt的核苷酸残基或对应于cts的核苷酸残基。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体flap含有对应于seqidno：123所示的cppt区域中的核苷酸的全部或连续部分核苷酸的缺失。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体flap含有对应于seqidno：124所示的cts区域中的核苷酸的全部或连续部分核苷酸的缺失。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，变体flap含有对应于seqidno：123所示的cppt区域中的核苷酸的全部或连续部分核苷酸的缺失和对应于seqidno：124所示的cts区域中的核苷酸的全部或连续部分的核苷酸的缺失。
在含有变体flap的多核苷酸的任何这样的实施方式中，与含有野生型或未修饰的flap的序列相比，变体flap被修饰或包括修饰。在一些实施方式中，野生型或未修饰的flap序列含有约80至200个连续核苷酸，其包括逆转录病毒，任选地是慢病毒的cppt或cts区。在一些实施方式中，逆转录病毒是慢病毒。在一些实施方式中，慢病毒是hiv-1。在一些实施方式中，野生型或未修饰的flap含有a)seqidno：121所示的核苷酸序列；b)与含有cppt和cts区域的seqidno：121所示的核苷酸序列具有至少85％、86％、87％、88％，89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的核苷酸序列；或c)a)或b)的连续部分，其包括cppt和cts区域。
在一些实施方式中，含有变体flap的病毒核酸是或包含显示与seqidno：121至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％或95％的序列相同性的核苷酸序列，所述变体flap缺少全部或部分cppt和cts区域。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，病毒核酸是或含有seqidno：122所示的序列。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，所述多核苷酸含有a)变体flap，其是或包含seqidno：122的序列或具有与seqidno：122至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的序列，所述变体flap缺少相应野生型或未修饰的flap的全部或部分cppt和cts区域或seqidno：121所示的序列；和b)修饰的pre，其是或包含seqidno：29或126的序列或具有与seqidno：29或126至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的序列，所述修饰的pre在修饰的pre的变体x基因中含有至少一个终止密码子，其不存在于野生型或未修饰的x基因中或不存在于含有x基因的野生型或未修饰的pre中，例如不存在于seqidno：1或seqidno：125中。
在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，修饰的wpre和/或变体flap与编码重组蛋白的核苷酸可操作地连接，所述重组蛋白是或含有重组受体。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，重组受体是抗原受体和/或嵌合受体。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，重组受体是功能性非tcr抗原受体或转基因tcr。在任何提供的多核苷酸的一些实施方式中，重组受体是嵌合受体(car)。
在一些实施方式中，还提供了包含任何提供的多核苷酸和与编码重组蛋白的核酸可操作地连接的启动子的表达盒。在一些实施方式中，还提供含有任何提供的多核苷酸或表达盒的载体。在任何提供的载体的一些实施方式中，载体是病毒载体。在任何提供的载体的一些实施方式中，载体是逆转录病毒载体。在任何提供的载体的一些实施方式中，载体是慢病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体是衍生自hiv-1的慢病毒载体。
在一些实施方式中，还提供含有任何提供的多核苷酸、表达盒或任何提供的载体的细胞。在任何提供的细胞的一些实施方式中，细胞是t细胞、自然杀伤(nk)细胞、ips细胞或ips衍生的细胞。
在一些实施方式中，还提供了含有任何提供的载体的病毒颗粒。
在一些实施方式中，还提供了包括将任何提供的多核苷酸、表达盒、载体或病毒颗粒引入细胞的方法，在一定情况下使得在细胞中实现重组蛋白质的表达。在任何提供的方法的一些实施方式中，引入通过用载体或病毒颗粒转导细胞来实现。在一些实施方式中，引入通过用载体转染细胞来实现；和/或引入通过用载体电穿孔细胞来实现。在任何提供的方法的一些实施方式中，重组蛋白的表达水平与通过在不存在修饰的pre或不含修饰的pre或pre的相应载体引入载体而实现的水平相比增加。
还提供了通过任何提供的方法产生的一种或多种细胞。
还提供了含有任何提供的实施方式的细胞和药学上有效的运载体的药物组合物。
还提供了包括向具有疾病或病症的对象给予任何提供的多核苷酸、载体、病毒颗粒、细胞或药物组合物的治疗方法。
在任何提供的治疗方法的一些实施方式中，该方法导致由多核苷酸编码的重组蛋白的表达。在一些实施方式中，重组蛋白包含与由疾病或病症或其细胞或组织表达的配体特异性结合的重组受体。在任何提供的方法的一些实施方式中，受体是抗原受体，并且配体是对疾病或病症特异的和/或与之相关的抗原。在任何提供的方法的一些实施方式中，疾病或病症是癌症，自身免疫性疾病或感染性疾病。
附图的简要说明
图1描述了seqidno：1所示的示例性wpre的核酸序列。对应于报告的pre子元件的核酸(donello等，(1998)j.virol.,72:5085；smith等，(1998)nucleicacidsresearch,26:4818)如下表示：γ子元件、α子元件和β子元件用实线表示，箭头表示开始和结束位置；分别对应于α和β子元件的示例性茎环形成部分的核苷酸用虚线和斜体表示；对应于whx蛋白启动子的核苷酸用虚线和点划线表示，并用斜体表示；并且对应于本示例性wpre中包含的截短x基因的核苷酸用下划线表示。应当理解，其元件的描述是理论上或经验上衍生的。因此，确切的位点可以变化(例如更长或更短)，并且相应的元件对于每个pre不必相同，例如对于每个物种或亚种的pre。
图2a-2e描绘了seqidno：1所示的wpre序列与其他示例性肝炎pre的示例性比对，并鉴定了相应的残基。两个对齐的核苷酸之间的符号“|”表示对齐的核苷酸是相同的。两个对齐的核苷酸之间没有“|”表示对齐的核苷酸是不同的。符号“-”表示比对中的缺口。对应于x基因起始密码子的示例性非限制性位置用粗体和斜体表示。对应于可以引入终止密码子的位置的x基因内的示例性，非限制性位置是加框的。这样的位置对应于用于定位引入的终止密码子的示例性起始残基(例如，终止密码子的3’位置)。例如，图2a描述了seqidno：1所示的示例性wpre序列与对应于seqidno：12所示的示例性wpre序列的核酸的比对。图2b描述了seqidno：1所示的示例性wpre序列与对应于seqidno：13所示的示例性wpre序列的核酸的比对。图2c描述了seqidno：1所示的示例性wpre序列与对应于seqidno：119所示的示例性wpre序列的核酸的比对。图2d描述了seqidno：1所示的示例性wpre序列与对应于seqidno：27所示的示例性地松鼠乙型肝炎病毒pre序列的核酸的比对。图2e描述了seqidno：1所示的示例性wpre序列与对应于seqidno：21所示的示例性人乙型肝炎病毒(hbv)pre序列的核酸的比对。
具体实施方式
i.含有修饰的转录后调节元件(pre)的多核苷酸和病毒载体
提供了可用于增强重组分子(例如重组蛋白)表达的多核苷酸。多核苷酸含有修饰的转录后调控元件(修饰的pre)，例如顺式作用的转录后调控元件，包括病毒转录后调控元件的修饰形式，例如源自肝炎病毒的pre的修饰形式，如土拨鼠肝炎病毒(whv)和乙型肝炎病毒(hbv)。
在一些实施方式中，修饰的pre包括野生型whv转录后调控元件(wpre)的修饰版本或hbv转录后调节元件(hbvpre)的修饰版本，包括具有降低蛋白质或多肽，特别是对宿主对象具有致癌性或免疫原性潜力的修饰的那些，将由pre内的编码序列表达，和/或如果产生的话，将保留这些蛋白质。通常，野生型pre的序列含有编码编码截短的x蛋白的部分x基因的开放阅读框(orf)，其在一些情况下当表达时可能参与肿瘤发生。此外，由于pre通常用于增强来自表达载体的转基因表达，所以含有pre的载体的递送还可能导致截短的x蛋白的外源表达，当给予对象时其可能产生免疫原性。
提供的修饰的pre包括变体x基因，与未修饰或野生型肝炎病毒x基因相比，变体x基因包括一个或多个核苷酸修饰。这样的修饰通常降低了在将含有与编码重组分子的核酸可操作地连接的这种修饰的pre的多核苷酸(例如，病毒载体)导入对象用于表达重组分子的时致癌性和/或免疫原性的可能性，例如通过防止由pre编码的某些蛋白质的表达。例如，修饰通常包括旨在防止或降低来自修饰的pre的变体x基因的多肽表达的可能性的修饰。修饰使得修饰的pre保留至少一些转录后调节活性，例如相应野生型pre的全部或部分转录后调节活性。在一些实施方式中，保留转录后调节活性的至少或至少约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
尽管病毒载体可以提供用于将遗传物质引入细胞的高效系统，但是使用某些病毒载体可能不总是产生这种遗传物质的所需表达水平。使用内含子的插入用于增强某些情况中的表达，但在某些病毒载体中可能并不总是合适的。已经使用肝炎转录后调控元件(hpre)，如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)来增强基因表达。
包括wpre和hbvpre在内的肝炎病毒来源的pre通常通过促进转录后rna从细胞核中的输出来促进，例如，增强与其可操作地连接的转基因的表达。由顺式作用序列或包含在pre内的元件形成的二级和三级结构可以促进这种功能。例如，野生型肝炎病毒衍生的pre通常包括α子元件和β子元件，其各自独立地形成茎环结构，其影响和/或参与完全pre转录后活性(smith等，(1998)nucleicacidsresearch,26:4818-4827)。一些野生型非人类肝炎病毒pre，如wpre，还包括可以进一步增强转录后活性的γ子元件。这样的子元件可以具有或编码具有促进rna从核输出的结构的rna，例如，通过与crm1依赖和/或独立的输出机制的相互作用，提供细胞蛋白质的结合位点，增加rna的总量，例如，重组和/或异源rna，转录物，增加rna稳定性，增加聚腺苷酸化转录物的数量和/或增加这些转录物中聚腺苷酸化尾的大小。
除了通过这些顺式作用序列提供表达增强功能之外，包括哺乳动物肝炎病毒来源的pre(如hbvpre或wpre)的野生型和未修饰的肝炎病毒pre含有一部分病毒x基因，包括至少编码至少一个截短的x蛋白的部分开放阅读框。该区域通常与顺式作用的调节子元件至少部分重叠。然而，当包含在载体中用于在对象中的基因表达时，x蛋白-甚至某些截短的x蛋白-可以表现出致癌潜力。在pre的x基因区域中产生的突变，例如，在起始位点和/或启动子区域，在解决这些问题时不一定是完全令人满意的。例如，甚至活性降低的突变启动子也可能允许pre的x蛋白或由该区域编码的其他多肽的某种程度的表达。在x基因的一个或多个位置上的反转或进一步突变可以恢复或增加x蛋白的表达水平，促进致癌性。即使除了致癌潜能之外，从x蛋白或其他在该区域内或与启动子可操作地连接的阅读框表达任何多肽，特别是至少一定长度(例如，长度为至少8、9、10、11或12个氨基酸或更多)的多肽的风险可能在给予对象时促进免疫原性。提供了解决这些问题的具有修饰的pre的核酸。
通常，pre的x区域包括编码小于全长型肝炎x蛋白的截短的x蛋白的部分阅读框，例如长度小于141个氨基酸，例如小于130个核苷酸，小于120个氨基酸，小于110个核苷酸，小于100个核苷酸，小于90个核苷酸，小于80个核苷酸，少于70个核苷酸，并且一般长度小于60、50、40、30、20、10个或更少核苷酸。如图1所示的示例性野生型wpre中所示的，x启动子和部分阅读框与α和β顺式作用序列重叠。这种部分开放阅读框的翻译可以产生编码的截短的x蛋白，其可能在引入对象后具有促进肿瘤发生和/或免疫原性反应的潜力。
例如，参照seqidno：1所示的示例性wpre(对应于seqidno：2的核苷酸1093-1684或genbank登录号j04514.1)，核苷酸411-592对应于部分x蛋白开放阅读框，其可操作地受控于核苷酸391-410所示的x启动子。从x启动子启动的转录物的翻译编码截短的x蛋白。虽然在pre中通常不完全表示，但相应的示例性全长x蛋白开放阅读框是425个碱基对，并且对应于在seqidno：2中所示的示例性肝炎病毒序列的核苷酸1503-1928，其可操作地受控于对应于核苷酸1483-1502的x启动子。其他野生型或未修饰的哺乳动物肝炎病毒pre也可以含有部分x蛋白开放阅读框。示例性未修饰的或野生型的哺乳动物肝炎病毒pre以及相应的部分x蛋白开放阅读框列于表1中。任何pre，例如任何哺乳动物pre中的残基，其对应于seqidno：1或seqidno：125(其含有seqidno：1的核苷酸1-589)所示的示例性wpre中的残基可以通过如图2a-2e各自所示的示例性序列的pre的全长序列的比对来鉴定。可以鉴定的相应残基的非限制性实例包括例如任何顺式作用元件或其部分(例如α、β或γ或其部分)的残基，x蛋白开放阅读框的残基，起始密码子的残基，用于引入终止密码子的残基。
在提供的修饰的pre的实施方式中，其中所含的变体x基因是未修饰的或野生型x基因的变体。未修饰的x基因可以是包括部分x基因阅读框的任何基因，例如存在于未修饰或野生型pre中的x基因开放阅读框。例如，修饰的pre的x基因的变体包括哺乳动物肝炎病毒x基因的部分，其可以含有部分x蛋白开放阅读框并编码截短的x蛋白，通常进一步修饰以包括一个或多个终止密码子或其他修饰以降低致癌性和/或免疫原性的风险。例如，变体x基因包括野生型x基因的一部分的变体。在一些实施方式中，变体x基因的长度可以包含至少180个核苷酸，但比全长肝炎病毒x基因中包含的核苷酸少，例如长度小于425个核苷酸。通常，其中含有变体x基因的修饰的pre含有足够部分的顺式调节序列(例如，α、β和/或γ子元件的一个或多个，其部分和/或功能变体)以调节rna转录物的转录后活性。
修饰的pre的变体x基因中的核苷酸修饰可以包括核苷酸缺失、插入和/或取代。这样的修饰可以包括编码病毒x蛋白或其部分的pre区域中的核苷酸变化，包括但不限于，导致终止密码子的核苷酸变化，靶向用于降解的蛋白质的序列及其组合。修饰通常使得修饰的pre保留至少一些转录后调节活性，例如相应的野生型pre或未修饰的pre(例如seqidno：1或seqidno：125)的转录后调节活性的全部或部分，或本领域已知具有足够的活性用于病毒载体转导的另一种修饰的pre，例如具有seqidno：119或seqidno：120所示的序列的pre。在一些实施方式中，修饰的pre提供在与编码重组蛋白(例如，异源蛋白)的核酸可操作地连接的表达载体(例如，病毒载体)中。在本文中，异源是指通常不由病毒表达和/或不由病毒基因组编码的蛋白质。在一些实施方式中，异源蛋白质不由pre所衍生自的肝炎病毒表达。在任何这样的实施方式中，提供的修饰的pre可以增强编码重组蛋白的核酸的表达，例如，与来自不含pre的表达载体的重组蛋白的表达相比。
在一些实施方式中，提供的修饰的pre表现出转录后活性，例如增强可操作地连接的核酸的表达，同时避免或减少在对象中引入和/或表达时肿瘤发生的可能性。例如，由pre编码的功能性全长或截短的x蛋白的不希望的表达可以促进肿瘤发生。在一些实施方式中，修饰的pre含有变体x基因，其包括防止或降低表达不想要的蛋白质(例如，病毒x蛋白或其功能部分)的可能性的修饰，从而降低肿瘤发生的风险。例如，这样的修饰可以包括在变体x基因中引入一个或多个终止密码子的核苷酸变化，例如未存在于未修饰或野生型x基因中的终止密码子，使得不需要的蛋白质，例如足以引起肿瘤发生的x蛋白或功能部分，和/或具有致癌潜力的任何肽都不表达。在其它实例中，这些修饰包括在未修饰或野生型x基因中不存在的变体x基因中引入翻译后修饰信号(例如泛素化位点)的核苷酸变化，使得编码的x蛋白被靶向用于降解。
在一些实施方式中，与未修饰的或野生型pre相比，所提供的修饰的pre还包括x基因启动子和/或起始密码子中的修饰(例如，核苷酸插入，取代或置换或缺失)。在一些实施方式中，提供的修饰的pre不包括在x基因启动子中的修饰。在一些实施方式中，提供的修饰的pre不包括在x基因起始密码子中的修饰。在一些实施方式中，提供的修饰的pre不包括x基因启动子和x基因起始密码子中的修饰。在其他实施方式中，x基因启动子和/或起始密码子是野生型的。
在一些实施方式中，存在影响由修饰的pre中的变体x基因编码的x蛋白表达的超过一个修饰。例如，在一些实施方式中，修饰的pre含有包含不存在于相应未修饰或野生型pre中的多个终止密码子，例如至少2、3、4、5、6或更多个终止密码子的变体x基因。由于存在多个核苷酸变化，例如以实现引入多个终止密码子，提供的修饰的pre可以降低由未修饰的序列(例如野生型序列)的逆转引起的x蛋白表达的可能性。在一些实施方式中，多个终止密码子可以在变体x基因的每个阅读框中包括终止密码子，和/或在单个阅读框中包括多个终止密码子，从而降低不想要的蛋白质表达的可能性。在一些实施方式中，包括至少3个终止密码子，例如，以覆盖所有三个阅读框，在一些实施例中，它们可以是顺序的。
提供的修饰的pre含有特征，其可以降低因存在于pre或其起始位点或启动子中的x基因的野生型序列的逆转和/或由于其它突变引起的其它致癌多肽的表达而导致致癌性的风险。这些特征可以提供相对于可用的修饰的转录后调控序列，例如仅在x蛋白启动子和/或起始密码子中包含修饰的那些序列(参见美国专利号7,419,829)的优势。例如，甚至突变的启动子可能不一定导致完全不存在来自启动子的蛋白质表达。通过掺入多种修饰以在变体x基因中产生多个终止密码子，在一些实施方式中，所提供的修饰的pre即使在这种泄漏启动子的情况中也可防止或降低致癌或免疫原性肽的可能性。
在一些实施方式中，提供的含有变体x基因的修饰的pre可以降低在引入对象后x蛋白免疫原性的可能性。例如，为了减少从表达的变体x蛋白产生免疫原性表位的机会，一个或多个终止密码子可以开始足够接近x蛋白开放阅读框的起始密码子，以防止含有可能诱导不想要的免疫应答的表位的表达。在一些实施方式中，这些特征确保或增加了在引入对象时，修饰的pre中的变体x基因不导致任何具有潜在免疫原性表位的多肽的表达的可能性。在一些实施方式中，含有修饰的pre的多核苷酸包括至少一个终止密码子，例如，存在于修饰的pre的变体x基因中的多个引入的终止密码子中的每一个或第一个终止密码子，从变体x基因的起始密码子(例如，该起始密码子的第一个位置)或对应于相应野生型或未修饰序列中起始密码子的密码子的至少18或21或24或27或30或33或36个核苷酸中的位置处开始。在这样的实施方式的一些实例中，这些特征确保不产生由pre编码的长度长于6或7或8或9或10或11或12个氨基酸的多肽，例如，甚至在野生型或未修饰的起始密码子或启动子或其逆转或导致功能起始密码子和/或启动子的其它突变的情况中。在一些实施方式中，含有修饰的pre的多核苷酸包括终止密码子，例如，存在于修饰的pre的变体x基因中的多个终止密码子中的每一个或第一个终止密码子，从变体x基因的起始密码子(例如，该起始密码子的第一个位置)或对应于相应野生型或未修饰序列中起始密码子的密码子的至少9、12或15个核苷酸中的位置处开始。
提供的多核苷酸包括具有修饰pre的那些，其被设计用于促进安全性优点，例如，降低致癌性和/或免疫原性，同时保持足够程度的转录后活性，例如表达增强功能。因此，提供的多核苷酸的修饰的pre通常还被设计为保留足够量的相应未修饰或野生型pre的转录后活性，例如表达增强功能。如上所述，编码x蛋白的肝炎病毒(例如whv)的区域通常与对其表达增强功能重要的这种病毒的pre的结构特征重叠。在一些实施方式中，修饰的pre中的修饰的位点和/或性质，例如引入如上所述的终止密码子和/或翻译后信号编码序列的位点和/或性质被设计为使对某些由pre编码的二级或三级结构的改变最小化。在一些实施方式中，这样的修饰被引入pre的区域中，而不是编码pre子元件的茎环结构的那些，例如pre的α和/或β子元件的茎环结构。在一些实施方式中，在编码α茎环结构的最小α子元件内或在编码β茎环结构的β子元件的一部分内不引入终止密码子或进行修饰。在一些实施方式中，如果将修饰引入茎环结构中，则通过选择不同于相应的野生型或未修饰核碱基并仍保持pre的二级结构或三级结构的核碱基来进行修饰。例如，在一些实施方式中，如果对茎环形成结构内的某个位置的修饰被修饰，例如，以引入终止密码子，则可以在另一位置进行互补修饰以允许形成与野生型或未修饰序列相同或相似的二级或三级结构，例如茎环结构。
提供的多核苷酸之中还包含含有变体flap序列(“变体flap”多核苷酸)的多核苷酸。变体flap多核苷酸包括多核苷酸，例如含有一个或多个病毒核酸的那些，其中一个或多个flap序列或其部分已缺失。这种变体flap多核苷酸包括用于表达重组分子，如重组例如异源蛋白质的表达盒和载体，如病毒载体。在一些实施方式中，包含修饰的pre的多核苷酸还包括flap序列的变异和/或是变体flap多核苷酸。通常，flap中的变异使得它们仍然允许和/或基本上不破坏重组分子，例如在宿主细胞中的病毒递送或表达。
还提供含有多核苷酸的表达盒，通常还包括与编码重组蛋白的序列(例如异源蛋白)可操作地连接的启动子，以及含有此类多核苷酸和表达盒的载体，包括逆转录病毒载体如慢病毒和γ-逆转录病毒载体。还提供了含有这样的多核苷酸、盒和/或载体的病毒和细胞，包括包装细胞和宿主细胞，例如t细胞和含有它们的组合物。还提供了这些实施方式的方法和用途，包括治疗方法和用途，例如涉及以有效治疗或预防疾病或病症的量向对象给予病毒、载体和/或细胞的那些治疗方法和用途。
a.修饰的pre
提供的多核苷酸中修饰的pre含有变体x基因。变体x基因是未修饰的，通常野生型的，肝炎x基因的变体。与野生型或其他未修饰的x基因相比，变体x基因包括一个并且通常超过一个修饰。具体地，变体x基因通常包括一个或多个修饰，其设计用于防止或降低由x基因和/或pre内的序列编码的不想要的蛋白质或肽，例如在引入对象后将被表达和/或维持的可能性。与未修饰的，例如野生型序列相比，修饰可包括核苷酸缺失、取代和/或插入。
在一些实施方式中，修饰包括导致在相应野生型或未修饰的x基因中不存在的修饰pre的变体x基因中终止密码子存在的突变，例如不存在于相应野生型或其他含有部分x基因的未修饰的pre。在一些实施方式中，与野生型或未修饰的pre内的野生型x基因或x基因片段相比，这些修饰缩短了x蛋白编码开放阅读框。在一些实施方式中，修饰产生修饰的pre，其中变体x基因含有长度不超过9、12、15、18或21个核苷酸的x蛋白开放阅读框。在一些实施方式中，修饰的pre的变体x基因中的修饰防止长度超过3、4、5、6或7个氨基酸的x蛋白阅读框中含有，或者可能对对象具有免疫原性或具有致癌潜力或活性的任何蛋白质的表达。在一些实施方式中，如果变体x基因还含有突变或修饰的起始位点或启动子，即使在导致功能启动子或起始位点的逆转的突变的情况下，终止密码子修饰也阻止这种表达。
在一些实施方式中，修饰的pre的变体x基因中的修饰防止任何不需要的多肽的表达，无论是否在x蛋白编码阅读框中。例如，在一些实施方式中，修饰的pre的变体x基因中的修饰阻止了来自其中包含的长于一定长度的x基因，如长度长于3、4、5、6或7个氨基酸的和/或在对象中表达后可能是免疫原性的任何肽或多肽的表达。
在一些实施方式中，修饰包括引入编码序列以引入或产生靶向表达的由修饰的pre的变体x基因或其部分表达的蛋白用于降解的翻译后降解氨基酸序列的那些修饰。示例性的降解序列包括泛素化信号。因此，修饰的pre的变体x基因中的修饰还可包括那些产生不存在于由未修饰或野生型x基因编码的相应蛋白质中的翻译后降解序列，例如泛素化序列，例如，不存在于含有部分x基因的相应的野生型或未修饰的pre中。
修饰的pre的变体x基因通常含有x基因的一部分，其长度包括比相应野生型肝炎病毒中存在的相应野生型全长x基因更少的核碱基。在一些实施方式中，x基因的部分缺少与pre的转录后调节功能不重叠和/或不重要或必需的x基因核苷酸。在一些实施方式中，x基因的部分缺少野生型肝炎病毒的不在pre和/或其功能区域的α、β和/或γ子元件内的x基因残基。因此，本文修饰的pre通常不包括全长x基因或其全长变体。在一些这样的实施方式中，修饰的pre内的变体x基因通常包括长度小于或约425、400、300、200或180个核碱基。
修饰的pre通常包含α、β和/或γ子元件中的一个或多个，其在一些情况下可以是野生型或未修饰的pre或其功能部分的子元件的变体，例如，转录后活性和/或形成茎环或其他二级或三级结构足够的那个。在一些情况下，这些部分中的至少一些通常与修饰的pre的变体x基因部分重叠。因此，在一些情况下，变体x基因的一部分可以包含在α子元件的一部分内，和/或变体x基因的一部分可以包含在β子元件内或与β子元件重叠。在一些实施方式中，与野生型或未修饰的x基因或pre相比，提供的修饰的pre的变体x基因中的修饰不消融、减少和/或干扰转录后活性以控制由修饰的pre的α和/或β和/或γ子元件介导的可操作地连接的核酸的表达(例如，重组分子或转基因)，和/或基本不这样做，与由没有修饰的相应的野生型或未修饰的pre的子元件介导的转录后活性相比，或与已知保留足够活性的另一修饰的pre相比，例如具有seqidno：119、120或216的序列的那种。
在一个实施方式中，引入终止密码子和/或翻译后降解序列的核苷酸变化使得在rna水平上它们不改变pre内的顺式元件序列的二级和/或三级结构和/或者与相应的野生型或未修饰的pre和/或不含有这些修饰的pre相比，它们在pre内保留相当程度的顺式元件序列和/或三级结构。在另一个实施方式中，引入终止密码子和/或翻译后降解序列的核苷酸变化使得在rna水平上，核苷酸变化不改变pre的活性，例如其促进rna从核输出的能力，例如，与不含这些修饰的相应的野生型pre和/或pre相比，和/或与本领域已知的具有足够程度的活性用于病毒载体转导或被接受用于其中和/或被接受在基因治疗的背景下使用的另一修饰pre相比，通过与crm1依赖和/或独立输出机制的相互作用，提供细胞蛋白的结合位点，增加rna，例如，转基因rna的总量，转录物，增加rna稳定性，增加多聚腺苷酸转录物的数量和/或增加这些转录物中多聚腺苷酸尾的大小。在一些实施方式中，另一未修饰的pre具有seqidno：119、seqidno：120或seqidno：216所示的序列。
在一些实施方式中，修饰的pre内的β子元件包括变体x基因的至少一部分。在一些这样的实施方式中，β子元件是野生型或未修饰的pre的β子元件的功能变体或其部分，使得含有β子元件的功能变体或部分的修饰的pre显示转录后活性。在一些实施方式中，β子元件的功能变体是seqidno：6所示的β子元件的变体或其功能部分。在一些实施方式中，β子元件的功能变体或部分含有足以形成β茎环的核苷酸残基。例如，在一些实施方式中，β子元件的功能变体或部分含有对应于seqidno：1或seqidno：125的核苷酸残基448-470的核苷酸残基，例如seqidno：7所示的核苷酸序列。在本文提供的修饰的pre的方面，变体x基因不包含对应于seqidno：1或seqidno：125的核苷酸448-470的任何核苷酸内和/或在对应于seqidno：7所示的核苷酸的核苷酸区域中的核苷酸变化。在一些实施方式中，在(例如引入终止密码子的)修饰位于对应于seqidno：1或seqidno：125的一个或多个核苷酸448-470的核苷酸碱基处和/或对应于seqidno：7所示的核苷酸的一个或多个核苷酸处的情况中，可以在另一个位置进行互补修饰，以允许形成与野生型或未修饰序列的β茎环相同或相似的二级或三级结构。
在含有α子元件的修饰的pre的一些实施方式中，修饰的α子元件可以来自未修饰的肝炎pre，如野生型肝炎pre，或可以是其功能变体，使得含有α子元件的功能变体的修饰的pre表现出转录后活性。在一些实施方式中，所述α子元件如seqidno：3所示，或如seqidno：4所示，或是seqidno：3或seqidno：4的功能变体或部分。在一些实施方式中，α子元件的功能变体或部分含有足以形成α茎环的核苷酸残基。例如，在一些实施方式中，α子元件的功能变体含有对应于seqidno：1或seqidno：125的核苷酸残基329-366的核苷酸残基，例如seqidno：5所示的核苷酸序列。在本文提供的修饰的pre的方面，修饰的pre不包含对应于seqidno：1或seqidno：125的核苷酸329-366的任何核苷酸内和/或在对应于seqidno：5所示的核苷酸的核苷酸区域中的核苷酸变化。在一些实施方式中，在修饰位于对应于seqidno：1或seqidno：125的一个或多个核苷酸329-366的核苷酸碱基处和/或对应于seqidno：5所示的核苷酸的一个或多个核苷酸处的情况中，可以在另一个位置进行互补修饰，以允许形成与野生型或未修饰序列的α茎环相同或相似的二级或三级结构。
在一个实施方式中，修饰的pre至少含有α和β子元件，如α和β子元件的功能变体，其至少一部分通常与变体x基因重叠。在一些实施方式中，修饰的pre含有γ子元件或其功能变体。在含有γ子元件的修饰的pre的实施方式中，修饰的γ子元件可以来自未修饰的肝炎pre，如野生型肝炎pre，或可以是其功能变体，使得含有γ子元件的功能变体的修饰的pre保留转录后活性。在一些实施方式中，γ子元件如seqidno：8所示，或是seqidno：8的功能变体或部分。
修饰的pre的核苷酸修饰，如变体x基因内的核苷酸修饰可以包括核苷酸缺失、插入和/或取代。与未修饰的pre(例如野生型pre)的x基因相比，变体x基因可以含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个核苷酸变化。在一些实施方式中，变体x基因含有不超过4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸的变化。在一些实施方式中，变体x基因具有显示出与seqidno：10所示的x基因、与seqidno：1、12-20、119或120的核苷酸391-592的序列、或与seqidno：125或216的核苷酸391-589的序列至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，其中变体x基因含有至少一个其中不存在的终止密码子和/或编码翻译后修饰信号或其中不存在的降解序列的序列。例如，在一些实施方式中，变体x基因具有显示出与seqidno：10所示的x基因、与seqidno：1的核苷酸391-592的序列、或与seqidno：125的核苷酸391-589的序列至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，其中变体x基因含有至少一个其中不存在的终止密码子和/或编码翻译后修饰信号或其中不存在的降解序列的序列。在一些实施方式中，修饰的pre具有显示出与seqidno：1、12-20、119、120、125或216中任一个所示的pre至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，其中修饰的pre含有其中不存在的至少一个终止密码子和/或编码其中不存在的翻译后修饰信号或降解序列的序列。例如，在一些实施方式中，修饰的pre具有显示出与seqidno：1或125所示的pre至少65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，其中修饰的pre含有其中不存在的至少一个终止密码子和/或编码其中不存在的翻译后修饰信号或降解序列的序列。
在一些实施方式中，变体x基因是部分x基因，如野生型x基因的一部分，具有小于肝炎病毒的x基因的全长序列的序列，如野生型型肝炎病毒，如哺乳动物肝炎病毒。例如，在一些实施方式中，修饰的pre包含长度小于或不超过约250个核苷酸，例如小于或不超过约240个核苷酸，230个核苷酸，220个核苷酸，210个核苷酸，200个核苷酸，190个核苷酸，180个核苷酸，170个核苷酸，160个核苷酸，150个核苷酸，140个核苷酸，130个核苷酸，120个核苷酸，110个核苷酸，100个核苷酸，90个核苷酸，80个核苷酸或70个核苷酸的变体x基因。在一些实施方式中，修饰的pre含有长度至少为60个核苷酸但小于肝炎病毒的x基因的全长序列的变体x基因，如野生型肝炎病毒，如哺乳动物肝炎病毒。例如，在一些实施方式中，修饰的pre含有长度为至少60个核苷酸但小于或不超过或约250个核苷酸长度，例如小于或不超过或约240个核苷酸，230个核苷酸，220个核苷酸，210个核苷酸，200个核苷酸，190个核苷酸，180个核苷酸，170个核苷酸，160个核苷酸，150个核苷酸，140个核苷酸，130个核苷酸，120个核苷酸，110个核苷酸，100个核苷酸，90个核苷酸，80个核苷酸或70个核苷酸的变体x基因。在一些实施方式中，修饰的pre含有长度为至少或约至少180个核苷酸的变体x基因。
在一些实施方式中，含有变体x基因的修饰的pre是含有x基因或其部分的未修饰pre(例如，野生型肝炎pre)的变体。例如，变体x基因可以是具有小于肝炎病毒的相应x基因的全长序列的x基因的野生型肝炎pre的变体，例如野生型肝炎病毒，如哺乳动物肝炎病毒。未修饰或野生型x基因可含有长度小于或不超过约250个核苷酸，例如小于或不超过约240个核苷酸，230个核苷酸，220个核苷酸，210个核苷酸，200个核苷酸，190个核苷酸，180个核苷酸，170个核苷酸，160个核苷酸，150个核苷酸，140个核苷酸，130个核苷酸，120个核苷酸，110个核苷酸，100个核苷酸，90个核苷酸，80个核苷酸或70个核苷酸的变体x基因。
在一些实施方式中，未修饰的pre，例如野生型肝炎pre，是含有具有编码功能性x蛋白(例如截短的x蛋白)的开放阅读框的x基因的pre。在这样的实施方式中，变体x基因含有用于启动x蛋白翻译的起始密码子。在一些实施方式中，起始密码子是atg起始密码子。在一些实施方式中，变体x基因含有对应于seqidno：1或seqidno：125的位置411的位置处开始的起始密码子的起始密码子。在一些实施方式中，未修饰的pre，例如野生型pre，可以包含编码长度为至少30个氨基酸，例如至少40个氨基酸，50个氨基酸，60个氨基酸，70个氨基酸或80个氨基酸的x蛋白的开放阅读框。
修饰的pre通常包含含有修饰的变体x基因，例如一个或多个引入未修饰的肝炎x基因中不存在的一个或多个终止密码子和/或翻译后降解序列的核苷酸修饰，例如不存在于野生型肝炎x基因或其相应的截短型(例如，存在于pre中)。在一些实施方式中，变体x基因含有不存在于野生型哺乳动物肝炎x基因或其相应截短形式(例如存在于pre中)的修饰。在一些实施方式中，未修饰或野生型肝炎x基因或其截短形式是x基因，其表现出与seqidno：9或seqidno：10或者与seqidno：1的核苷酸411-592或seqidno：125的核苷酸411-589至少或约至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列相同性。在一些实施方式中，野生型或未修饰的哺乳动物肝炎x基因或其相应的截短形式具有对应于seqidno：1或12-20中任一个的核苷酸411-592，seqidno：125的核苷酸411-589，seqidno：21-23中任一个的核苷酸412-722，seqidno：25的核苷酸411-721，seqidno：26的核苷酸401-582或seqidno：27的核苷酸411-592的核苷酸序列。在一些实施方式中，未修饰或野生型肝炎x基因是whvx基因或其相应的截短形式，其显示与seqidno：9、seqidno：1的核苷酸411-592或与seqidno：125的核苷酸411-589至少或约至少94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性。在一些实施方式中，未修饰的或野生型的whvx基因或其对应的截短形式具有对应于seqidno：1、12-20、119或120中任一个的核苷酸411-592或seqidno：125或216的核苷酸411-589的核苷酸序列。在一些实施方式中，肝炎x基因是seqidno：9所示的whvx基因或seqidno：10所示的其相应的截短形式。
在一些实施方式中，修饰的pre的变体x基因含有与包含在未修饰的肝炎pre(如野生型肝炎pre)中的x基因或其部分相比的差异。在一些实施方式中，这种野生型肝炎pre是哺乳动物肝炎pre。在一些实施方式中，野生型或未修饰的哺乳动物pre具有与seqidno：1或seqidno：125至少或约至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列相同性的核苷酸序列。在一些实施方式中，野生型或未修饰的哺乳动物肝炎pre具有seqidno：1或12-27中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，未修饰或野生型肝炎pre是显示与seqidno：1或seqidno：125至少或约至少94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的wpre。例如，在一些实施方式中，未修饰或野生型wpre具有seqidno：1、12-20、119、120、125或216中任一个所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，变体x基因可操作地偶联至启动子。在一些实施方式中，启动子是未修饰的或野生型x基因启动子。例如，启动子可以具有seqidno：11所示的核苷酸序列或其功能变体或部分。启动子可以具有seqidno：11的核苷酸7-20的序列。在一些实施方式中，启动子是突变或修饰的x基因启动子，如下文第i.a.3节所述。
在一些实施方式中，修饰的pre表现出转录后活性以介导，例如增强编码与其可操作地连接的重组蛋白(例如异源蛋白)的核酸的表达，例如与不与pre可操作地连接和/或不与任何顺式调节序列连接的核酸的表达相比。在一些实施方式中，修饰的pre显示出促进从核输出rna，提供细胞蛋白质的结合位点，增加rna转录物的总量，增加rna稳定性，增加多聚腺苷酸转录物的数量和/或增加这种转录物中的多聚腺苷酸化尾的大小的活性。在一些实施方式中，修饰的pre保留相应的未修饰的肝炎pre(例如野生型肝炎pre)和/或本领域已知的另一种修饰的pre的活性或基本和/或足够程度的活性以具有足够程度的用于病毒载体转导的活性，例如具有seqidno：119，seqidno：120或seqidno：216所示序列的pre。在一些实施方式中，修饰的pre表现出seqidno：1、12-27、119、120、125或216中任一个所示的未修饰或野生型pre的转录后活性的至少或约至少或约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％。在一些实施方式中，修饰的pre表现出seqidno：1或seqidno：125所示的wpre活性的至少或约至少或约80％、85％、90％、95％或100％。
在一些这样的实施方式中，相关活性(例如，修饰的pre和/或其他pre，如其正在比较的未修饰或野生型pre)是增强或促进由可操作地连接到修饰的pre的核酸编码的重组蛋白的表达。在一些实施方式中，在转导或其他形式的载体转移到宿主细胞中后，通过测量与载体中修饰的pre可操作地连接的重组蛋白的表达水平来评估此类增强或促进。可以通过确定与不包含相应pre的载体相比的这种表达的相对程度来测量增强。可以使用包含相应pre的载体来评估修饰的pre是否具有与未修饰的pre相比相同水平或程度或相当或可接受程度的活性的问题。可采用用于评估表面重组分子的表达水平的许多熟知的方法，例如通过如下方法的检测：基于亲和性的方法，例如，基于免疫亲和性的方法，例如，在细胞表面蛋白质方面，例如通过流式细胞术。在一些实例中，通过检测转导标记物和/或报道构建体来测量表达。在一些实施方式中，编码截短表面蛋白的核酸包含在载体内，并用作由修饰的pre增强和/或表达的标记物。
1.终止密码子
修饰的pre中的终止密码子，例如，在变体x基因(例如，不存在于相应的野生型或未修饰的x基因或pre中的相应位置的一个)内可以是琥珀(tag)、赭石(taa)、或乳白(tga)终止密码子。在一个实施方式中，终止密码子是琥珀(tag)终止密码子。在一个实施方式中，终止密码子是乳白(tga)终止密码子。
可以通过核苷酸取代、缺失或插入引入终止密码子。在一个实施方式中，通过核苷酸取代引入终止密码子。核苷酸取代使由于核苷酸残基的缺失或插入可能发生的核苷酸变化(如移码)最小化。因此，核苷酸取代可以使涉及pre活性的顺式调节序列的结构变化最小化，例如β元件或其功能部分。在一些实施方式中，通过仅取代单个核苷酸形成终止密码子，使得终止密码子内的两个位置表示存在于野生型或未修饰序列中相应位置的未修饰核苷酸。在一些实施方式中，通过取代两个核苷酸形成终止密码子，使得终止密码子中仅一个位置表示存在于野生型或未修饰序列中相应位置的未修饰核苷酸。在一些实施方式中，通过取代三个核苷酸形成终止密码子，使得终止密码子内的所有位置与野生型或未修饰序列的相应密码子相比不同。
变体x基因可以含有不存在于未修饰的或野生型x基因或不存在于未修饰或野生型pre中的至少1、2、3、4、5、6或更多的终止密码子。通常，至少一个终止密码子处于x蛋白阅读框内。在一些实施方式中，变体x基因含有多个终止密码子，例如至少2、3、4、5或6个终止密码子。
在一些实施方式中，多个终止密码子包括至少两个终止密码子，其中一个终止密码子在x蛋白质阅读框内，另一个在不同的阅读框中。在其他实施方式中，多个终止密码子包含在存在于变体x基因的各阅读框中的至少三个终止密码子。
在一些实施方式中，多个终止密码子包含在相同阅读框中的至少2个终止密码子。通常，至少两个终止密码子与x蛋白阅读框处于相同的阅读框中。
在一些实施方式中，至少一个终止密码子中的每一个从对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置在3'方向上不超过36个核苷酸或以内的位置开始，例如对应于相应的野生型或未修饰的x蛋白开放阅读框中的起始密码子的密码子，例如对应于seqidno：1或seqidno：125所示的x蛋白开放阅读框中的起始密码子，从位置411开始。通常，在x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置之后，存在于变体x基因中的多个引入的终止密码子中的第一个终止密码子，并且在一些情况下，每个终止密码子在从对应于起始密码子的5'位置的位置在3'方向上不超过36个核苷酸或以内开始。例如，在一些实施方式中，在对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置之后存在于变体x基因中的多个终止密码子中的至少一个终止密码子，例如，第一个终止密码子或者一个或多个，在对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置的3'方向的不超过35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9个核苷酸或以内的位置处开始。。在一些实施方式中，至少一个终止密码子中的每一个在对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置的3'方向的不超过9、12、15、18或21个核苷酸以内的位置处开始，如距离此位置不超过21个核苷酸。
参照seqidno：1或seqidno：125所示的示例性wpre，对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置对应于残基411(对应于seqidno：2所示的whv序列的残基1503)。在一些实施方式中，在对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置之后存在于变体x基因中的多个终止密码子中的至少一个终止密码子，例如，第一个终止密码子或者一个或多个，在对应于seqidno:1或seqidno:125所示的wpre中的残基411的位置的3’方向上不超过36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9个核苷酸或以内的位置处开始，例如，距离该位置在3’方向上不超过9、12、15、18、或21，例如，不超过21个核苷酸。对于本领域技术人员而言容易鉴定另一种肝炎pre(如另一种wpre)中的残基，其对应于残基411以鉴定对应于如seqidno：1或seqidno：125所示的示例性野生型pre的起始密码子的密码子的5’位置(其是seqidno：1或含有seqidno：1的残基1-589的部分)。图2a-2e例示了示例性肝炎pre中相应残基的鉴定。
在含有具有多个终止密码子的变体x基因的修饰的pre的一些实施方式中，终止密码子可以依次存在于x基因的每个阅读框中。在含有具有多个终止密码子的变体x基因的修饰的pre的一些实施方式中，终止密码子可以依次存在于相同阅读框中。
在修饰的pre的一些实施方式中，变体x基因不包含长度大于或约39个核苷酸，例如大于或约36个核苷酸、33个核苷酸、30个核苷酸、27个核苷酸、24个核苷酸、21个核苷酸、18个核苷酸、15个核苷酸或12个核苷酸的开放阅读框。
在一些实施方式中，所述至少一个终止密码子，例如，在对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置之后，存在于变体x基因中的多个终止密码子中的第一个终止密码子或一个或多个终止密码子，在x蛋白阅读框内的位置处开始。例如，在一些实施方式中，在对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置之后存在于变体x基因中的多个终止密码子中的至少一个终止密码子，例如，第一个终止密码子或者一个或多个，在对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的位置的3’方向上不超过36、33、30、27、24、21、18、15、12、或9个核苷酸或以内的位置处开始，例如，距离该位置在3’方向上不超过9、12、15、18、或21，例如，不超过21个核苷酸。在一些实施方式中，所述至少一个终止密码子，例如，在对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置之后，存在于变体x基因中的多个终止密码子中的第一个终止密码子或一个或多个终止密码子，在对应于seqidno：1或seqidno：125所示的wpre中的残基411的位置在3'方向上不超过36、33、30、27、24、21、18、15、12或9个核苷酸或以内的位置处开始。
在一些实施方式中，修饰的pre含有变体x基因，其含有从对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置的3'方向上的位置9、13、17和/或21开始的终止密码子或多个终止密码子。参考seqidno：1或seqidno：125所示的示例性wpre，修饰的pre含有含有终止密码子或多个终止密码子的变体x基因，该终止密码子从对应于seqidno：1或seqidno：125所示的序列中的位置420、424、428和/或432的核苷酸位置开始。在这样的实施方式中，一个、两个、三个或所有四个位置可以是终止密码子的开始。
在一些实施方式中，修饰的pre含有变体x基因，其含有从对应于x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置的3'方向上的位置9、13、17和21开始的4个终止密码子。参考seqidno：1或seqidno：125所示的示例性wpre，修饰的pre含有含有终止密码子的变体x基因，该终止密码子从对应于seqidno：1或seqidno：125所示的序列中的位置420、424、428和432的核苷酸位置开始。
在一些实施方式中，修饰的pre包含显示与seqidno：1或seqidno：125至少65％序列相同性，例如至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列相同性的核苷酸序列，只要修饰的pre含有含有不存在于seqidno：1或seqidno：125所示的x基因中的至少一个终止密码子的变体x基因。在一些实施方式中，修饰的pre仅通过核苷酸取代与seqidno：1或seqidno：125不同。在其它实施方式中，修饰的pre通过核苷酸插入或缺失与seqidno：1或125不同。在一些实施方式中，修饰的pre可以比seqidno：1或seqidno：125更长或更短。
在一些实施方式中，修饰的pre除了在野生型或未修饰的pre中不存在的至少一个终止密码子之外不含任何修饰。
表2a和2b分别列出了在变体x基因或修饰的pre中引入至少一个终止密码子的示例性位置。还列出了示例性多核苷酸的序列的相应seqidno。在一些实施方式中，提供了包含修饰的pre的多核苷酸，其含有包含seqidno：44-58或141-155中任一个所示的核苷酸序列的变体x基因。在一些实施方式中，提供了包含修饰的pre的多核苷酸，其具有seqidno：29-43或126-140中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，提供了含有与编码重组分子(如重组抗原受体、car、tcr、嵌合受体、免疫调节剂、免疫刺激分子和/或转导或表达标记物)可操作地连接的pre的多核苷酸，含有pre的表达盒和载体。
2.降解序列
在一些实施方式中，截短的x基因包含翻译后修饰信号，其可以包括已知增加蛋白质被蛋白酶体降解的概率的降解序列，从而降低蛋白质的半衰期。这种序列的非限制性示例包括在n-端规则之后纳入编码pest序列、泛素结合结构域或氨基酸的核苷酸。
pest序列是富含脯氨酸(p)、谷氨酸(e)、丝氨酸(s)和苏氨酸(t)的氨基酸区域。(rogerss,wellsr,rechsteinerm(1986).“快速降解蛋白质的共同氨基酸序列：pest假设(aminoacidsequencescommontorapiddegradationproteins：thepesthypothesis)”，science(杂志)234(4774):364–8.doi:10.1126/science.2876518。pest区域的存在可导致含有它们的蛋白质的快速细胞内降解。因此，在一些实施方式中，变体x基因包含编码pest区域的核酸。
在一些实施方式中，变体x基因包含编码泛素结合结构域的核酸。泛素结合结构域(ubd)是与泛素非共价结合的模块蛋白结构域的集合。这些基序解释和传递蛋白质泛素化所赋予的信息，以控制各种细胞事件，包括蛋白酶体降解。因此，在一些实施方式中，变体x基因可以可操作地连接到编码泛素结合结构域的核酸，使得泛素连接酶靶向变体x蛋白以进行泛素标记，并因此更快地由蛋白酶体降解。泛素结合结构域的非限制性实例包括cue、gat、glue、nzf、paz、uba、uev、uim和vhs。参见hicke，ubiquitin-bindingdomains，doi：10.1038/nrm1701。
在一些实施方式中，变体x基因包含对应于根据n端规则降低x蛋白稳定性的氨基酸取代的突变。在n规则中，在除去起始甲硫氨酸之后，在多肽的n-末端暴露的氨基酸的种类可影响多肽的代谢稳定性和半衰期。(varshavsky,a,1996n端规则：功能、谜团、使用(then-endrule:functions,mysteries,uses).procnatlacad.sci.usa93(22):12142-12149)。该氨基酸可以称为去稳定性氨基酸。因此，在一些实施方式中，修饰的pre包含变体x基因中的突变，其中紧随起始密码子后的是编码去稳定性氨基酸的密码子。去稳定性氨基酸的非限制性实例包括甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸和亮氨酸。参见varshavsky1996；也参见gonda等，(1989)."n端规则的结构和普遍性(universalityandstructureofthen-endrule)".journalofbiologicalchemistry264(28):16700–16712。在一些实施方式中，修饰的pre包含变体x基因中的突变，其中紧随起始密码子后的是编码一级去稳定性氨基酸和二级去稳定性氨基酸的密码子。这些突变可以对应于氨基酸对，如精氨酸-谷氨酸，或精氨酸-天冬酰胺。在一些实施方式中，精氨酸是一级去稳定性氨基酸，并且谷氨酸或天冬酰胺是二级去稳定性氨基酸。
3.其他修饰
提供的是含有修饰的pre的多核苷酸，其除了上述任何之外还含有其他修饰。在一些实施方式中，其他修饰可以是修饰的pre中包含的x基因的任何修饰，其降低或防止x基因或编码的x蛋白的表达、降解、稳定性、致癌性和/或免疫原性中的一种或多种。在一些实施方式中，其他修饰改变，例如减少变体x基因的转录和/或由变体x基因编码的x蛋白的翻译。
在一个实施方式中，修饰的pre另外含有x基因起始密码子的变体，在某些情况下，其引入以限制或防止翻译起始。在一些实施方式中，与未修饰的x基因起始密码子(如野生型肝炎病毒x基因起始密码子)相比，起始密码子的变体含有一个或多个核苷酸差异。例如，参考seqidno：1或seqidno：125，修饰的pre还可含有与对应于seqidno：1或seqidno：125的核苷酸位置411-413的起始密码子相比含有一个或多个核苷酸差异的变体起始密码子。对于本领域技术人员而言容易鉴定对应于seqidno：1或seqidno：125的起始密码子位置411-413的另一种肝炎pre(如另一种wpre)中的残基(参见例如，图2a-2e)。核苷酸差异可能导致翻译起始受限制或阻止。
在一些实施方式中，起始密码子的变体可以是在对应于seqidno：119或seqidno：216所示的修饰的wpre序列的变体x基因阅读框中的x基因起始密码子的位置处发现的变体密码子。例如，起始密码子的变体可以是与seqidno：119或seqidno：216所示的核苷酸序列的核苷酸残基411-413(ttg)相对应的密码子。在一些实施方式中，起始密码子的变体可以是seqidno：120所示的修饰的wpre中的x基因阅读框的密码子。例如，起始密码子的变体可以是与seqidno：120所示的核苷酸序列的核苷酸残基411-413(ggg)相对应的密码子。
表3a和3b分别列出了含有变体x基因的示例性变体x基因和修饰的pre多核苷酸，其中含有至少一个引入的终止密码子和不存在于野生型或未修饰的x基因或pre中的变体起始密码子。该表列出了在变体x基因或修饰的pre中引入至少一个终止密码子的示例性位置。还列出了示例性多核苷酸的序列的相应seqidno。在一些实施方式中，变体x基因包含seqidno：74-88或171-185中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，修饰的pre包含seqidno：59-73或156-170中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，提供了含有与编码重组分子(如重组抗原受体、car、tcr、嵌合受体、免疫调节剂、免疫刺激分子和/或转导或表达标记物)可操作地连接的pre的多核苷酸，含有pre的表达盒和载体。
在另一个实施方式中，修饰的pre可另外含有与其中的变体x基因可操作地连接的变体启动子。与未修饰的肝炎病毒x基因启动子(例如野生型肝炎病毒x基因启动子)相比，变体启动子可以含有一个或多个核苷酸差异。例如，参考seqidno：1或seqidno：125，与seqidno：11所示或seqidno：11的核苷酸7-20所示的wprex基因启动子相比，变体x基因可以含有一个或多个核苷酸差异。在一些实施方式中，核苷酸差异可导致导致限制或防止启动子转录的一个或多个差异。
在一些实施方式中，修饰的pre可以含有变体启动子，其具有与seqidno：119或seqidno：216所示的修饰的pre序列中的修饰的x基因可操作地连接的变体启动子的序列。例如，变体启动子可以是包含对应于残基391-411(ggggaaatcatcgtcctttcc；seqidno：217)或核苷酸残基397-410(atcatcgtcctttc；seqidno：218)，seqidno：119或seqidno：216所示的各核苷酸序列的核苷酸残基的变体启动子。在一些实施方式中，修饰的pre可以含有变体启动子，其具有与seqidno：120所示的修饰的pre中修饰的x基因可操作地连接的变体启动子的序列。例如，变体启动子可以是包含对应于残基391-411(ggggaaggtctgctgagactc；seqidno：219)或核苷酸残基397-410(ggtctgctgagact；seqidno：220)，seqidno：120所示的各核苷酸序列的核苷酸残基的变体启动子。
在一些实施方式中，变体启动子可以是本领域已知的肝炎x蛋白启动子的变体启动子，例如sugata等，(1994)virology，205：314-320中所述。在一些实施方式中，变体x启动子可以是seqidno：11所示的启动子的变体或包含seqidno：10的核苷酸6-22的启动子，其包含对应于seqidno：10的位置9的位置处的苏氨酸(t)的突变或对应于seqidno：10的位置10的位置处的甘氨酸(g)的突变。
表3a和3b列出了分别含有变体x基因的示例性变体x基因和修饰的pre多核苷酸，其中含有至少一个引入的终止密码子，变体启动子和任选的不存在于野生型或未修改的pre中的变体起始密码子。该表列出了在变体x基因或修饰的pre中引入至少一个终止密码子的示例性位置。还列出了示例性多核苷酸的序列的相应seqidno。在一些实施方式中，修饰的pre包含seqidno：89-118或186-215中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，提供了含有与编码重组分子(如重组抗原受体、car、tcr、嵌合受体、免疫调节剂、免疫刺激分子和/或转导或表达标记物)可操作地连接的pre的多核苷酸，含有pre的表达盒和载体。
b.编码重组分子的核酸
在一些实施方式中，提供的多核苷酸中的修饰的pre可操作地连接至编码一种或多种感兴趣分子的一种或多种核酸，例如一种或多种重组和/或异源分子，例如，重组蛋白，如异源蛋白。这样的重组和/或异源分子可包括可溶性蛋白质，例如分泌蛋白质和/或细胞表面蛋白质。在一些实施方式中，分子是或包含重组受体。这样的重组受体可包括抗原受体，例如功能性非tcr抗原受体，包括嵌合抗原受体(car)和其它抗原结合受体如转基因t细胞受体(tcr)。所述受体还可包括其它受体，如其他嵌合受体，例如结合至具体配体的受体和具有与car中存在的那些相似的跨膜和/或胞内信号转导结构域的受体。
在一些实施方式中，分子是可溶性分子，例如免疫调节和/或免疫刺激分子，例如细胞因子，例如il-2、il-12、il-6、41bbl、cd40l和/或可溶性配体或受体，如免疫细胞共刺激分子的可溶性配体，例如cd40l、41bbl或可溶性抗原结合分子如scfv。分子中也包括表达或转导标记物和已知用于表达载体和/或盒的任何其它分子。
在一些实施方式中，重组抗原受体(例如car)特异性结合待靶向的疾病或细胞上的一种或多种配体，例如癌症、感染性疾病、炎性或自身免疫疾病或其它疾病或病症，包括本文描述用提供的方法和组合物进行靶向的那些。示例性抗原是孤儿酪氨酸激酶受体rorl、tegfr、her2、ll-cam、cd19、cd20、cd22、间皮素、cea、和肝炎b表面抗原、抗叶酸受体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、egfr、egp-2、egp-4、0epha2、erbb2、3、或4、fbp、胎儿乙酰胆碱e受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、κ轻链、lewisy、l1-细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、癌胚抗原、ror1、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性抗原、psma、her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、酪氨酸蛋白激酶b2、cd123、cs-1、c-met、gd-2、和magea3、ce7、维尔姆斯瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白a1(ccna1)、和/或生物素化分子，和/或通过hiv、hcv、hbv、hpv和/或其它病原体表达和/或表征的分子，和/或其致癌形式。
1.嵌合抗原受体
在一些实施方式中，重组分子是或包含嵌合抗原受体(car)。car一般是遗传工程改造的受体，其具有连接至一种或多种胞内信号转导组分的胞外配体结合结构域。此类分子通常模拟或近似通过天然抗原受体的信号和/或通过此类受体联合共刺激受体的信号。
在一些实施方式中，构建的car针对具体标志物具有特异性，例如，通过过继治疗靶标的具体细胞类型表达的标志物，例如，癌症标志物和/或任何所述抗原。因此，car一般包括一个或多个抗体的抗原结合片段、结构域、或部分，或者一个或多个抗体可变结构域、和/或抗体分子。在一些实施方式中，所述car包括抗体分子的一个或多个抗原-结合部分，例如可变重链(vh)或其抗原结合部分，或源自单克隆抗体(mab)的可变重(vh)和可变轻(vl)链的单链抗体片段(scfv)。
所述抗原特异性结合或识别组分一般连接至一种或多种跨膜和胞内信号转导结构域。在一些实施方式中，car包括与胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然关联受体(例如car)中的结构域之一的跨膜结构域。在一些情况中，所述跨膜结构域通过氨基酸取代来选择或修饰，以避免所述结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域源自天然或合成来源。当所述来源是天然来源时，在一些方面中，所述结构域源自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜区包括源自t-细胞受体的α、β或ζ链，cd28，cd3ε，cd45，cd4，cd5，cds，cd9，cd16，cd22，cd33，cd37，cd64，cd80，cd86，cd134，cd137，cd154的那些(即包含至少它们的跨膜区域)。在一些实施方式中，所述跨膜结构域是合成的。在一些方面中，所述合成跨膜结构域主要包含疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面中，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三聚体将出现在合成的跨膜结构域的各末端。在一些实施方式中，所述连接通过接头、间隔物和/或跨膜结构域发生。
在一些实施方式中，存在短的寡肽或多肽接头，例如，长度为2-10个氨基酸的接头，例如包含甘氨酸和丝氨酸，例如，甘氨酸-丝氨酸双联体的接头，并在car的胞质信号转导结构域和跨膜结构域之间形成连接。
所述受体(例如，car)，一般包括至少一种的一个或多个胞内信号转导部分。在一些实施方式中，所述受体包括tcr复合物的胞内组分，例如介导t-细胞活化和细胞毒性的tcrcd3+链，例如，cd3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分连接到一个或多个细胞信号转导模块。在一些实施方式中，细胞信号转导模块包括cd3跨膜结构域、cd3胞内信号转导结构域，和/或其它cd跨膜结构域。在一些实施方式中，所述受体，例如，car，还包括一种或多种其它分子的部分，例如fc受体γ、cd8、cd4、cd25或cd16。例如，在一些方面，car或其它嵌合受体包括cd3ζ(cd3-ζ)或fc受体γ与cd8、cd4、cd25或cd16之间的嵌合分子。
在一些实施方式中，在car或其它嵌合受体结合时，受体的细胞质结构域或细胞内信号转导结构域激活免疫细胞的正常效应功能或应答中的至少一种，例如经工程改造以表达car的t细胞。例如，在一些情况中，car诱导t细胞的功能，例如溶细胞活性或辅助性t细胞活性，例如细胞因子或其它因子的分泌。在一些实施方式中，采用抗原受体部分或共刺激分子的胞内信号转导结构域的截短部分来替代完整免疫刺激链，例如，如果其转导效应物功能信号的话。在一些实施方式中，所述一种或多种胞内信号转导结构域包括t细胞受体(tcr)的胞质序列，且在一些方面中，在天然情况下与此类受体一起作用以在抗原受体衔接之后起始信号转导的共同受体的那些，和/或此类分子的任何衍生物或变体，和/或具有相同功能性能力的任何合成序列。
在天然tcr的情况中，完全活化一般不仅需要通过tcr的信号转导，而且需要共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全活化，用于产生第二或共刺激信号的组分也包括在所述car中。在一些方面中，t细胞活化描述为通过两类胞质信号转导序列介导：通过tcr起始抗原依赖性第一活化的那些(第一胞质信号转导序列)，和以抗原非依赖性方式作用以提供第二或共刺激信号的那些(第二胞质信号转导序列)。在一些方面中，所述car包括此类信号转导组分之一或两者。
在一些方面中，第一胞质信号转导序列可以刺激方式，或以抑制方式调节tcr复合物的第一活化。以刺激方式作用的第一胞质信号转导序列可包含信号转导基序，其已知是免疫受体基于酪氨酸的活化基序或itam。itam的实例包括第一胞质信号转导序列，其包括源自如下的那些：tcrζ，fcrγ，fcrβ，cd3γ，cd3δ，cd3ε，cds，cd22，cd79a，cd79b，和cd66d。在一些实施方式中，car中的胞质信号转导分子包含胞质信号转导结构域，其部分或源自cd3ζ的序列。
在一些实施方式中，所述car包括共刺激受体的跨膜部分和/或信号转导结构域，例如cd28、4-1bb、ox40、dap10，和icos。
在某些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含cd28跨膜和信号转导结构域，其连接至cd3胞内结构域。在一些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含嵌合cd28和cd137共刺激结构域，其连接至cd3胞内结构域。在一些实施方式中，car还可包括转导标志物(例如，tegfr)。在一些实施方式中，cd8+细胞毒性t细胞的胞内信号转导结构域与cd4+辅助t细胞的胞内信号转导结构域相同。在一些实施方式中，cd8+细胞毒性t细胞的胞内信号转导结构域与cd4+辅助t细胞的胞内信号转导结构域不同。
在一些实施方式中，所述car涵盖一个或多个，例如，两个或更多个，共刺激结构域和活化结构域，例如，胞质部分中的初始活化结构域。一个实例是包括cd3-ζ、cd28和4-1bb的胞内组分的受体。
在一些实施方式中，由具有提供的多核苷酸的核酸编码的重组分子还包括一种或多种标志物，例如，用于确认细胞的转导或工程改造以表达受体和/或选择和/或靶向表达由多核苷酸编码的分子的细胞的目的。在一些方面中，可由不同的核酸或多核苷酸编码标志物，其可在遗传工程改造过程期间引入，一般通过相同方法，例如，由相同载体或载体类型转导。
在一些方面中，标志物，例如，转导标志物，是蛋白质和/或是细胞表面分子。示例性的标志物是天然产生的，例如，内源性标志物，如天然产生的细胞表面分子的截短变体。在一些方面中，与天然或内源性细胞表面分子相比，变体具有降低的免疫原性，降低的运输功能，和/或降低的信号转导功能。
在一些方面，标记物包括cd34、ngfr或表皮生长因子受体(例如tegfr)的全部或部分(例如截短形式)。
在一些实施方式中，所述标志物是分子，例如，细胞表面蛋白质，其非天然见于t细胞上的或非天然见于t细胞表面或其部分。
在一些实施方式中，所述分子是非自体分子，例如，非自体蛋白质，即，不被待向其过继转移所述细胞的宿主的免疫系统识别为“自身”的蛋白质。
在一些实施方式中，所述标志物无治疗性功能和/或除了用作遗传工程改造的标志物(例如，用于选择成功地工程改造的细胞)之外没有任何作用。在其它实施方式中，所述标志物可以是治疗性分子或在其它情况中发挥一些所需效果的分子，例如用于待在体内遇到的细胞的配体，例如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或抑制所述细胞在过继转移和遇到配体之后的响应。
示例性的受体，包括car和重组tcr，及其生产和引入，在一些实施方式中，包括例如，在国际专利申请公开号wo200014257、wo2013126726、wo2012/129514、wo2014031687、wo2013/166321、wo2013/071154、wo2013/123061，美国专利申请公开号us2002131960、us2013287748、us20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353、和8,479,118，和欧洲专利申请号ep2537416中所述的那些，和/或sadelain等，cancerdiscov.2013年4月；3(4):388–398；davila等，(2013)plosone8(4):e61338；turtle等，curr.opin.immunol.,2012年10月；24(5):633-39；wu等，cancer,2012年3月18(2):160-75中所述的那些。
2.t细胞受体(tcr)
在一些实施方式中，由核酸编码的重组分子是或包括重组t细胞受体(tcr)。在一些实施方式中，所述重组tcr对于抗原具有特异性，一般是存在于靶细胞上的抗原，例如肿瘤特异性抗原，在与自体免疫或炎性疾病相关联的具体细胞类型上表达的抗原，或源自病毒病原体或细菌病原体的抗原。
在一些实施方式中，tcr是已经从天然产生的t细胞中克隆的那种。在一些实施方式中，从患者鉴定并分离的针对靶抗原(例如，癌症抗原)的亲和性t细胞克隆。在一些实施方式中，所述针对靶抗原的tcr克隆已在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统，或hla)工程改造的转基因小鼠中产生。参见例如，肿瘤抗原(参见例如，parkhurst等，(2009)clincancerres.15:169–180和cohen等.(2005)jimmunol.175:5799–5808)。在一些实施方式中，使用病原体展示以针对靶抗原的分离tcr(参见例如，varela-rohena等，(2008)natmed.14:1390–1395和li(2005)natbiotechnol.23:349–354)。
在一些实施方式中，在获得t-细胞克隆之后，将tcrα和β链分离并克隆进入基因表达载体。在一些实施方式中，所述tcrα和β基因通过小核糖核酸病毒2a核糖体跳跃肽(skippeptide)连接，从而两条链共同表达。在一些实施方式中，编码tcr的核酸还包括标志物以确认细胞的转导或工程改造以表达该受体。
在一些实施方式中，由提供的多核苷酸内的核酸编码的重组或异源分子是或包括核酸分子，如rna、dna或人工核酸序列，如设计用于干扰靶mrna的活性或表达的那种，如短感染rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、或微小rna(mirna)。这种分子可包括设计干扰与促进、或一直免疫细胞的活性相关的分子的表达或活性，如免疫调节剂、免疫抑制分子、和免疫检验点分子。在一些实施方式中，核苷酸sirna或mirna序列(例如长度为21-25个核苷酸)可以例如通过转录短发夹rna(shrna)序列从表达载体产生较长的(例如60-80核苷酸)前体序列，其随后由细胞rnai机制处理以产生sirna或mirna序列。或者，核苷酸sirna或mirna序列(例如长度为21-25个核苷酸)可以例如，化学合成。sirna或mirna序列的化学合成可从dharmacon公司(科罗拉多州拉斐特)，凯杰公司(qiagen)(加利福尼亚州巴伦西亚)和安碧公司(ambion)(德克萨斯州奥斯汀)等公司商购获得。rna的长度可以为10至30个核苷酸，例如长度为19-25或21-25个核苷酸。例如，sirna序列通常以确切的互补性结合靶mrna内的唯一序列并导致靶mrna分子的降解。sirna序列可以结合mrna分子内的任何地方；sirna靶向的序列包括表达感兴趣的多肽的基因，或这种基因的上游或下游调节剂，例如，基因的上游或下游调节剂，例如结合基因启动子的转录因子，与感兴趣的多肽相互作用的激酶或磷酸酶，以及参与能够影响感兴趣的多肽的调节途径的多肽。mirna序列通常以精确或低于准确的互补性结合靶mrna内的唯一序列，并导致靶mrna分子的翻译抑制。mirna序列可以在mrna序列内的任何位置结合，但通常在mrna分子的3’非翻译区域内结合。
c.表达盒和病毒载体
在一些实施方式中，多核苷酸以表达盒提供或在表达盒内提供。多核苷酸或表达盒可以包含在表达载体，例如病毒载体中，用于表达由核酸编码的重组和/或异源分子。
1.表达盒
在一些实施方式中，表达盒可包含在启动子控制下并可操作地连接到修饰的pre(例如上述任何一种)的异源和/或重组核酸。表达盒还可以含有一种或多种其它调控元件。除了修饰的pre之外，核酸可以可操作地连接到其他核酸序列，包括但不限于启动子，增强子，其他转录后调节元件，聚腺苷酸化信号，限制酶位点，多克隆位点或编码区段。
a.启动子
在一些实施方式中，表达盒包括可操作地连接至编码重组或异源蛋白质的核酸分子的启动子。启动子可包括由使用者需要的对于表达内容合适的任何启动子。在一些实施方式中，启动子可包括真核或原核来源的启动子，其可提供在多种细胞类型之间的高水平组成型表达并且将足够引导在细胞中编码重组或异源蛋白质的核酸的转录。在一些实施方式中，编码重组或异源蛋白质的核酸是远端定位的序列，其是可操作地连接至启动子序列的5’末端的序列。启动子区域也可包括用于增强或抑制转录的控制元件，并且可根据需要并依赖于情况由使用者修饰。
在一些实施方式中，启动子包含功能为定位rna合成的起始位点的序列。在一些实施方式中，启动子包括tata盒。在一些实施方式中，启动子缺少tata盒，例如，哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和sv40晚基因的启动子。在这种实施方式中，启动子可含有与其起始位点重叠的离散元件，有助于固定启动的位置。其他启动子元件调控转录起始的频率。在一些实施方式中，这些位于起始位点上游30--110bp的区域中，但是几种启动子已经显示在起始位点的下游也含有功能元件。为了将编码序列置于启动子的“控制下”，将其定位于所选择启动子的“下游”(即3′端)的转录阅读框的转录起始位点的5′端。“上游”启动子刺激dna的转录并且促进编码的rna的表达。
在一些实施方式中，启动子元件之间的间隙是柔性的，使得当元件翻转或相对于彼此移动时保留启动子功能。在其中启动子是tk启动子的一些实施方式中，在活性开始减弱之前，启动子元件之间的间距可增加到50bp。取决于启动子，单个元件可协同或单独发挥作用以激活转录。在一些实施方式中，启动子可与“增强子”联用，增强子是指参与核酸序列的转录活性的瞬时作用调控序列。
在一些实施方式中，启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，如可通过分离位于编码片段和/或外显子上游的5′非编码序列获得。这种启动子可称为“内源的”。在一些实施方式中，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于该序列的上游或下游。
或者，在一些实施方式中，编码核酸区段可位于重组和/或异源启动子和/或增强子的控制下，其在天然环境中通常不与编码核酸序列相关。这类启动子或增强子可包括天然与物种内核酸衍生自的其他基因可操作地连接的启动子或增强子，和从其他物种分离的启动子或增强子，如来自其他原核或真核细胞，和非“天然存在”的启动子或增强子，即，其含有不同转录调节区域的不同元件，和/或与自然中任何启动子或增强子中发现的那些相比表达改变的突变。例如，用于重组dna构建的示例性启动子包括，但不限于，β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖、色氨酸(trp)、rna聚合酶(pol)iii启动子包括，人和鼠u6poliii启动子以及人和鼠h1rnapoliii启动子；rna聚合酶(pol)ii启动子；巨细胞病毒立即早期启动子(pcmv)、延长因子-1α(ef-1α)、和劳氏肉瘤病毒长末端重复启动子(prsv)启动子系统。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列以外，可使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括pcrtm)与本文所述的组合物和方法结合来产生序列(参见美国专利号4,683,202和5,928,906，各自通过引用纳入本文)。此外，在一些实施方式中，也可采用在非核细胞器如线粒体、叶绿体等内引序列的转录和/或翻译的控制序列。包括启动子、增强自和其他基因座或转录控制/调控元件的控制序列也被成为“转录盒”。
在一些实施方式中，启动子和/或增强子可操作地连接以有效引导dna区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中表达。分子生物学领域中的技术人员一般已知使用启动子、增强子和细胞类型的组合来表达蛋白(参见，例如，sambrook等，1989，其通过引用纳入本文)。所采用的启动子可以是组成型、组织特异性、诱导型、和/或可用于在合适条件下引导导入的dna片段的高水平表达，这在基因治疗或应用如重组蛋白和/或肽的大规模生产中是有优势的。启动子可以是异源或内源的。
在一些实施方式中，可采用t3、t7或sp6胞质表达系统。如果以递送复合物的部分或额外的基因表达构建体提供合适的细菌聚合酶，真核细胞可支持来自特定细菌启动子的胞质转录。
在一些实施方式中，可使用诱导型启动子。本文所用的“诱导型启动子”是指可响应特定信号调节的转录控制元件。诱导型启动子在结合至转录激活剂时有转录活性，其进而在特定条件组下激活，例如，在特定化学信号组合存在下，其影响转录激活剂与诱导型启动子的结合和/或影响其转录激活剂的功能。因此，诱导型启动子是启动子，其在不存在诱导剂的情况下，不引导诱导型启动子可操作地连接的核酸序列的表达，或引导其低水平表达；或在调节因子存在下显示低水平表达，在该调节因子被去除时，允许来自启动子的高水平表达，例如，tet系统。在诱导剂存在下，诱导型启动子引导增加水平的转录。
在一些实施方式中，四环素-(tet)-可调节系统，其基于大肠杆菌的tet抑制(tetr)对tet操纵子序列(teco)的抑制作用，可经修饰用于哺乳动物系统，并且用作表达盒的可调节元件。这些系统为本领域普通技术人员熟知。(参见goshen和badgered,proc.natl.acad.sci.usa89:5547-51(1992),shockett等，proc.natl.acad.sci.usa92:6522-26(1996),lindemann等，mol.med.3:466-76(1997))。
b.其他调节元件
在一些实施方式中，表达盒还可包括与编码重组蛋白，例如异源蛋白的核酸可操作地连接的增强子。
在一些实施方式中，内部核糖体结合位点(ires)元件可操作地连接至表达盒以产生多基因，或多顺反子信息。ires元件能绕开5’甲基化帽依赖的翻译的核糖体扫描模型，并在内部位置开始翻译(pelletier和sonenberg，1988)。ires元件的非限制性示例包括，但不限于，小rna病毒科(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的ires元件(pelletier和sonenberg，1988)或来自哺乳动物信息的ores(macejak和sarnow，1991)。ires元件可连接至异源开放阅读框。多种开放阅读框可一起转录，各由ires分隔，形成多顺反子信使。通过ires元件，核糖体可接触各开发阅读框从而有效翻译。可使用单启动子/增强子高效表达多个基因以转录单个信息。
在一些实施方式中，载体或构建体将包括至少一个可操作地连接至编码重组蛋白，如异源蛋白的核酸的终止信号。“终止信号”或“终止子”包含参与由rna聚合酶对rna转录物的特异性终止的dna序列。因此，在某些实施方式中，考虑了终止rna转录物的产生的终止信号。在一些实施方式中，可体内使用终止子来实现所需的信息水平。
在包括真核系统的一些实施方式中，终止子区域还可以包含允许新转录物的位点特异性切割以暴露多聚腺苷酸化位点的特异性dna序列。这向专门的内源性聚合酶提供向转录物的3'末端添加约200个a残基延伸(聚a)的信号。用该聚a尾修饰的rna分子看起来更加稳定，并且被更高效地翻译。因此，在涉及真核生物的一些实施方式中，终止子包含用于切割rna的信号。在一些实施方式中，终止子信号促进消息的多聚腺苷酸化。终止子和/或多腺苷酸化位点元件可用于提高信使水平和最小化从所述盒向其他序列的通读。
终止子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于，例如基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如，sv40终止子。在某些实施方式中，终止信号可能缺乏可转录或可翻译序列，例如由于序列截短。
在涉及真核基因表达的一些实施方式中，表达盒可以可操作地连接到多聚腺苷酸化信号以实现转录物的适当多聚腺苷酸化。可以采用任何这样的序列。一些实例包括sv40聚腺苷酸化信号或牛生长激素多聚腺苷酸化信号，方便且已知在各种靶细胞中有良好功能。多聚腺苷酸化可能增加转录物的稳定性，或可能促进胞质运输。
在一些实施方式中，表达盒或载体含有一个或多个复制位点起点(通常称为“ori”)，以便在宿主细胞中繁殖。复制起点是启动复制的特定核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以采用自主复制序列(ars)。
2.病毒载体
在一些实施方式中，在病毒载体内提供修饰的pre、核酸和/或盒。载体内的核酸可以作为启动子控制下的表达盒提供。病毒载体可以用于将核酸分子转移到细胞中以在其中表达异源或重组蛋白。
示例性的病毒载体包括逆转录病毒载体，例如慢病毒或γ逆转录病毒载体，衍生自猿猴病毒40(sv40)、腺病毒和腺相关病毒(aav)的载体。在一些实施方式中，采用逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移进入t细胞(参见例如，koste等，(2014)genetherapy2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；carlens等，(2000)exphematol28(10):1137-46；alonso-camino等，(2013)molthernuclacids2,e93；park等，trendsbiotechnol.2011年11月；29(11):550-557)。由于其将它们的基因整合到宿主基因组中的能力、转化大量的外来遗传物质、感染广谱物种和细胞类型以及在特定细胞系中包装，逆转录病毒可用作递送载体(miller，1992)。
在一些实施方式中，遗传转移通过慢病毒载体完成。与其他逆转录病毒相反，在一些情况下，慢病毒可用于转导某些非分裂细胞。
慢病毒载体的非限制性实例包括衍生自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(hiv-1)，hiv-2，猿免疫缺陷病毒(siv)，人类t淋巴细胞病毒1(htlv-1)，htlv-2或马感染性贫血病毒(e1av)。例如，已经通过多次减弱hiv毒力基因来生成慢病毒载体，例如删除基因env、vif、vpr、vpu和nef使得载体在治疗目的上是安全的。慢病毒载体是本领域熟知的，参见，naldini等，(1996和1998)；zufferey等，(1997)；dull等，1998，美国专利号6,013,516和5,994,136)。在一些实施方式中，这些病毒载体是基于质粒或病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸，用于选择和将核酸转移到宿主细胞中的必要序列。已知的慢病毒可以从诸如美国典型培养物保藏中心(“atcc”；10801universityblvd.，弗吉尼亚州玛纳萨斯，20110-2209)的保藏库或收集物中容易地获得，或者使用常用的技术从已知来源分离。
在一些实施方式中，涉及制备基于病毒的基因递送系统的两个组分：首先，包装质粒，包括结构蛋白以及生成病毒载体颗粒所必需的酶，其次，病毒载体本身，即待转移的遗传物质。可以在设计这些组件中的一个或两个时引入生物安全保障措施。在一些实施方式中，包装质粒可以包含除包膜蛋白以外的所有hiv-1蛋白(naldini等，1998)。在一些实施方式中，病毒载体可以缺乏其他病毒基因，如与毒力相关的病毒基因，例如，vpr，vif，vpu和nef，和/或tat，hiv的主要反式激活因子。在一些实施方式中，用于慢病毒载体(例如基于hiv的慢病毒载体)的包装系统包括共同仅包含亲本病毒的三个基因的单独的包装质粒：gag，pol和rev，其减少或消除了通过重组来重组野生型病毒的可能性。
在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组蛋白的异源核酸，例如作为含有启动子控制下的转基因的表达盒的一部分提供的，包含和/或位于载体基因组的5'ltr和3'ltr序列之间，包括野生型ltr或其部分或嵌合部分。在一些实施方式中，病毒载体，例如hiv病毒载体，缺少其他转录单元。在一些实施方式中，载体基因组可以在用于产生病毒载体rna的dna的3'ltr的u3区域中含有缺失，其可以产生自灭活(sin)载体。然后可以在逆转录过程中将此缺失转移到原病毒dna的5'ltr。在一些实施方式中，u3的启动子和增强子缺失3'ltr。在一些实施方式中，可以消除足够的序列，包括去除tata盒，以消除ltr的转录活性。这可以防止在转导细胞中产生全长载体rna。因此，一些实施方式包括在dna的3'ltr的u3区域中的缺失。在一些实施方式中，这不影响载体的载体效价或载体的体外或体内性质。
在一些实施方式中，病毒载体基因组还可以含有其他遗传元件。可以包括在构造中的元件的类型不受任何限制，并且可以由本领域技术人员选择。在一些实施方式中，载体基因组含有衍生自病毒基因组(例如，慢病毒基因组)的序列，其是促进或提供用于dna或rna合成和加工的识别信号的基因组的非编码区。在一些实施方式中，这样的序列可包括可以参与包装或壳体化、逆转录和转录和/或基因转移或整合的顺式作用序列。在一些实施方式中，作为病毒载体的一部分提供的顺式-激活序列衍生自相同的慢病毒或逆转录病毒样生物体。
在一些实施方式中，可以包括促进靶细胞中病毒基因组进入核的信号。这种信号的一个例子是由作为病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)的pol基因的一部分的cppt和cts组分形成的flap序列(也称为dnaflap序列)。在一些实施方式中，flap序列包括含有cppt和/或cts区域的病毒核酸的一部分，但是其中缺少flap功能所必需的pol基因的5'和3'部分。在一些情况下，病毒载体不含有功能性flap区域。如下所述，在一些实施方式中，病毒载体含有包含缺少cppt和cts区域中的一个或两个的全部或一部分的变体flap的病毒核酸。
在一些实施方式中，慢病毒载体基因组可以含有选自剪接供体位点(sd)、剪接受体位点(sa)和/或rev响应元件(rre)的元件。在一些实施方式中，提供rre以在病毒包装期间作为辅助质粒的一部分提供的rev蛋白结合后将病毒信使rna从细胞核输出到细胞溶胶。在一些实施方式中，载体基因组可以含有psi(ψ)包装信号，其在某些情况下可以衍生自gagorf的n末端片段。在一些实施方式中，可以通过移码突变修饰psi包装信号序列，以便防止gag肽与转基因的可能转录/翻译的任何干扰。
在一些实施方式中，提供了病毒载体，例如慢病毒载体，其包含重组基因组，其在载体基因组的5'和3'ltr序列之间依次包含：rre；包含病毒核酸的多核苷酸，其包含含有控制编码重组蛋白的多核苷酸表达的启动子的上游插入的cts和cppt的功能性dnaflap；含有控制编码重组蛋白的多核苷酸的表达的启动子的转基因，例如上述任何一种和编码重组蛋白的多核苷酸，如抗原受体(如car)；和包含与编码重组蛋白的核酸如本文提供的任何可操作连接的修饰的pre(例如本文提供的任何)的多核苷酸。在一些实施方式中，重组基因组包含序列5'ltr-rre-cppt-cts-转基因-修饰的pre-3'ltr。在一些实施方式中，病毒载体(例如慢病毒载体)中修饰的pre具有seqidno：29-43、59-73、89-118、126-140、156-170或186-215中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，修饰的pre是或包含seqidno：29或seqidno：126所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，cppt和cts作为包含未修饰或野生型dnaflap的病毒核酸序列的片段插入，例如是或包含seqidno：121所示的示例性序列或功能片段，其包含cppt和cts序列。在一些实施方式中，慢病毒载体是hiv-1衍生的慢病毒载体。
在一些实施方式中，包括病毒载体的提供的多核苷酸是含有病毒flap序列变异(被认为是“变体flap”多核苷酸或序列)的那些。这样的多核苷酸包括在多核苷酸内的病毒flap序列内包含一个或多个修饰，例如缺失的那些。所述变体可以包括在多核苷酸的病毒序列内完全缺失flap序列或其子部分。这样的多核苷酸包括含有这种变体flap序列的病毒载体，例如慢病毒载体。
通常，病毒flap序列是含有多核苷酸序列的病毒调节区，所述多核苷酸序列包括两个组分：中心聚嘌呤区(cppt)和中心终止序列(cts)。参见，例如，iglesias等，retrovirology2011,8:92。seqidno：123中提供非限制性的示例性cppt序列。seqidno：124中提供非限制性的示例性cts序列。在示例性野生型hiv-1中，cppt和cts可以可操作地连接约70-100个核苷酸。据报道，cppt和cts位于或围绕慢病毒载体基因组的中心，使得在逆转录之后，由cppt和cts序列编码的dna在基因组中心处形成大约100个核苷酸重叠或“dnaflap”。当插入病毒载体(例如慢病毒衍生的载体)时，允许在逆转录过程中产生dnaflap的多核苷酸刺激基因转移效率并补充输入核的水平至野生型水平。
在一些实施方式中，变体flap多核苷酸含有涉及野生型或未修饰的flap序列的cts、cppt或cts和cppt两者中全部或部分核苷酸的缺失。在一些实施方式中，野生型或未修饰的flap序列的序列是含有衍生自逆转录病毒，例如慢病毒，或来自逆转录病毒样生物体如反转录转座子的cppt和cts的病毒核酸序列。在一些实施方式中，野生型或未修饰的flap的序列来自人逆转录病毒或慢病毒，例如hiv逆转录病毒(例如hiv-1或hiv-2)。在一些实施方式中，野生型或未修饰的dnaflap的序列来自caev(山羊关节炎性脑炎病毒)病毒，eiav(马传染性贫血病毒)病毒，visna病毒，siv(猿猴免疫缺陷病毒)病毒或fiv(猫免疫缺陷病毒)病毒。在一些实施方式中，含有野生型或未修饰的flap的病毒核酸序列可以含有病毒基因组中存在的其他侧翼序列。在一些实施方式中，根据其来源和制备，含有野生型或未修饰的flap的多核苷酸可具有约80至约200个核苷酸的序列。在一些实施方式中，野生型或未修饰的flap序列可以合成制备(化学合成)或通过，例如通过聚合酶链式反应(pcr)从任何逆转录病毒如慢病毒核酸扩增含有flap的多核苷酸。
在一些实施方式中，野生型或未修饰的flap序列可以衍生自hiv-1中存在的多核苷酸序列，例如对应于来自示例性hiv-1载体pnl4-3(genbank号af324493)的位置4757至4935的178碱基对片段或来自位置4746至4935的179碱基对片段，或其中存在的含有cppt和cts的较短或较长序列，其能够在逆转录时产生flap。在一些实施方式中，含有野生型或未修饰的flap的示例性多核苷酸序列是或包含seqidno：121所示的序列，显示与seqidno：121至少85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性或其含有cppt和cts的功能片段，用于在逆转录后产生flap结构。在一些实施方式中，cppt是或包含对应于seqidno：121的核苷酸30-45的序列(seqidno：123所示)，并且cts是或包含对应于seqidno：121的核苷酸117-143的序列(seqidno：124所示)。
在提供的包含变体，例如缺失flap序列的多核苷酸或病毒载体的一些实施方式中，变体flap序列可以是其中载体内的病毒核酸的flap区的全部或部分缺失和/或突变的序列，包括cppt和/或cts的全部或部分。在一些实施方式中，变体flap序列包括完全缺少或基本缺少整个flap序列或其部分的病毒序列。在一些实施方式中，变体flap包含cppt，cts或cppt和cts两者中的缺失。在一些实施方式中，变体flap可包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸缺失的cppt，其与野生型或未修饰的cppt序列相比，如与seqidno：123所示的示例性未修饰的cppt相比较，可以是连续核苷酸缺失。在一些实施例中，cppt可以被完全删除。在一些实施方式中，变体dnaflap可包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、或27个核苷酸缺失的cts，其与野生型或未修饰的cts序列相比，如与seqidno：124所示的示例性未修饰的cts相比较，可以是连续核苷酸缺失。在一些实施例中，cts可以被完全删除。
在一些实施方式中，变体flap多核苷酸包含cppt的全部或连续部分的缺失并含有野生型cts。在一些实施方式中，变体flap多核苷酸包含野生型cppt并含有cts的全部或连续部分的缺失。
在一些实施方式中，变体flap包含cppt的全部或部分的缺失，并且含有cts的全部或部分的缺失。在一些实施方式中，变体dnaflap可含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个核苷酸缺失的cppt，与野生型或未修饰的cppt相比，其可以是连续核苷酸缺失，例如与seqidno：123所示的示例性未修饰的cppt相比，或者可以使cppt完全缺失并含有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、或27个核苷酸缺失，其与野生型或未修饰的cts相比可以是连续的核苷酸缺失，例如与seqidno：124的示例性未修饰的cts相比，或者完全缺失cts。
在一些实施方式中，含有变体flap的多核苷酸是或包含显示与seqidno：121至少65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％或95％的序列相同性，但缺少全部或部分的seqidno:121中存在的cppt和cts的核苷酸序列。在一些实施方式中，含有变体flap序列或多核苷酸的多核苷酸包含或含有具有与seqidno:122至少或约至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列相同性的部分，其中cppt和/或cts的全部或部分缺失。seqidno：122中提供非限制性的示例性变体flap多核苷酸。
在一些实施方式中，将提供的变体flap中的cts和/或cppt中的全部或部分核苷酸的缺失通过重组dna技术引入到含有未修饰或野生型flap的多核苷酸序列中。在一些实施方式中，变体flap多核苷酸是通过合成制备的，例如通过化学合成制备。
在一些实施方式中，多核苷酸，例如病毒载体，含有变体flap序列和pre。在一些实施方式中，pre可以是修饰的pre，例如上述任何一种。因此，在一些实施方式中，多核苷酸含有含有变体flap多核苷酸并含有修饰的pre多核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，这样的多核苷酸和/或病毒载体含有seqidno：122的序列，或含有与seqidno：122至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性，其中cppt和cts的全部或部分被缺失，并且seqidno：29或seqidno：126所示的修饰的pre的序列或具有至少与seqidno：29或seqidno：126至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的序列，其中包含引入的终止密码子修饰。
在一些实施方式中，提供了病毒载体，例如慢病毒载体，其包含重组基因组，其在载体基因组的5'和3'ltr序列之间依次包含：rre；包含病毒核酸的多核苷酸，其包含含有控制编码重组蛋白的多核苷酸表达的启动子的上游插入的cts和cppt的全部或部分缺失的变体dnaflap；含有控制编码重组蛋白的多核苷酸的表达的启动子的转基因，例如上述任何一种和编码重组蛋白的多核苷酸，如抗原受体(如car)；和包含与编码重组蛋白的核酸如本文提供的任何可操作连接的修饰的pre(例如本文提供的任何)的多核苷酸。在一些实施方式中，重组基因组包含序列5'ltr-rre-变体dnaflap-转基因-修饰的pre-3'ltr。在一些实施方式中，病毒载体(例如慢病毒载体)中修饰的pre具有seqidno：29-43、59-73、89-118、126-140、156-170或186-215中任一个所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，修饰的pre是或包含seqidno：29或seqidno：126所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，含有含有变体dnaflap的病毒核酸的多核苷酸是或包含seqidno：122所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，慢病毒载体是hiv-1衍生的慢病毒载体。
在一些实施方式中，可以使用包含提供的变体dnaflap和/或提供的修饰的pre的多核苷酸，例如病毒载体，将编码其中包含的重组或异源蛋白的核酸分子转移到用于转导和表达这种蛋白质的细胞中。在一些实施方式中，虽然仍然导致细胞的成功转导，但是在一些情况下，与使用相同或基本上相似的量或浓度的含有基本上相同的基因组但含有未修饰的或野生型dnaflap序列的相应病毒载体的转导相比(其中存在用于形成dnaflap结构的cppt和cts)，提供的病毒载体的这种转导可以少或降低，例如，高至或高至约1.1倍、1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍或更多。在某些情况下，当需要更高的转导效率时，可通过增加用于转导细胞的病毒载体的体积或浓度增加转导效率。在其他情况下，通过转导的细胞的细胞分选和扩增，可以富集或增加转导的细胞的数量。
在一些实施方式中，载体还可包含用于在宿主细胞，例如原核宿主细胞中繁殖的序列。在一些实施方式中，病毒载体的核酸含有在原核细胞，例如细菌细胞中繁殖的一个或多个复制起点。在一些实施方式中，包含原核生物复制起点的载体也可以含有其表达赋予可检测或选择性标记物例如耐药性的基因。
3.病毒载体颗粒的制备
在一些实施方式中，将编码所需序列的核酸(例如多核苷酸或表达盒)插入病毒基因组中某些病毒序列的位置以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒颗粒，可构建含有gag、pol和env基因但不含ltr和包装组分包装细胞系。也可以在修饰的pre的可操作控制下，采用含有含有编码重组蛋白的核酸的多核苷酸(例如表达盒)的重组质粒。当重组质粒与逆转录病毒ltr以及包装序列的导入特定细胞系中(例如，通过磷酸钙沉淀)时，包装序列可允许重组质粒的rna转录物包装到病毒颗粒中，其然后可分泌到培养基中。在一些实施方式中，然后收集含有重组逆转录病毒的基质，任选地浓缩并用于基因转化。
在一些实施方式中，用含有产生颗粒所必需的组分的一种或多种质粒载体转染包装细胞系。包装细胞系可表达或被动表达必要慢病毒(例如hiv-1)基因以允许产生慢病毒颗粒。这些基因可以由几种质粒表达。在一些实施方式中，使用多个载体来分离产生逆转录病毒载体颗粒的各种遗传成分。在一些这样的实施方式中，向包装细胞提供单独的载体减少了可能产生复制型病毒的重组事件的机会。
在一些实施方式中，可以用含有顺式作用的psi(y)包装序列的慢病毒表达质粒和插入慢病毒ltr之间的转基因转染包装细胞系，以允许靶细胞整合；编码pol、gag、rev和/或tat病毒基因的一个或多个包装质粒，在一些情况下，含有rev-响应元件(rre)和假型分型质粒，例如编码包膜蛋白的质粒，例如水泡性口炎病毒(vsv-g)包膜基因的g蛋白。
在一些实施方式中，用含有病毒载体基因组的包括ltr、顺式作用包装序列和感兴趣的序列，即编码重组蛋白的核酸(例如抗原受体，如car)的质粒，以及编码病毒酶和/或结构组分，例如env，gag，pol和/或rev的若干辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方式中，将包含编码结构和酶组分的gag和pol基因的gagpol包装质粒和含有编码rev调节蛋白的rev基因的rev质粒分别引入包装细胞系。在一些实施方式中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。在一些实施方式中，还可以引入编码env基因的包膜质粒，在一些情况下，可以导致用替代的env蛋白质假型化的病毒颗粒。在一些实施方式中，逆转录病毒载体颗粒，例如慢病毒载体颗粒，被假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，逆转录病毒载体颗粒，例如慢病毒载体颗粒用vsv-g糖蛋白进行假型化，其提供扩展可被转导的细胞类型的宽细胞宿主范围。
env基因可以衍生自任何合适的病毒，如逆转录病毒。在一些实施方式中，env是允许人类和其他物种的细胞转导的兼性包膜蛋白。一些实施方式使用逆转录病毒衍生的env基因，包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(momulv或mmlv)，哈维鼠肉瘤病毒(hamusv或hsv)，鼠乳腺肿瘤病毒(mumtv或mmtv)，长臂猿白血病病毒(galv或galv)，人类免疫缺陷病毒(hiv)和劳斯肉瘤病毒(rsv)。在一些实施方式中，也可以使用其他env基因，例如水泡性口炎病毒(vsv)蛋白g(vsvg)，肝炎病毒和流感病毒。
在一些实施方式中，提供病毒env核酸序列的包装质粒与调节序列(例如启动子或增强子)可操作地连接。一些实施方式中的调节序列可以是任何真核启动子或增强子，包括例如ef1α，pgk，莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件，人巨细胞病毒增强子，痘苗p7.5启动子等。在某些情况下，例如莫洛尼鼠白血病病毒启动子-增强子元件，启动子-增强子元件位于ltr序列内或与ltr序列相邻。在一些实施方式中，调节序列是对构建载体的慢病毒不是内源的序列。因此，如果载体来自siv，则在sivltr中发现的siv调控序列可以被不是源自siv的调节元件取代。
在一些实施方式中，病毒载体和包装质粒通过转染或感染引入包装细胞系。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。转染或感染的方法是众所周知的。非限制性实例包括磷酸钙，deae-葡聚糖和脂质转染方法，电穿孔和显微注射。在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基中回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。因此，一些实施方式中的包装质粒通过这些方法通常与显性选择性标记物如新霉素、dhfr、谷氨酰胺合成酶或ada一起引入人细胞系，随后在合适的药物存在下进行选择，并分离克隆。可选择标记物基因可以与构建物中的包装基因物理连接。
在一些实施方式中，可以通过稳定的细胞系产生病毒载体颗粒，其中包装功能被配置为被表达。合适的包装细胞是已知的，包括例如美国专利no.第5,686,279号；和ory等(1996)。其中掺入有慢病毒载体的包装细胞形成生产细胞。因此，生产细胞是可以产生或释放携带感兴趣基因的病毒载体颗粒的细胞或细胞系。在一些实施方式中，这些细胞可以进一步依赖于锚定，这意味着当附着到诸如玻璃或塑料的表面时，这些细胞将生长、存活或保持功能最佳。在一些实施方式中，生产细胞可以是肿瘤转化的细胞。在一些实施方式中，用于用慢病毒载体和包装质粒转染的宿主细胞包括，例如，哺乳动物原代细胞；建立的哺乳动物细胞系，如cos、cho、hela、nih3t3、293t和pc12细胞；两栖动物细胞，如非洲爪蟾胚胎和卵母细胞；其他脊椎动物细胞；昆虫细胞(例如果蝇)，酵母细胞(例如，酿酒酵母(s.cerevisiae)，粟酒酵母(s.pombe)或巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))和原核细胞(例如，大肠杆菌)。
在一些实施方式中，慢病毒载体可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒在包装细胞系(例如，示例性hek293t细胞系)中产生。转染细胞，例如，hek293t细胞约2天后，细胞上清液含有可用于转导靶细胞的重组慢病毒载体。一旦在靶细胞中，病毒rna被逆转录，导入细胞核并稳定整合到宿主基因组中。病毒rna整合后1或2天，可以检测到重组蛋白的表达。
d.工程改造细胞的方法和生产方法
还提供了生产含有修饰的pre的多核苷酸，和/或包含其的盒、载体和/或工程改造的细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将修饰引入野生型或未修饰的pre序列或另一种起始修饰的pre序列，例如，已知具有特定活性程度的修饰的pre序列。在一些实施方式中，通过使现有载体突变来实现这些修饰。
所述方法还包括通过向细胞中引入含有本文提供的修饰的pre的多核苷酸，其与编码重组分子的核酸(例如重组蛋白，例如异源蛋白，例如抗原受体，如tcr或car，或其他嵌合受体)可操作地连接，来工程改造细胞的那些方法。可以在其基因组中含有提供的多核苷酸的病毒载体颗粒中引入多核苷酸，包括编码重组分子，例如异源蛋白的核酸。还提供了含有具有修饰的pre的多核苷酸，盒和/或载体的细胞，以及含有该pre和/或通过所提供的方法产生的核酸和组合物。
所述细胞一般是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方式中，细胞衍生自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如，骨髓或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，一般是t细胞和/或nk细胞。其他示例性的细胞包括干细胞，如专能(multipotent)和多能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多能干细胞(ipsc)。在一些实施方式中，细胞是原代细胞，如直接从对象分离和/或从对象分离并冷冻的那些细胞。在一些实施方式中，细胞包括t细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如全t细胞群、cd4+细胞、cd8+细胞及其亚群，如由功能、活化状态、成熟、分化潜力、扩增、再循环、定位，和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、特定器官或隔室中的存在、标志物或细胞因子分泌概况，和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的对象，细胞可以是同种异体和/或自体的。方法包括现成的方法。在一些方面中，如对于现成的技术，细胞是多能和/或专能的，如干细胞，如诱导性多能干细胞(ipsc)。在一些实施方式中，该方法包括从对象分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，并且在冷冻保存前或后将其再导入同一患者。
t细胞和/或cd4+和/或cd8+t细胞的亚型和亚群包括：原初t(tn)细胞、效应t细胞(teff)、记忆t细胞及其亚型，例如干细胞记忆t(tscm)、中心记忆t(tcm)、效应记忆t(tem)、或最终分化的效应记忆t细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(til)、不成熟t细胞、成熟t细胞、辅助性t细胞、细胞毒性t细胞、粘膜相关的非变体t(mait)细胞、天然产生的和过继性调节t(treg)细胞、辅助性t细胞，例如th1细胞、th2细胞、th3细胞、th17细胞、th9细胞、th22细胞、滤泡辅助性t细胞、α/βt细胞，和δ/γt细胞。
在一些实施方式中，所述细胞是自然杀伤(nk)细胞。在一些实施方式中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。
遗传工程改造一般包括向细胞中引入多核苷酸，如通过逆转录病毒转导、转染、或转化，如上所述。
在一些实施方式中，基因转移通过如下方式进行：首先，刺激细胞，例如，通过将其与刺激物合并，所述刺激物诱导响应，例如增殖、存活和/或活化，例如，通过细胞因子或活化标志物的表达来检测，然后转导该活化的细胞，并且在培养物中扩增至足以供于临床应用的数量。
在一些情况中，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对对象具有毒性。因此，在一些情况中，工程改造的细胞包括，例如在过继免疫治疗中给予之后，使细胞对体内负选择易感的基因区段。例如在一些方面中，所述细胞经工程改造，从而它们可因它们所给予的对象的体内状况的变化而被消除。可负选择的表型可通过将提供对给予的试剂(例如，化合物)的敏感性的基因来产生。可负选择的基因包括：单纯疱疹病毒i型胸苷激酶(hsv-itk)基因(wigler等，cellii:223，i977)，其提供更昔洛韦敏感性；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)基因，细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(aprt)基因，细菌胞嘧啶脱氨酶(mullen等，proc.natl.acad.sci.usa.89:33(1992))。
在一些方面中，细胞还经工程改造以促进细胞因子或其他因子的表达。用于引入遗传工程改造的组分，例如，抗原受体(例如，car)的各种方法是熟知的，并可采用本文提供的方法和组合物。
在一些实施方式中，通过电穿孔将重组核酸转移进入t细胞(参见例如，chicaybam等，(2013)plosone8(3):e60298和vantedeloo等.(2000)genetherapy7(16):1431-1437)。在一些实施方式中，通过转位将重组核酸转移进入t细胞(参见例如，manuri等(2010)humgenether21(4):427-437；sharma等，(2013)molecthernuclacids2,e74；和huang等，(2009)methodsmolbiol506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染(例如，描述于《分子生物学方案新编》(currentprotocolsinmolecularbiology)，约翰威利父子公司(johnwiley&sons)，纽约州纽约)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(johnston，nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶dna共沉淀(brash等，mol.cellbiol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是描述于，例如，国际专利申请公开号wo2014055668和美国专利号7,446,190的那些。
用于引入的其他核酸(例如基因)包括用以例如通过促进转移的细胞的活力和/或功能改善治疗功效的那些；用以提供遗传标志物以供选择和/或评价细胞的基因，例如以评估体内存活或定位；用以改善安全性的基因，例如，通过使细胞对体内负选择易感，如luptons.d.等，mol.andcellbiol.,11:6(1991)；和riddell等，humangenetherapy3:319-338(1992)所述；也参见lupton的公开号pct/us91/08442和pct/us94/05601等，其描述显性阳性可选择的标志物与阴性可选择的标志物的融合衍生的双功能可选择的融合基因的应用。参见例如riddell等，美国专利号6,040,177，第14-17栏处。
在一些实施方式中，经工程改造的细胞的制备包括一种或多种培养和/或一个或多个制备步骤。用于导入编码修饰的pre的核酸的细胞可从样品(例如生物样品，例如获自或源自对象的样品)分离。在一些实施方式中，从中分离细胞的对象是患有一定疾病或病症或需要细胞治疗或将给予细胞治疗的对象。在一些实施方式中，对象是需要特定治疗性介入的人，例如，需要过继细胞疗法的人，用于该疗法的细胞是经分离、加工和/或经工程改造的。
因此，在一些实施方式中，所述细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。所述样品包括直接取自对象的组织、体液和其它样品，以及获自一个或多个处理步骤，例如分离、离心、遗传工程改造(例如采用病毒载体的转导)、清洗和/或孵育的样品。所述生物样品可以是直接获自生物来源的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于，体液，例如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑膜液、尿液和汗液，组织和器官样品，包括源自它们的经处理的样品。
在一些方面中，从中衍生或分离细胞的样品是血液或血液源性的样品或者，是或源自单采或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(pbmc)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关的淋巴样组织、粘膜相关的淋巴样组织、脾、其它淋巴样组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官，和/或源自其中的细胞。在细胞治疗(例如，过继细胞治疗)的情况中，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方式中，所述细胞源自细胞系，例如，t细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种异体来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类，和猪。
在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或不基于亲和性的细胞分离步骤。在一些实例中，细胞在一种或多种物质的存在下经清洗、离心和/或孵育，例如，以移除不需要的组分，富集所需组分，裂解或移除对具体物质敏感的细胞。在一些实例中，细胞基于一种或多种性质，例如密度、粘附性质、尺寸、对具体组分的敏感性和/或抗性被分离。
在一些实例中，例如，通过单采或白细胞去除术，获得来自对象循环血液的细胞。在一些方面中，所述样品包括淋巴细胞，包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其它有核血液白细胞、血红细胞，和/或血小板，和，在一些方面中包括与血红细胞和血小板不同的细胞。
在一些实施方式中，从所述对象收集的血液细胞经清洗，例如，以移除血浆部分，并将该细胞置于合适的缓冲液或培养基中以供后施处理步骤。在一些实施方式中，所述细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)清洗。在一些实施方式中，清洗溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或全部二价阳离子。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过半自动化的“流通”离心法(例如，cobe2991细胞处理器，百特公司(baxter))完成。在一些方面中，清洗步骤按照生产商说明，通过内切流过滤(tff)完成。在一些实施方式中，在清洗后，所述细胞在多种生物相容缓冲液中重悬，例如，无ca++/mg++pbs。在某些实施方式中，移除血液细胞样品组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方式中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如，通过裂解血红细胞并通过percoll或ficoll梯度离心来从外周血制备血液白细胞。
在一些实施方式中，所述分离方法包括，基于细胞中一种或多种特定分子，例如表面标志物，例如，表面蛋白质、胞内标志物或核酸的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可采用基于此类标志物进行分离的任何已知方法。在一些实施方式中，所述分离是基于亲和性或基于免疫亲和性的分离。例如，在一些方面中，所述分离包括基于细胞的一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性地结合至此类标志物的抗体或结合伴侣孵育，随后通常是清洗步骤，和从尚未结合至所述抗体或结合伴侣的那些细胞分离已结合所述抗体或结合伴侣的细胞。
此类分离步骤可基于正选择，其中已结合所述试剂的细胞被保留用于进一步应用，和/或，负选择，其中尚未结合至所述抗体或结合伴侣的细胞被保留。在一些实例中，两种部分均保留用于进一步应用。在一些方面中，当没有可用于在异质群中特异性地鉴定细胞类型的抗体时，负选择可能是特别有用的，从而分离最好基于通过与所需群不同的细胞表达的标志物进行。
所述分离不需导致具体细胞群或表达具体标志物的细胞的100％的富集或移除。例如，正选择或富集具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，增加所述细胞的数量或百分数，但不需要导致不表达所述标志物的细胞完全不存在。同样地，负选择、移除或消耗具体类型的细胞，例如表达标志物的那些，指的是，减少所述细胞的数量或百分数，但不需要导致所有此类细胞的完全移除。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中，对来自一个步骤的正或负选择的部分进行另一分离步骤，例如后施正或负选择。在一些实例中，单一分离步骤同时消耗表达多重标志物的细胞，例如通过孵育使细胞与各自对负选择靶向的标志物具有特异性的多种抗体或结合伴侣孵育。同样地，可通过将细胞与各种细胞类型上表达的多种抗体或结合伴侣孵育来对多重细胞类型进行同时正选择。
例如，在一些方面中，t细胞的特定亚群，例如一种或多种表面标志物阳性细胞或表达高水平的一种或多种表面标志物的细胞，例如，cd28+、cd62l+、ccr7+、cd27+、cd127+、cd4+、cd8+、cd45ra+和/或cd45ro+t细胞，通过正或负选择技术分离。
例如，cd3+、cd28+t细胞可以采用cd3/cd28连接的磁珠(例如，dyna
在一些实施方式中，分离通过如下方式进行：通过正选择富集具体细胞群或通过负选择消耗具体细胞群。在一些实施方式中，正或负选择通过将细胞与特异性地结合至一种或多种表面标志物的一种或多种抗体或其它结合试剂孵育来完成，所述一种或多种表面标志物分别在正选择或负选择的细胞上表达(标志物+)或以相对较高水平表达(标志物高)。
在一些实施方式中，t细胞通过对在非t细胞(例如b细胞、单核细胞或其它血液白细胞)上表达的标志物(例如cd14)进行负选择来从pbmc样品分离分离。在一些方面中，使用cd4+或cd8+选择步骤来分离辅助性cd4+和cd8+细胞毒性t细胞。通过针对一种或多种原初、记忆和/或效应t细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标志物进行正或负选择，可将此类cd4+和cd8+群进一步分选成亚群。
在一些实施方式中，cd8+细胞针对原初、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞进行进一步富集或消耗，例如通过基于与对应亚群相关联的表面抗原进行正或负选择。在一些实施方式中，进行针对中心记忆t(tcm)细胞的富集，以增加功效，例如以改善长期存活、扩增和/或给予后的植入，在一些方面中，其在此类亚群中特别强健。参见terakura等.(2012)blood.1:72–82；wang等(2012)jimmunother.35(9):689-701。在一些实施方式中，将tcm-富集的cd8+t细胞与cd4+t细胞合并以进一步增强功效。
在实施方式中，记忆t细胞在cd8+外周血淋巴细胞的cd62l+和cd62l-亚组中存在。pbmc可以针对cd62l-cd8+和/或cd62l+cd8+部分进行富集或消耗，例如采用抗cd8和抗cd62l抗体。
在一些实施方式中，针对中心记忆t(tcm)细胞的富集基于cd45ro、cd62l、ccr7、cd28、cd3、和/或cd127阳性或高表面表达；在一些方面中，其基于cd45ra和/或粒酶b表达或高度表达的细胞进行负选择。在一些方面中，针对tcm细胞富集的cd8+群的分离通过如下方式进行：消耗表达cd4、cd14、cd45ra的细胞，和正选择或针对表达cd62l的细胞进行富集。一方面，针对中心记忆t(tcm)细胞的富集通过如下方式进行：由基于cd4表达选择的细胞的阴性部分起始，其基于cd14和cd45ra的表达进行负选择，和基于cd62l进行正选择。在一些方面中，此类选择同时进行，且在其它方面中，此类选择以某一顺序依次进行。在一些方面中，相同的基于cd4表达的选择步骤用于制备cd8+细胞群或亚群，也用以产生cd4+细胞群或亚群，从而保留来自基于cd4分离的阳性和阴性部分，并任选地在一种或多种进一步正或负选择步骤之后，用于所述方法的后施步骤。
在具体实例中，对pbmc样品或其它血液白细胞样品进行cd4+细胞选择，其中保留阴性和阳性部分。然后，基于cd14和cd45ra或cd19的表达对阴性部分进行负选择，并基于中心记忆t细胞特征性标志物，例如cd62l或ccr7、进行正选择，其中，所述正和负选择以某一顺序进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将辅助性cd4+t细胞分选成原初、中心记忆和效应细胞。cd4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方式中，原初cd4+t淋巴细胞是cd45ro-、cd45ra+、cd62l+、cd4+t细胞。在一些实施方式中，中心记忆cd4+细胞是cd62l+和cd45ro+。在一些实施方式中，效应cd4+细胞是cd62l-和cd45ro-。
在一个实例中，为了通过负选择对cd4+细胞进行富集，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr，和cd8的抗体。在一些实施方式中，使所述抗体或结合伴侣结合至固体支持物或基质，例如磁珠或顺磁珠，以允许分离用于正和/或负选择的细胞。例如，在一些实施方式中，所述细胞和细胞群采用免疫磁性(或亲和性磁性)分离技术分开(separated)或分离(isolated)(综述参见《分子医学方法》(methodsinmolecularmedicine)，第58卷：代谢研究方法(metastasisresearchprotocols)，第2卷：细胞体外和体内性能(cellbehaviorinvitroandinvivo)，第17-25页，s.a.brooks和u.schumacher编
在一些方面中，使待分离的样品或细胞组合物与较小的可磁化或磁响应性材料(如磁响应性颗粒或微粒，例如顺磁珠(例如，dynalbeads珠或macs珠))孵育。所述磁响应性材料(例如，颗粒)一般直接或间接连接至结合伴侣(例如，抗体)，其特异性地结合至某一分子，例如，需要分离(例如需要进行负或正选择)的一种或多种细胞或细胞群上存在的表面标志物。
在一些实施方式中，所述磁性颗粒或珠包含磁响应性材料，其结合至特异性的结合部分，例如抗体或其它结合伴侣。有多种熟知的磁响应性材料用于磁性分离方法。合适的磁性颗粒包括描述于molday，美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书ep452342b中的那些，其通过引用纳入本文。胶体定形的颗粒，例如描述于owen美国专利号4,795,698的那些，而liberti等，美国专利号5,200,084是其它实例。
孵育一般在一定条件下进行，由此，所述抗体或结合伴侣或分子，例如二抗或其它试剂，其特异性地结合至所述抗体或结合伴侣，其连接至所述磁性颗粒或珠，特异性地结合至所述样品中的细胞上(如果)存在的细胞表面分子。
在一些方面中，将所述样品置于磁场中，并且，具有与其连接的磁性响应或可磁化颗粒的那些细胞将被磁铁吸引，并与未标记的细胞分离。对于正选择而言，保留被磁铁吸引的细胞；对于负选择而言，保留不被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面中，在相同选择步骤中进行正和负选择的组合，其中，保留阳性和阴性部分，并进一步处理或进行进一步分离步骤。
在某些实施方式中，所述磁响应性颗粒在一抗或其它结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中被覆。在某些实施方式中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标志物具有特异性的一抗的覆层连接至细胞。在某些实施方式中，所述细胞，而非珠，用一抗或结合伴侣标记，然后，添加细胞类型特异性的二抗或其它结合伴侣(例如，链霉亲和素)被覆的磁性颗粒。在某些实施方式中，链霉亲和素被覆的磁性颗粒与生物素化一抗或二抗联用。
在一些实施方式中，使所述磁响应性颗粒保留连接至待经后施孵育、培养和/或工程改造的细胞；在一些方面中，保留所述颗粒连接至用于给予患者的细胞。在一些实施方式中，从所述细胞移去可磁化的或磁响应性颗粒。用于从细胞移去可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括，例如，采用竞争性非标记的抗体、和可磁化颗粒或连接至可切割接头的抗体。在一些实施方式中，所述可磁化颗粒是生物可降解的。
在一些实施方式中，所述基于亲和性的选择通过磁性活化的细胞分选(macs)(加利福尼亚奥本的美天旎生物技术公司(miltenyibiotech))进行。磁性活化的细胞分选(macs)系统能够高纯度选择其上连接有磁化的颗粒的细胞。在某些实施方式中，macs以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后，依次洗脱非靶标和靶标物质。即，使附接至磁化的颗粒的细胞保持在原位，而洗脱未附接的物质。然后，在该第一洗脱步骤完成后，将滞留在磁场中且防止被洗脱的物质以某种方式解放，从而它们可以被洗脱和回收。在某些实施方式中，所述非靶细胞带标记并从异质细胞群消耗。
在某些实施方式中，所述分离(isolation)或分开(separation)采用进行所述方法的分离、细胞制备、分离、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一种或多种的系统、装置或设备来进行。在一些方面中，所述系统用以在封闭或为空菌环境中进行这些步骤中的各个步骤，例如，以使错误、用户处理和/或污染最小化。在一个实例中，所述系统是国际专利申请公开号wo2009/072003或us20110003380a1中描述的系统。
在一些实施方式中，所述系统或设备在整合或独立系统中，和/或以自动化的或可编程的形式，进行分离、处理、工程改造和配制步骤中的一个或多个，例如，全部。在一些方面中，所述系统或设备包括与所述系统或设备信息连通的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估处理、分离、工程改造和配制步骤的结果，和/或调节处理、分离、工程改造和配制步骤的各方面。
在一些方面中，进行所述分离和/或其它步骤使用clinimacs系统(美天旎生物技术公司(miltenyibiotic))进行，例如，以供在封闭和无菌系统中进行临床级别水平的细胞的自动化分离。组件可包括整合的微型计算机、磁性分离单元、蠕动泵，和各种夹管阀。在一些方面中，整合的计算机控制所述仪器的所有组件，并指示所述系统以标准化的顺序进行重复的步骤。在一些方面中，所述磁性分离单元包括可移动的永久磁铁和用于所述选择柱的支持物(holder)。所述蠕动泵控制通过管组的流速，并且，与夹管阀一起，确保通过所述系统的缓冲液的受控流和细胞的连续悬液。
在一些方面中，clinimacs系统使用以无菌、无热源溶液的形式提供的抗体-偶联的可磁化颗粒。在一些实施方式中，在用磁性颗粒标记细胞之后，所述细胞经清洗以移除过量的颗粒。然后，将细胞制备袋连接至管组，其进一步连接至包含缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预组装的无菌管道组成，包括前置柱和分离柱，并且仅用于单一使用。在分离程序起始之后，所述系统自动化地将所述细胞样品施加至分离柱上。使带标记的细胞保留在柱中，而通过一系列清洗步骤移除未标记的细胞。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是未标记的，并且不被保留在柱中。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群是经标记的，并且被保留在柱中。在一些实施方式中，在移除磁场之后，从所述柱洗脱用于本文所述方法的细胞群，并收集在细胞收集袋中。
在一些实施方式中，分离和/或其它步骤采用clinimacsprodigy系统(美天旎生物技术公司)进行。在一些方面中，clinimacsprodigy系统装配有细胞处理单元，所述细胞处理单元允许自动化清洗和通过离心分级分离细胞。clinimacsprodigy系统还可包括内置摄像机和图像识别软件，其通过识别来源细胞产物的肉眼可见层来确定最优选细胞分级分离终点。例如，外周血可被自动化地分离成红细胞、血液白细胞和血浆层。clinimacsprodigy系统还可包括整合的细胞培育腔室，其完成细胞培养方案，例如，细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且细胞可采用整合显微镜来监测。参见例如klebanoff等.(2012)jimmunother.35(9):651–660,terakura等.(2012)blood.1:72–82,和wang等.(2012)jimmunother.35(9):689-701。
在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过流式细胞术收集和富集(或消耗)，其中针对多重细胞表面标志物被染色的细胞携载于流体中。在一些实施方式中，本文所述的细胞群通过制备规模(facs)-分选法收集和富集(或消耗)。在某些实施方式中，本文所述的细胞群通过采用微电机系统(mems)芯片联合基于facs的检测系统来收集和富集(或消耗)(参见例如，wo2010/033140，cho等(2010)labchip10，1567-1573；和godin等(2008)jbiophoton.1(5):355–376。在这两种情况中，细胞可以用多重标志物标记，以允许以高纯度分离明确界定的t细胞亚组。
在一些实施方式中，所述抗体或结合伴侣用一种或多种可检测标志物标记，以促进用于正和/或负选择的分离。例如，分离可基于与荧光标记的抗体的结合。在一些实例中，将基于抗体或对一种或多种细胞表面标志物具有特异性的其它结合伴侣的结合所进行的细胞分离携载于流体流中，例如通过荧光活化的细胞分选(facs)(其包括制备规模(facs)和/或微电机系统(mems)芯片)，例如，与流式细胞术检测系统联合。此类方法允许进行基于多重标志物的同时正和负选择。
在一些实施方式中，制备方法包括：冷冻步骤，例如，在分离、孵育和/或工程改造之前或之后，冻存所述细胞。在一些实施方式中，所述冷冻和后施融化步骤移除粒细胞，并且，在某种程度上，移除细胞群中的单核细胞。在一些实施方式中，例如，在清洗步骤以移除血浆和血小板之后，将所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面中，可采用任何各种已知冷冻溶液和参数。一个实例涉及采用包含20％dmso和8％人血清白蛋白(has)的pbs或其它合适的细胞冷冻培养基。然后，其用培养基1:1稀释，从而dmso和hsa的终浓度分别是10％和4％。然后，一般以1°/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃，并贮存在液氮储罐的汽相中。
在一些实施方式中，提供的方法包括培育、孵育、培养，和/或遗传工程改造步骤。例如，在一些实施方式中，提供了用于对消耗的细胞群和培养起始组合物进行孵育和/或工程改造的方法。
因此，在一些实施方式中，所述细胞群在培养起始组合物中孵育。可在培养器皿，如单元、腔室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培育细胞的其它容器中进行孵育和/或工程改造。
在一些实施方式中，在遗传工程改造之前或与遗传工程改造一起孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、培育、刺激、活化，和/或增殖。在一些实施方式中，在刺激条件或刺激性试剂存在下孵育细胞或组合物。这类条件包括设计成在群中诱导细胞增殖、繁殖、活化，和/或存活以模拟抗原接触，和/或引发细胞用于遗传工程改造，如用于导入重组抗原受体的那些。
所述条件可包括如下一种或多种：具体培养基、温度、含氧量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如，营养物、氨基酸、抗生素、离子，和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体，和经设计以活化细胞的任何其它物质。
在一些实施方式中，刺激条件或试剂包括一种或多种物质，例如，配体，其能够活化tcr复合物的胞内信号转导结构域。在一些方面中，所述物质开启或启动t细胞中的tcr/cd3胞内信号转导级联。此类物质可包括抗体，例如对tcr组分和/或共刺激受体具有特异性的那些，例如，抗cd3、抗cd28，例如，其结合至固体支持物，例如珠，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可包括如下步骤：向培养基(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗cd3和/或抗cd28抗体。在一些实施方式中，刺激剂包括1l-2和/或il-15，例如，至少约10单位/ml浓度的il-2。
在一些方面中，孵育按照一些技术，例如授予riddell等的美国专利号6,040,177，klebanoff等.(2012)jimmunother.35(9):651–660,terakura等.(2012)blood.1:72–82和/或wang等.(2012)jimmunother.35(9):689-701中所述的那些进行。
在一些实施方式中，t细胞群通过如下方式扩增：添加至培养起始组合物饲养层细胞，例如非分裂型外周血单核细胞(pbmc)，(例如，从而针对待扩增的初始群中的各t淋巴细胞，所得细胞群包含至少约5、10、20或40或更多pbmc饲养层细胞)；并孵育所述培养物(例如足以扩增所述数量的t细胞的时间)。在一些方面中，所述非分裂型饲养层细胞可包括γ-辐照的pbmc饲养层细胞。在一些实施方式中，所述pbmc用约3000-3600拉德范围内的γ射线辐照以防止细胞分裂。在一些方面中，所述饲养层细胞在添加t细胞的群之前添加至培养基。
在一些实施方式中，所述刺激条件包括适于人t淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，一般至少约30度，且一般是或约是37摄氏度。任选地，孵育还可包括添加非分裂型ebv-转化的类淋巴母细胞(lcl)作为饲养层细胞。lcl可以用约6000-10000拉德范围内的γ射线辐照。在一些方面中，lcl饲养层细胞以任何合适的量提供，例如lcl饲养层细胞与初始t淋巴细胞的比率是至少约10:1。
在实施方式中，通过用抗原刺激天然或抗原特异性t淋巴细胞来获得抗原特异性t细胞，如抗原特异性cd4+和/或cd8+t细胞。例如，抗原特异性t细胞系或克隆可针对巨细胞病毒抗原产生，通过从感染的对象分离t细胞并采用相同抗原体外刺激细胞来进行。
ii.组合物、方法和应用
a.药物组合物和制剂
还提供了包含多核苷酸、已经引入该多核苷酸或含有该多核苷酸的盒、病毒颗粒和/或细胞的组合物。在一些实施方式中，提供了含有已经工程改造以通过转导方法表达重组蛋白的细胞的药物组合物，采用含有其的任何提供的载体或病毒颗粒。组合物包括用于给药的细胞的组合物，包括药物组合物和制剂，如来自包含给定剂量或其部分的用于给药的细胞数量的单位剂型组合物。所述药物组合物和制剂一般包括一种或多种任选的药学上可接受的运载体或赋形剂。在一些实施方式中，所述组合物包括至少一种其它治疗剂。
术语“药物制剂”指此类形式的制剂：所述制剂允许其中所含活性成分的生物学活性有效，并且不含具有待给予该制剂的对象不可接受的毒性的额外成分。
“药学上可接受的运载体”指，药物制剂中的一种成分，其不是活性成分，其对于对象无毒性。药学上可接受的运载体包括但是不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面中，运载体的选择部分由特定细胞和/或给药方法来确定。因此，存在多种合适的配方。例如，所述药物组合物可包含防腐剂。合适的防腐剂可包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，采用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物的存在量通常是约0.0001％至约2％(以组合物总重量计)。运载体描述于，例如，《雷明顿药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences)，第16版，osol,a.编(1980)。在所用剂量和浓度下，药学上可接受的运载体通常是对受者无毒的，包括但不限于：缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。
在一些方面中，所述组合物包含缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他酸和盐。在一些方面中，采用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物的存在量通常是约0.001％至约4％(以组合物总重量计)。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法具体描述于，例如，《雷明顿：药物科学与实践》(remington：thescienceandpracticeofpharmacy)，lww公司(lippincottwilliams&wilkins)；第21版(2005年5月1日)。
该制剂可包含水溶液。所述制剂或组合物还可包含多于一种活性成分，该活性成分可用于待用所述细胞治疗的特定适应症、疾病或病症，优选对所述细胞具有补充活性的那些，其中相应活性剂彼此不产生负面影响。这类活性成分适合以有效用于所需目的的用量联合存在。因此，在一些实施方式中，所述药物组合物还包含其它药学活性物质或药物，例如化疗剂，例如，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，顺铂，柔红霉素，多柔比星，氟尿嘧啶，吉西他滨，羟基脲，甲氨蝶呤，紫杉醇，利妥昔单抗，长春碱，和/或长春新碱。
在一些实施方式中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量，如治疗有效或预防有效量的细胞。在一些实施方式中，通过定期评估治疗的对象来监测治疗或预防性功效。所需剂量可以通过单药丸给予所述细胞，通过多药丸给予所述细胞或通过连续输注给予细胞来递送。
在一些实施方式中，该组合物包含有效降低疾病或病症负荷的量，和/或在对象中不导致crs或严重crs的量和/或实现本文所述的方法的任何其他结果的量的细胞。
该细胞和组合物可采用标准给予技术、制剂和/或装置给予。所述细胞的给予可以是自体同源或异种的。例如，免疫抑制细胞或祖细胞可获自一个对象，并给予相同对象或不同的相容对象。外周血衍生的免疫抑制细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可通过局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射、或胃肠外给药。当给予治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫抑制细胞的药物组合物)时，其通常被配制成单位剂型的可注射形式(溶液、悬液、乳液)。
制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌肉内、鼻内、粘膜、舌下或栓剂给药的那些。在一些实施方式中，所述细胞群胃肠外给予。腹膜外输注可包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、胸内、颅内和/或皮下给予。在一些实施方式中，通过单次推注给予细胞来给予给定剂量。在一些实施方式中，所述细胞通过静脉内，腹膜内或皮下注射采用外围全身递送给予对象。
在一些实施方式中，组合物以无菌液体制剂的形式提供，例如，等渗水性溶液、悬液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面中可缓冲至选择的ph。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物多少更便于给药，尤其是通过注射。在另一方面，粘性组合物可在合适的粘度范围内配制以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包括运载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多羟基化合物(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适混合物。
可通过将所述细胞纳入溶剂中，如与合适运载体、稀释剂、或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等来制备无菌可注射溶液。组合物可含有辅助性物质，如润湿、分散、或乳化剂(例如，甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、风味剂、和/或色素，取决于所需的给药和制备途径。在一些方面中，可查阅标准教科书来制备合适制备物。
可添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。也可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、和山梨酸确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的物质，如单硬脂酸铝和明胶演唱可注射药物形式的吸收。
用于体内给药的制剂一般为无菌的。无菌可例如通过无菌滤膜过滤来容易地实现。
b.治疗和预防方法和用途
提供了使用提供的多核苷酸，含有其的盒、载体、细胞，由其编码的蛋白质和其他分子，如其中由核酸编码的重组或异源分子是重组受体，如抗原受体，例如，car或tcr的那些来治疗对象中的疾病并病症的方法。在一些实施方式，提供的方法包括向患有疾病或病症的对象给予提供的细胞或细胞群，或其药物组合物，其已通过采用含有其的任何提供的载体或病毒颗粒的转导方法经工程改造以表达重组蛋白。还提供了采用提供的细胞或细胞群，或其组合物治疗对象中疾病或病症的组合物和用途，该细胞或细胞群经工程改造以含有重组受体，如抗原受体，例如，car或tcr。
在一些实施方式中，治疗或预防的疾病或病症是癌症、自身免疫疾病、和/或感染性疾病，如病毒疾病，和/或是一种或多种其他疾病、病症和/或紊乱。
在一些实施方式中，将所述细胞、组合物、和/或多核苷酸，例如，载体给予具有具体待治疗(例如，通过过继细胞治疗，例如过继t细胞治疗)的疾病或病症的对象或患者。在一些实施方式中，将通过本文提供的方法制备的细胞和组合物，例如在孵育和/或其它处理步骤之后工程改造的组合物和生产终末组合物，给予对象，例如具有所述疾病或病症或有风险患上所述疾病或病症的对象。在一些方面中，所述方法由此治疗，例如，减轻所述疾病或病症的一种或多种症状，例如通过减小表达由工程改造的t细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷。
在提供的方法或用途中，重组或异源蛋白可包含重组受体，如抗原受体，例如，car或tcr，其特异性结合至由疾病或病症或者其细胞或组织表达的配体。例如，在一些实施方式中，受体是抗原受体，并且配体是对疾病或病症特异的和/或与之相关的抗原。
用于给予用于过继细胞治疗的细胞的方法是已知的，并可与本文提供的方法和组合物联用。例如，过继t细胞治疗方法描述于，例如，gruenberg等的美国专利申请公开号2003/0170238；rosenberg的美国专利号4,690,915；rosenberg(2011)natrevclinoncol.8(10):577-85)。参见例如themeli等.(2013)natbiotechnol.31(10):928-933；tsukahara等.(2013)biochembiophysrescommun438(1):84-9；davila等.(2013)plosone8(4):e61338。
在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继t细胞治疗，通过如下方式进行：自体转移，其中，所述细胞经分离和/或在其它情况中从接受所述细胞治疗的对象或从源自此类对象的样品制备。因此，在一些方面中，所述细胞源自需要治疗和所述细胞的对象(例如，患者)，其在分离和处理之后给予同一对象。
在一些实施方式中，所述细胞治疗，例如，过继t细胞治疗，通过如下方式进行：同种异体转移，其中，所述细胞分离和/或在其它情况中从对象制备，该对象与待接受或最终接受所述细胞治疗的对象(例如，第一对象)不同。在此类实施方式中，然后将所述细胞给予相同物种的不同对象，例如，第二对象。在一些实施方式中，所述第一和第二对象是遗传学相同的。在一些实施方式中，所述第一和第二对象是遗传学相似的。在一些实施方式中，所述第二对象表达与第一对象相同的hla类别或超类型。
向其给予所述细胞、细胞群或组合物的对象(例如，患者)是哺乳动物，并且通常是灵长类，例如人。在一些实施方式中，所述灵长类是猴子或猿。所述对象可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿，少年，青少年，成人，和老年对象。在一些实施方式中，所述对象是非灵长类哺乳动物，例如啮齿类。在一些示例中，患者或对象是针对疾病、过继细胞治疗，和/或评价毒性结果如细胞因子释放综合征(crs)的验证的动物模型。
所述疾病、病症和紊乱包括肿瘤，包括实体肿瘤、血液恶性肿瘤，和黑素瘤，以及感染性疾病，例如病毒或其它病原体，例如，hiv，hcv，hbv，hpv，cmv的感染，和寄生性疾病。在一些实施方式中，所述疾病或病症是肿瘤，癌症，恶性肿瘤，赘生物，或其它增殖性疾病。所述疾病包括但不限于：白血病、淋巴瘤、例如、慢性淋巴细胞白血病(cll)、all、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治滤泡性淋巴瘤淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性b细胞淋巴瘤、b细胞恶性瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌(包括黑素瘤)、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、尤文肉瘤、成神经管细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤，和/或间皮瘤。
在一些实施方式中，所述疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于，病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(cmv)、eb病毒(ebv)、腺病毒、bk多瘤病毒。在一些实施方式中，所述疾病或病症是自体免疫或炎性疾病或病症，例如关节炎，例如类风湿性关节炎(ra)，i型糖尿病，系统性红斑狼疮(sle)，炎性肠病，牛皮癣，硬皮病，自身免疫性甲状腺疾病，格雷夫斯病，克罗恩病多发性硬化，哮喘和/与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方式中，与所述疾病或紊乱相关的抗原选择自下组：孤儿酪氨酸激酶受体rorl、tegfr、her2、ll-cam、cd19、cd20、cd22、间皮素、cea、和肝炎b表面抗原、抗叶酸受体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、egfr、egp-2、egp-4、0epha2、erbb2、3、或4、fbp、胎儿乙酰胆碱e受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、κ轻链、lewisy、l1-细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、癌胚抗原、ror1、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性抗原、psma、her2/neu、雌激素受体、孕酮受体、酪氨酸蛋白激酶b2、cd123、cs-1、c-met、gd-2，和magea3、ce7、维尔姆斯瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白如细胞周期蛋白a1(ccna1)和/或生物素化分子，和/或由hiv、hcv、hbv或其它病原体表达的分子。
本文所用的“转录后调节元件(pre)”，如肝炎pre，是指dna序列，其在转录时产生能够显示转录后活性以增强或促进与其可操作地连接的相关基因的表达的三级结构。
本文所用的“转录后活性”是指调节元件在rna水平上控制或调节基因表达的活性。转录后活性可由促进rna从核输出，提供细胞蛋白质的结合位点，增加rna(例如，重组和/或异源rna，转录物)的总量，增加rna稳定性，增加多聚腺苷酸化的转录物的数量和/或增加这类转录物中多聚腺苷酸化尾的大小的活性来表现。
本文所用的“可操作地连接”是指组件，如dna序列，例如，异源核酸和调节序列以允许在合适的分子(例如，转录活化蛋白)结合至调节序列时的基因表达的方式的结合。因此，这意味着所述的组分处于允许它们以目标方式发挥功能的关系中。
本文针对pre、x基因或flap序列所用的“未修饰”是指选择用于提供的修饰的起始多核苷酸。起始多核苷酸可以是多核苷酸的天然产生的，野生型形式。在一些实施方式中，起始多核苷酸可被改变或突变，使得其与天然野生型不同，但仍然是指相对于提供的后续修饰的多核苷酸的起始未修饰的多核苷酸。未修饰的多核苷酸在其序列中不含提供的修饰(例如，终止密码子、提供的cppt或cts的全部或部分的缺失或降解序列)。在一些实施方式中，未修饰的核酸，例如，pre，是已知具有或限制所需程度的功能性或活性的核酸，如具有已知程度的转录后活性，例如，增强基因表达的能力的pre。未修饰的pre序列的示例是seqidno：1、12-27、119、120、125或216中所示的那些。未修饰的flap序列的示例示于seqidno：121。
本文针对pre或x基因使用的“野生型”是指衍生自pre或x基因的天然产生的核酸序列的序列，其存在于病毒或病毒基因组，如嗜肝dna病毒，例如，正嗜肝dna病毒(orthohepandanvirus)，如在自然中从哺乳动物分离的嗜肝dna病毒。针对野生型而不针对物种，旨在含有包括从任何物种分离的x基因的病毒序列。野生型pre或x基因的示例是具有获自或与嗜肝dna病毒，包括在哺乳动物物种，如人、灵长类、或松鼠，例如土拨鼠中发现或分离的任何嗜肝dna病毒中存在的pre或x基因序列相同的序列的核酸序列。野生型pre的示例是seqidno:1、12-27或125中所示的那些。
本文针对flap序列所用的“野生型”是指衍生自天然产生的病毒核酸序列的序列，其含有cppt和cts区域用于形成存在于病毒或病毒基因组，如逆转录病毒，例如，慢病毒，如hiv-1的dnaflap。野生型flap序列的示例是具有获自或是与含有逆转录病毒，包括慢病毒(例如，hiv-1)中存在的cppt和cts区域的病毒核酸序列相同的序列的核酸序列的任何序列。含有野生型dnaflap序列的病毒核酸的示例示于seqidnos:121。
当本文中针对核苷酸序列(参考核苷酸序列)使用“序列相同性百分率(％)”和“相同性百分率”时，定义为候选序列(对象pre或x基因，如修饰的pre或变体x基因)中与参考序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分率，在比对序列和引入间隙，如果需要，以实现最大百分比序列相同性之后。以测定序列相同性百分率为目的比对可以本领域技术范围内的不同方式实现，例如，使用公共渠道可获得的计算机软件如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员能够确定用于比对序列的合适参数，包括使比较的序列实现全长最大对齐所需的任何算法。
本文中所用的，“在对应于……的位置”或述及核苷酸、氨基酸位置或区域“对应于”公开(例如示于序列表中)的序列中的核苷酸、氨基酸位置或区域，是指在含有采用标准比对算法(例如gap算法)与该公开序列比对至最大相同性时鉴定的核苷酸或氨基酸的位置或者含有核苷酸或氨基酸的区域或结构域。可通过将序列与seqidno:1(或seqidno:125，其是seqidno:1的残基1-589)所示的示例性pre序列比对来鉴定示例性描述的相应残基或区域。通过比对序列，本领域技术人员能够鉴定对应残基，例如，采用保守和相同氨基酸残基作为导向来鉴定。一般而言，为了鉴定对应位置，将氨基酸序列比对，从而得到最高程度的匹配(参见，例如：《计算机分子生物学》(computationalmolecularbiology)，lesk,a.m.编，纽约，牛津大学出版社，1988；《生物运算：信息学和基因组工程》(biocomputing:informaticsandgenomeprojects)，smith,d.w.编，学术出版社，纽约，1993；《序列数据的计算机分析》(computeranalysisofsequencedata)，部分i，griffin,a.m.，和griffin,h.g.编，新泽西州胡马纳出版公司，1994；《分子生物学的序列分析》(sequenceanalysisinmolecularbiology)，vonheinje,g.，学术出版社，1987；和，《序列分析引物》(sequenceanalysisprimer)，gribskov,m.和devereux,j.编，m斯托克顿出版社，纽约，1991；carrillo等.(1988)siamjappliedmath48:1073)。图2a-2e例示了示例性的相应残基的鉴定和比对。
本文所用术语“载体”指一种核酸分子，所述核酸分子能够增殖其连接的另一核酸。该术语包括自复制核酸结构形式的载体，以及被导入已将其导入的宿主细胞基因组的载体。某些载体能够引导与其操作性连接的核酸的表达。所述载体在本文中称为“表达载体”。载体包括病毒载体，如慢病毒载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化株”和“转化细胞”，其包括最初转化的细胞及其衍生的子代，不计传代次数。子代的核酸含量可不与亲本细胞完全相同，并可包含突变。本文包括功能或生物活性与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物活性相同的突变子代。
如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非文本中另有明确说明。例如，“一种”或“一个”指“至少一种或一个”或“一种(个)或多种(个)”。应理解本文中所述的方面和变化形式包括：“由(这些方面和变化形式)组成”和/或“基本由(这些方面和变化形式)组成”。
本公开内容中，请求保护的主题的各个方面均以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述的或中间的值均被包括在要求保护的主题内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于请求保护的主题的范围，除非明确地排除所述范围的上下限。设定范围包含一个或两个限值时，请求保护的主题也包括排除所述限值之一个或两个的范围。这适用而无关范围的宽度。
本文使用的术语“约”是指本技术领域技术人员容易知晓的各值的通常误差范围。本文中述及“约”值或参数，包括(并描述)指向该值或参数本身的实施方式。例如，关于“约x”的描述包括“x”的描述。
本文中所用的组合物指，两种或更多种产物、物质或化合物，包括细胞，的任何混合物。其可以是溶液、悬液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
本文中所用的“对象”是哺乳动物，例如人或其它动物，并且通常是人。
除非另外定义，本文使用的所有专业术语、符号和其它技术和科学术语或专有词汇旨在具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。在一些情况中，本文出于阐明和/或便于引用目的对具有常规理解含义的术语加以限定，本文中包括此类限定不应理解为表示与本领域常规理解的有显著差异。
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本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。
iii.示例性实施方式
本文中提供的实施方式包括：
1.一种多核苷酸，其包含：
编码重组蛋白的核酸；
与所述核酸可操作地连接的修饰的转录后调节元件(pre)，所述修饰的pre包含野生型或未修饰的肝炎病毒x基因的变体，所述变体x基因包含不存在于野生型或未修饰的x基因中的终止密码子。
2.如实施方式1所述的多核苷酸，其中所述终止密码子包含至少一个选自以下的终止密码子：
在对应于野生型x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的所述变体x基因中的位置的3’方向上36或24个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子；和/或
在对应于seqidno:1或seqidno:125所示的whv转录后调节元件(wpre)序列的残基411和/或seqidno:2所示的whv序列的残基1503的位置的3’方向上36或24个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子。
3.如实施方式1或实施方式2所述的多核苷酸，其中所述变体x基因不包含长度超过或约39个核苷酸或长度超过或约27个核苷酸的开放阅读框。
4.一种多核苷酸，包含修饰的转录后调节元件(pre)，所述修饰的pre包含野生型或未修饰的肝炎病毒x基因的变体，所述变体x基因包含不存在于野生型或未修饰的x基因的终止密码子，其中所述终止密码子包含至少一个选自以下的终止密码子：
在对应于野生型x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的所述变体x基因中的位置的3’方向上32或30个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子；和/或
在对应于seqidno:1或seqidno:125所示的whv转录后调节元件(wpre)序列的残基411和/或seqidno:2所示的whv序列的残基1503的变体x基因中的位置的3’方向上32或30个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子。
5.如实施方式4所述的多核苷酸，其中所述变体x基因包含长度小于或等于33个核苷酸的开放阅读框。
6.如实施方式1-5中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子包含多个终止密码子。
7.如实施方式6所述的多核苷酸，其中所述多个终止密码子在所述变体x基因中存在的各阅读框中包含至少一个终止密码子和/或在相同阅读框中包含至少2个终止密码子。
8.一种多核苷酸，其包含修饰的转录后调节元件(pre)，所述修饰的pre包含野生型或未修饰的肝炎病毒x基因的变体，所述变体x基因包含不存在于野生型或未修饰的x基因中的多个终止密码子。
9.如实施方式8所述的多核苷酸，其中所述多个终止密码子包含至少一个选自以下的终止密码子：
在对应于野生型x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的所述变体x基因中的位置的3’方向上36、30或24个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子；和/或
在对应于seqidno:1或seqidno:125所示的whv转录后调节元件(wpre)序列的残基411和/或seqidno:2所示的whv序列的残基1503的变体x基因中的位置的3’方向上36、30或24个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子。
10.如实施方式9所述的多核苷酸，其中所述变体x基因不含长度超过或约39个核苷酸，长度超过或约33个核苷酸，或长度超过或约27个核苷酸的开放阅读框。
11.如实施方式8-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因包含至少2个终止密码子、至少3个终止密码子或至少4个终止密码子。
12.如实施方式8-11中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因在存在于所述变体x基因中的每个阅读框中包含终止密码子。
13.如实施方式4-12中任一项所述的多核苷酸，还包含编码与所述修饰的pre可操作地连接的重组蛋白的核酸。
14.如实施方式1-13中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子包含至少一个选自以下的终止密码子：
在对应于野生型或未修饰的x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的所述变体x基因中的位置的3’方向上9、12、15、或18个核苷酸以内或至少9、12、15、或18个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子；和/或
在对应于seqidno:1所示的whv转录后调节元件(wpre)序列的残基411和/或seqidno:2所示的whv序列的残基1503的变体x基因中的位置的3’方向上9、12、15、或18个核苷酸以内或至少9、12、15、或18个核苷酸以内的位置处开始的终止密码子。
15.如实施方式14所述的多核苷酸，其中所述变体x基因不包含长度超过或约21个核苷酸，长度超过或约18个核苷酸，长度超过或约15个核苷酸，或长度超过或约12个核苷酸的开放阅读框。
16.如实施方式1-15中任一项所述的多核苷酸，其中：
所述修饰的pre含有对应于seqidno:1或seqidno:125的核苷酸残基448-470的β茎环；和/或
所述修饰的pre不含对应于seqidno:1或seqidno:125的核苷酸448-470的β茎环内的位置中的核苷酸变化；和/或
所述一个或多个终止密码子不包含对应于seqidno:1或seqidno:125的核苷酸448-470的β茎环内的位置中的核苷酸。
17.如实施方式1-16中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子选自琥珀(tag)、赭石(taa)、或乳白(tga)终止密码子。
18.如实施方式1-17中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子由核苷酸取代、缺失或插入引入。
19.如实施方式1-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子选自：
在对应于野生型或未修饰的x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的位置9处开始的和/或对应于seqidno:1或seqidno:125所示的序列中的位置420的核苷酸位置处开始的终止密码子；
在对应于野生型或未修饰的x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的位置13处开始的和/或对应于seqidno:1或seqidno:125所示的序列中的位置424的核苷酸位置处开始的终止密码子；
在对应于野生型或未修饰的x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的位置17处开始的和/或对应于seqidno:1或seqidno:125所示的序列中的位置428的核苷酸位置处开始的终止密码子；
在对应于野生型或未修饰的x蛋白开放阅读框的起始密码子的5’位置的变体x基因中的位置的3’方向上的位置21处开始的和/或对应于seqidno:1或seqidno:125所示的序列中的位置432的核苷酸位置处开始的终止密码子。
20.如实施方式17-19中任一项所述的多核苷酸，其中所述终止密码子是琥珀(tag)或乳白(tga)终止密码子。
21.如实施方式1-20中任一项所述的多核苷酸，其中：
所述变体x基因的长度不超过180个核苷酸或长度不超过或约210个核苷酸；和/或
所述变体x基因长度为至少或约90个核苷酸或长度为至少约120个核苷酸或长度为至少或约180个核苷酸。
22.如实施方式1-21中任一项所述的多核苷酸，其中：
所述变体x基因是野生型或未修饰的哺乳动物肝炎x基因的变体或其截短部分，其任选地是在pre中存在的截短部分；或
所述修饰的pre包括包含seqidno:28的变体x基因。
23.如实施方式22所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的哺乳动物肝炎x基因是野生型土拨鼠感染病毒(whv)x基因或其截短部分，其任选地是在野生型或未修饰的pre中存在的截短部分。
24.如实施方式23所述的多核苷酸，其中pre中存在的野生型或未修饰的whvx基因或野生型x基因的截短部分包括seqidno:1和12-20中任一项的核苷酸411-592所示或seqidno:125的核苷酸411-589所示的核苷酸序列。
25.如实施方式23或实施方式24所述的多核苷酸，其中所述野生型whvx基因包含seqidno:9的核苷酸序列或是其截短部分，其任选地如seqidno:10所示或是在野生型或未修饰的pre中存在的截短部分。
26.如实施方式1-25中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre包含野生型或修饰的肝炎病毒pre的至少两个或至少三个顺式作用的转录后调控子元件或其功能变体。
27.如实施方式26所述的多核苷酸，其中所述至少两个或至少三个子元件包含野生型或未修饰的preα子元件或其功能变体，野生型或未修饰的preβ子元件的功能变体，和/或野生型或未修饰的preγ子元件或其功能变体。
28.如实施方式1-27中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre包含野生型或未修饰的肝炎病毒pre的α子元件或其功能变体和野生型或未修饰的preβ子元件的功能变体。
29.如实施方式27或实施方式28所述的多核苷酸，其中所述α子元件包含seqidno:3的序列或其变体，所述β子元件包含seqidno:6的序列的变体，和/或所述γ子元件包含seqidno:8的序列或其变体。
30.如实施方式1-29中任一项所述的多核苷酸，其中与野生型或未修饰的肝炎病毒pre相比，所述修饰的pre包含核苷酸修饰，所述野生型或未修饰的肝炎病毒pre是野生型哺乳动物肝炎pre。
31.如实施方式30所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的哺乳动物肝炎病毒pre包含seqidno：1、12-27或125中任一个所示的核苷酸序列。
32.如实施方式30或实施方式31所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的哺乳动物肝炎pre是野生型土拨鼠肝炎病毒pre(wpre)。
33.如实施方式1-32中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎pre包含：
a)seqidno:1或seqidno:125所示的核苷酸序列，或者显示与seqidno:1或seqidno:125至少94％的序列相同性的核苷酸序列，其显示与seqidno:1或seqidno:125的转录后活性基本相同或所述转录后活性的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；和
b)包含a)的核苷酸序列的部分的修饰的pre，其中所述部分显示或保留所述转录后活性。
34.如实施方式33所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎pre包含与seqidno:1或seqidno:125显示至少95％、96％、97％、98％、99％的序列相同性的核苷酸序列。
35.如实施方式1-34中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎病毒pre包含seqidno：1、12-20或125中任一个所示的核苷酸序列。
36.如实施方式1-35中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎病毒pre包含seqidno:1或seqidno:125的核苷酸序列。
37.如实施方式1-36中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因包含起始密码子，所述起始密码子从对应于seqidno：1或seqidno：125的位置411的位置处开始。
38.如实施方式37所述的多核苷酸，其中所述起始密码子是atg起始密码子。
39.如实施方式1-38中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因还包含与所述变体x基因可操作地连接的启动子。
40.如实施方式39所述的多核苷酸，其中所述启动子是包含seqidno：11所示序列或野生型whvx基因启动子序列的野生型或未修饰的x基因启动子。
41.如实施方式1-40中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre选自：
a)包含显示与seqidno:1或seqidno:125的至少65％的序列相同性的核苷酸序列的修饰的pre，所述修饰的pre含有变体x基因，所述变体x基因包含seqidno:1或seqidno:125中不存在的至少一个终止密码子；和
b)包含a)的核苷酸序列的部分的修饰的pre，所述部分包括包含所述至少一个终止密码子的变体x基因，其中所述部分显示转录后活性。
42.如实施方式41所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre包含与seqidno:1或seqidno:125显示至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的核苷酸序列。
43.如实施方式41或实施方式42所述的多核苷酸，其中所述变体x基因包含至少2个终止密码子、至少3个终止密码子或至少4个终止密码子。
44.如实施方式41-43中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因在存在于所述变体x基因中的每个阅读框中包含终止密码子。
45.如实施方式1-44中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因包含seqidno:44-58或seqidno:141-155中任一个所示的核苷酸序列和/或所述修饰的pre包含seqidno:29-43或seqidno:126-140中任一个所示的核苷酸你序列。
46.如实施方式1-45中任一个所示的多核苷酸，其中所述修饰的pre除了在野生型或未修饰的pre中不存在的至少一个终止密码子之外不含任何修饰。
47.如实施方式1-46中任一个所示的多核苷酸，其中所述修饰的pre除了在野生型或未修饰的pre中不存在的至少一个终止密码子之外含有其他修饰。
48.如实施方式1-47中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因还包含起始密码子的变体，与野生型或未修饰的肝炎病毒x基因起始密码子相比和/或与对应于seqidno:1或seqidno:125的核苷酸位置411-413的起始密码子相比，所述变体包含一个或多个核苷酸差异。
49.如实施方式48所述的多核苷酸，其中所述一个或多个差异导致限制或阻止从所述起始密码子的翻译起始。
50.如实施方式47-49中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因包含seqidno：74-88或171-185中任一个所示的核苷酸序列和/或所述修饰的pre包含seqidno：59-73或156-170中任一个所示的核苷酸序列。
51.如实施方式1-50中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因包含与所述变体x基因可操作地连接的变体启动子，与野生型或未修饰的肝炎病毒x基因启动子相比和/或与seqidno:11的启动子相比，所述变体启动子包含一个或多个核苷酸差异。
52.如实施方式51所述的多核苷酸，其中所述一个或多个差异导致限制或阻止从所述启动子的转录。
53.如实施方式51或52所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre包含seqidno：89-118或186-215中任一个所示的核苷酸序列。
54.如实施方式1-53中任一项所述的多核苷酸，其中
在引入真核细胞后，不产生由所述变体x基因编码的长度超过12、11、10、9、或8个氨基酸的多肽；和/或
所述多核苷酸无法产生由所述变体x基因编码的长度超过12、11、10、9、或8个氨基酸的多肽。
55.如实施方式1-54中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre编码促进核rna输出和/或增加mrna稳定性的rna。
56.如实施方式1-55中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre编码促进核rna输出和/或增加mrna稳定性的rna多核苷酸，其中所述促进核rna输出和/或mrna稳定性增加重组蛋白的表达。
57.如实施方式1-56中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre保留相应的野生型或未修饰的肝炎pre和/或seqidno:1、seqidno:119、seqidno:120、seqidno:125和/或seqidno:216所示的pre的转录后活性，其在一些情况中，是野生型或未修饰的肝炎pre和/或seqidno:1、seqidno:119、seqidno:120、seqidno:125或seqidno:216所示的pre的转录后活性的至少或约至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
58.如实施方式1-57中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因还包含编码野生型或未修饰的肝炎病毒x基因中不存在的翻译后修饰信号的序列。
59.一种多核苷酸，其包含修饰的转录后调节元件(pre)，所述修饰的pre包含野生型或未修饰的肝炎病毒x基因的变体，所述变体x基因包含编码不存在于所述野生型或未修饰的x基因中的翻译后修饰信号的序列。
60.如实施方式58或实施方式59所述的多核苷酸，其中所述翻译后修饰信号包括泛素化位点。
61.如实施方式58或实施方式59所述的多核苷酸，其中所述翻译后修饰信号包括：
从位于所述变体x基因中对应于所述x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的位置的3'方向上2、3、4、5或6个核苷酸以内或至少2、3、4、5或6个核苷酸以内的位置处开始的第一密码子，其中所述第一密码子根据n端规则编码甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、或亮氨酸残基；和任选的从对应于所述x蛋白开放阅读框的起始密码子的5'位置的所述变体x基因中的位置的3'方向上2、3、4、5或6个核苷酸以内或至少2、3、4、5或6个核苷酸以内的位置处开始的第二密码子，其中所述第二密码子根据n端规则编码谷氨酸或天冬酰胺残基。
62.如实施方式58或实施方式59所述的多核苷酸，其中所述翻译后修饰信号包括一个或多个pest序列。
63.如实施方式59-62中任一项所述的多核苷酸，还包含编码与所述修饰的pre可操作地连接的重组蛋白的核酸。
64.如实施方式59-63中任一项所述的多核苷酸，其中：
所述包含编码翻译后修饰信号的序列的变体x基因含有对应于seqidno:1的核苷酸残基448-470的β茎环；和/或
所述包含编码翻译后修饰信号的序列的变体x基因不含对应于seqidno:1的核苷酸448-470的β茎环内的位置中的核苷酸变化。
65.如实施方式59-64中任一项所述的多核苷酸，其中：
所述变体x基因的长度不超过180个核苷酸或长度不超过或约210个核苷酸；和/或
所述变体x基因长度为至少或约90个核苷酸或长度为至少约120个核苷酸或长度为至少或约180个核苷酸。
66.如实施方式59-65中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因是野生型或未修饰的哺乳动物肝炎x基因的变体或其截短部分，其任选地是在pre中存在的截短部分。
67.如实施方式66所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的哺乳动物肝炎x基因是野生型土拨鼠感染病毒(whv)x基因或其截短部分，其任选地是在野生型或未修饰的pre中存在的截短部分。
68.如实施方式67所述的多核苷酸，其中pre中存在的野生型或未修饰的whvx基因或野生型x基因的截短部分包括seqidno:2的1503-1928所示的核苷酸序列，seqidno:1和12-20中任一项的核苷酸411-592所示的核苷酸序列或seqidno:125的核苷酸411-589所示的核苷酸序列。
69.如实施方式67或实施方式68所述的多核苷酸，其中所述野生型whvx基因包含seqidno:9的核苷酸序列或是其截短部分，其任选地如seqidno:10所示或是在野生型或未修饰的pre中存在的截短部分。
70.如实施方式59-69中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre包含野生型或所述修饰的肝炎病毒pre的至少两个或至少三个顺式作用的转录后调控子元件或其功能变体。
71.如实施方式70所述的多核苷酸，其中所述至少两个或至少三个子元件包含野生型或未修饰的preα子元件或其功能变体，野生型或未修饰的preβ子元件的功能变体，和/或野生型或未修饰的preγ子元件或其功能变体。
72.如实施方式59-71中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre包含野生型或未修饰的肝炎病毒pre的α子元件或其功能变体和野生型或未修饰的preβ子元件的功能变体。
73.如实施方式71或实施方式72所述的多核苷酸，其中所述α子元件包含seqidno:3的序列或其变体，所述β子元件包含seqidno:6的序列的变体，和/或所述γ子元件包含seqidno:8的序列或其变体。
74.如实施方式1-73中任一项所述的多核苷酸，其中与野生型或未修饰的肝炎病毒pre相比，所述修饰的pre包含核苷酸修饰，所述野生型或未修饰的肝炎病毒pre是野生型哺乳动物肝炎pre。
75.如实施方式74所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的哺乳动物肝炎病毒pre包含seqidno：1、12-27或125中任一个所示的核苷酸序列。
76.如实施方式74或实施方式75所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的哺乳动物肝炎pre是野生型土拨鼠肝炎病毒pre(wpre)。
77.如实施方式1-76中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎pre包含：
a)seqidno:1或seqidno:125所示的核苷酸序列，或者显示与seqidno:1或seqidno:125至少94％的序列相同性的核苷酸序列，其显示与seqidno:1或seqidno:125的转录后活性基本相同或所述转录后活性的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％；和
b)包含a)的核苷酸序列的部分的修饰的pre，其中所述部分显示或保留所述转录后活性。
78.如实施方式77所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎pre包含与seqidno:1或seqidno:125显示至少95％、96％、97％、98％、99％的序列相同性的核苷酸序列。
79.如实施方式59-78中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎病毒pre包含seqidno：1、12-20或125中任一个所示的核苷酸序列。
80.如实施方式59-79中任一项所述的多核苷酸，其中所述野生型或未修饰的肝炎病毒pre包含seqidno:1或seqidno:125的核苷酸序列。
81.如实施方式59-80中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因包含起始密码子，所述起始密码子从对应于seqidno：1或seqidno：125的位置411的位置处开始。
82.如实施方式81所述的多核苷酸，其中所述起始密码子是atg起始密码子。
83.如实施方式59-82中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因还包含与所述变体x基因可操作地连接的启动子。
84.如实施方式83所述的多核苷酸，其中所述启动子是包含seqidno：11所示序列或野生型whvx基因启动子序列的野生型或未修饰的x基因启动子。
85.如实施方式59-84中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre选自：
a)包含显示与seqidno:1或seqidno:125的至少65％的序列相同性的核苷酸序列的修饰的pre，所述修饰的pre含有变体x基因，所述变体x基因包含seqidno:1或seqidno:125中不存在的翻译后修饰信号；和
b)包含a)的核苷酸序列的部分的修饰的pre，所述部分包括包含编码翻译后修饰的序列的变体x基因，其中所述部分显示转录后活性。
86.如实施方式85所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre包含与seqidno:1或seqidno:125显示至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的核苷酸序列。
87.如实施方式1-86中任一项所述的多核苷酸，其中所述变体x基因含有多至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸变化。
88.如实施方式59-87中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre除了编码翻译后修饰信号的序列之外不含任何修饰。
89.如实施方式59-88中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre除了编码未存在于野生型或未修饰的肝炎病毒x基因中的翻译后修饰信号的序列之外还含有其他修饰。
90.如实施方式89所述的多核苷酸，其中所述其他修饰在所述变体x基因中。
91.如实施方式90所述的多核苷酸，其中所述其他修饰导致编码非活性x蛋白和/或截短的x蛋白的变体x基因。
92.如实施方式59-91中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre编码促进核rna输出和/或增加mrna稳定性的rna。
93.如实施方式59-92中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre编码促进核rna输出和/或增加mrna稳定性的rna多核苷酸，其中所述促进核rna输出和/或mrna稳定性增加重组蛋白的表达。
94.如实施方式59-93中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的pre保留相应的野生型或未修饰的肝炎pre和/或seqidno:1、seqidno:119、seqidno:120、seqidno:125和/或seqidno:216所示的pre的转录后活性，其在一些情况中，是野生型或未修饰的肝炎pre和/或seqidno:1、seqidno:119、seqidno:120、seqidno:125或seqidno:216所示的pre的转录后活性的至少或约至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
95.一种多核苷酸，包含病毒核酸，所述病毒核酸包含变体flap的多核苷酸，其中所述变体flap含有对应于野生型或未修饰flap序列的中心聚嘌呤区(cppt)和/或中心终止序列(cts)区域的全部或部分核苷酸缺失。
96.如实施方式95所述的多核苷酸，其中所述变体flap包含对应于cppt和cts的核苷酸的全部或部分缺失，其可以是连续部分。
97.如实施方式95或96所述的变体flap多核苷酸，其中：
所述野生型或未修饰的flap序列包含或包含约80-200个连续核苷酸，其包含逆转录病毒的cppt或cts区域，所述逆转录病毒任选地是慢病毒，其任选地是hiv-1；和/或
所述野生型或未修饰的flap包含a)seqidno：121所示的核苷酸序列；b)与含有cppt和/或cts区域的seqidno：121所示的核苷酸序列具有至少85％、86％、87％、88％，89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相同性的核苷酸序列；或c)a)或b)的连续部分，其包含cppt和/或cts区域。
98.如实施方式95-97中任一项所述的变体flap多核苷酸，其中：
所述变体flap包含对应于seqidno:123所示的cppt区域的核苷酸的核苷酸的全部或部分缺失，其可以是连续部分；和/或
所述变体flap包含对应于seqidno:124所示的cts区域的核苷酸的核苷酸的全部或部分缺失，其可以是连续部分。
99.如实施方式95-98中任一项所述的变体flap多核苷酸，其中所述变体flap包含seqidno:123所示的cppt区域的全部或部分缺失，其可以是连续部分，并且包含seqidno:124所示的cts区域的全部或部分缺失，其可以是连续部分。
100.如实施方式95-99中任一项所述的变体flap多核苷酸，其中：
所述包含变体flap的病毒核酸包含显示与seqidno:121至少65％、70％、75％、80％、85％或90％的序列相同性的核苷酸序列，所述变体flap缺少所述cppt和/或cts区域的全部或部分；和/或
所述病毒核酸包括包含seqidno:122所示的序列的变体flap。
101.如实施方式1-94中任一项所述的多核苷酸，还包括包含实施方式95-100中任一项所述的变体flap的病毒核酸的多核苷酸。
102.如实施方式95-101中任一项所述的多核苷酸，其包含：
包含seqidno:122的序列或与seqidno:122有至少或约90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列相同性的序列的变体flap；和
seqidno:29或seqidno:126的序列或与seqidno:29或seqidno:126有至少或约90％、95％、96％、97％、98％、或99％的序列相同性的序列；和
任选的，包含编码重组蛋白的核酸。103.如实施方式1-94和101-102中任一项所述的多核苷酸，其中所述重组蛋白包括重组受体。
104.如实施方式103所述的多核苷酸，其中所述重组受体是抗原受体和/或嵌合受体。
105.如实施方式104所述的多核苷酸，其中所述重组受体是功能性非tcr抗原受体或转基因tcr。
106.如实施方式103-105中任一项所述的多核苷酸，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(car)。
107.一种表达盒，其包含如实施方式1-106中任一项所述的多核苷酸和与编码所述重组蛋白的核酸可操作地连接的启动子。
108.一种载体，其包含如实施方式1-106中任一项所述的多核苷酸机票如实施方式107所述的表达盒。
109.如实施方式108所述的载体，其是病毒载体。
110.如实施方式109所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体，其任选地衍生自hiv-1。
111.如实施方式109所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
112.一种细胞，其包含如实施方式107所述的表达盒或如实施方式108-111中任一项所述的载体。
113.如实施方式112所述的细胞，其中所述细胞是t细胞、自然杀伤(nk)细胞、ips细胞、或ips-衍生的细胞。
114.一种病毒颗粒，包含如实施方式108-111中任一项所述的载体。
115.一种方法，包括向细胞引入如实施方式107所述的表达盒、如实施方式108-111中任一项所述的载体、或如实施方式114所述的病毒颗粒，所述引入在所述细胞实现所述重组蛋白表达的条件下。
116.如实施方式115所述的方法，其中：
通过用所述载体或病毒颗粒转导所述细胞来实现所述引入；
通过用所述载体转染所述细胞来实现所述引入；和/或
通过用所述载体电穿孔所述细胞来实现所述引入。
117.如实施方式116所述的方法，其中与通过引入相同但不含所述修饰的pre或不含pre的载体所实现的表达相比，所述重组蛋白以增加的水平表达。
118.一种细胞，通过实施方式115-117中任一项所述的方法制备。
119.一种包含如实施方式112、113或118所述的细胞和药学上可接受运载体的药物组合物。
120.一种治疗方法，所述方法包括向具有疾病或病症的对象给予如实施方式108-111中任一项所述的载体，如实施方式114所述的病毒颗粒，如实施方式112、113或118所述的细胞，或如实施方式119所述的组合物。
121.如实施方式120所述的方法，其中所述重组蛋白包含与由疾病或病症或其细胞或组织表达的配体特异性结合的重组受体。
122.如实施方式121所述的方法，其中所述受体是抗原受体，并且所述配体是对疾病或病症特异的和/或与之相关的抗原。
123.如实施方式122所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症，自身免疫性疾病或感染性疾病。
124.如实施方式119所述的药物组合物用于治疗疾病或病症的用途。
125.如实施方式119所述的药物组合物，用于制备用于治疗疾病或病症的药物。
126.如实施方式124所述的用途或如实施方式125所述的药物组合物，其中由所述细胞表达的重组蛋白包括与由疾病或病症或其细胞或组织表达的配体特异性结合的重组受体。
127.如实施方式124-126中任一项所述的用途或药物组合物，其中所述重组受体是抗原受体，并且所述配体是对疾病或病症特异的和/或与之相关的抗原。
128.如实施方式124-127中任一项所述的用途或药物组合物，其中所述疾病或病症是癌症，自身免疫性疾病或感染性疾病。
iv.实施例
下面的实施例仅是为了阐述，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1：修饰的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件
生成示例性的修饰的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)多核苷酸，其含有对应于示例性野生型wpre序列(seqidno:1)中的位置的残基处的修饰。向对应于编码whvx蛋白的截短部分的seqidno:1的区域(x基因片段)的各阅读框中引入终止密码子。具体地，在该区域中，在编码截短的x蛋白(在距离对应于x基因起始密码子的5’位置的位点9和21个核苷酸开始)的开放阅读框中引入2个终止密码子，并且在其他2个阅读框的每个中引入1个(在距离对应于起始密码子的5’位置的位点13和17个核苷酸开始)。修饰的wpre含有seqidno:126所示的核苷酸序列。在该序列的以下部分中，终止密码子加粗显示，并且引入的针对seqidno:1的突变带下划线：atggctgcttagctgagtagctga(seqidno:28)。也生成对照功能修饰的wpre，其含有seqidno:216所示的序列。与seqidno:1的野生型wpre序列相比，该对照功能修饰的wpre含有在whvx基因启动子区域和起始密码子中的突变。已经用于多种用于转导的病毒载体，证明活性足够促进由这类载体编码的重组分子的表达(参见，例如，“克隆载体plv.mcs.whvpre，完整序列”genbank:jn622008.1；美国专利号7,384,738)。
含有seqidno:126所示的核苷酸序列修饰的wpre和含有seqidno:216所示的核苷酸序列的对照修饰的wpre各自单独纳入在病毒flap区域内含有突变的示例性hiv-1-衍生的慢病毒载体中。具体地，慢病毒载体含有变体flap区域，其中对应于seqidno:123和seqidno:124的区域缺失，产生flap变体载体，具有含有seqidno:122所示的核苷酸序列的部分(命名为flap-/-)。
也生成慢病毒载体，其中seqidno:119的对照修饰的wpre被纳入含有完全flap区域的示例性hiv-1衍生的慢病毒载体中。慢病毒载体含有完全flap区域(野生型flap多核苷酸)，其含有seqidno:121所示的核苷酸序列(命名为flap+/+)。
生成的慢病毒载体中含有的序列总结在下表4中：
表4：
该载体含有编码由t2a接头分隔的嵌合抗原受体和截短的表皮生长因子(egfrt)转导标记物的多核苷酸(参见美国专利号8,802,374)。通过用所得的载体、辅助质粒(含有gagpol质粒和rev质粒)、和假型质粒瞬时转染hek-293t细胞由标准过程产生假型慢病毒载体颗粒，并用于转导细胞。
实施例2：用含有修饰的wpre的病毒载体转导细胞
使用实施例1中所述的慢病毒载体颗粒来转导来自人纤维肉瘤细胞系(ht1080
2a.ht1080细胞
在重复研究(a和b)中，ht1080细胞在8μg/ml的聚凝胺存在下，在24-孔板中用250μl或125μl体积的病毒转导，并离心转染(1200xg持续30分钟)使用未转导的细胞样品作为阴性对照。
在细胞培养48-72小时后，通过用基于未转导的对照样品设置的门选由流式细胞术来检测egfrt标记物的表面表达。使用生物素偶联的抗-egfr抗体(西妥昔单抗)来检测egfrt，之后用二级v450-偶联的链霉亲和素检测。表5列出了重复a和b中各种条件中每一种显示表面egfrt表达的活细胞的百分率。
如所示，使用具有变体flap区域和修饰的wpre以及在x基因片段中的终止密码子的慢病毒载体转导ht1080细胞导致与使用具有变体flap区域和对照修饰的wpre的载体相当的egfrt表达。因此，与x基因起始密码子和启动子区域中的修饰相比，x基因片段中存在终止密码子不干扰wpre促进由载体编码的重组蛋白的表达的能力。
同样，如所示，具有变体flap区域的慢病毒载体成功转导ht1080细胞，如通过egfrt表达所检测。
表5：
2b.人t细胞
原代人t细胞通过从获自人单采样品的外周血单核细胞(pbmc)中的阳性选择来富集。在il-2(100iu/ml)存在下，使用抗-cd3/抗-cd28珠来激活细胞。在24孔板中，针对实施例1中所述的各载体，在聚凝胺(8μg/ml)存在下用一个体积的病毒来转导激活的t细胞并离心转染(1200xg持续30分钟)。使用未转导的细胞样品作为阴性对照。
如实施例2a所述检测egfrt的表面表达。结果示于表6，包括来自重复研究(a和b)的结果。如所示，使用具有变体flap区域和修饰的wpre以及在x基因片段中的终止密码子的慢病毒载体转导原代人t细胞导致与使用具有变体flap区域和对照修饰的wpre的载体相当的egfrt表达。因此，与x基因起始密码子和启动子区域中的修饰相比，x基因片段中存在终止密码子不干扰wpre促进由载体编码的重组蛋白的表达的能力。这些结果在多个激活剂之间一致，当用各种类型的抗-cd3/抗-cd28珠激活人原代t细胞时获得相似的结果。
同样，如所示，具有变体flap区域的慢病毒载体成功转导t细胞，如通过egfrt表达所观察。
表6：
实施例3：用含有完全flap或变体flap区域的病毒载体转导细胞
基本如实施例1所述生成慢病毒载体颗粒，其中各自编码含有不同的抗-cd19scfv抗原结合结构域的嵌合抗原受体(car)。各慢病毒载体也含有对照功能修饰的wpre的wpre多核苷酸，其对于与编码car的多核苷酸可操作地连接的x基因orf，和野生型flap多核苷酸(flap+/+)(seqidno:121)或变体flap多核苷酸(flap-/-)(seqidno:122)而言不存在。为了检测car的表达，慢病毒载体也编码截短的egfr(egfrt)转导标记物，其通过自切割t2a接头与car分隔。
原代人cd8+t细胞通过从获自人单采样品的外周血单核细胞(pbmc)中的阳性选择来富集。使用慢病毒载体颗粒来转导cd8+t细胞(基本如yam等，(2002)mol.ther.5:479；wo2015/095895所述)。使用未转导的细胞样品作为阴性对照。
转导和扩增后，用抗egfr抗体染色，以通过如实施例2a所述的流式细胞术确认egfrt转导标志物在细胞表面上的表达。基于未转导的对照样品设置门选。表7列出了各种条件中每一种显示表面egfrt表达的活细胞的百分率。如所示，结果证实具有flap-/-多核苷酸的慢病毒载体可成功转导cd8+t细胞。
表7：
在转导后，用各car构建体转导的t细胞，包括含有变体flap-/-多核苷酸的那些，通过在经辐照的cd19+细胞系存在下的刺激，被成功选择性富集和扩增(通过流式细胞术证实等于或接近100％egfrt+)。
本发明并不意在将范围限制于具体公开的实施方式，这些实施方式仅为提供，例如，对于本发明不同方面的说明。本文所述的组合物和方法的各种修饰将在本文的说明和启示后变得显而易见。可实施这类变化而不偏离本公开的真正范围和精神，并且落入本发明的范围内。
序列表
<110>朱诺治疗学股份有限公司（junotherapeutics,inc.）
s·u·塔林（tareen,semih）
<120>用于增强基因表达的修饰的肝炎转录后调节元件（pre）
<130>735042001840
<140>未分配
<141>同时附上
<160>221
<170>fastseqforwindowsversion4.0
<210>1
<211>592
<212>dna
<213>土拨鼠肝炎病毒
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<220>
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<220>
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<220>
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<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的修饰的pre(1,3)
<400>35
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ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
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ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctt420
agctgtgtagccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>36
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>36
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
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ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctt420
agctgtgttgctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>37
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的修饰的pre(2,3)
<400>37
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
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ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctc420
gcctgagtagccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
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cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>38
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的修饰的pre(2,4)
<400>38
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
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ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctc420
gcctgagttgctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>39
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的修饰的pre(3,4)
<400>39
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
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gcctgtgtagctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
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cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>40
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有1个终止密码子的修饰的pre(1)
<400>40
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
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agctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
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<210>41
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有1个终止密码子的修饰的pre(2)
<400>41
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
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tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctc420
gcctgagttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>42
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有1个终止密码子的修饰的pre(3)
<400>42
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
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ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctc420
gcctgtgtagccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>43
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有1个终止密码子的修饰的pre(4)
<400>43
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctc420
gcctgtgttgctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>44
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有4个终止密码子的截短的x基因(1,2,3,4)
<400>44
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tg182
<210>45
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有3个终止密码子的截短的x基因(1,2,3)
<400>45
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tg182
<210>46
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有3个终止密码子的截短的x基因(1,2,4)
<400>46
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ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>47
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有3个终止密码子的截短的x基因(1,3,4)
<400>47
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ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>48
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有3个终止密码子的截短的x基因(2,3,4)
<400>48
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ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>49
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的截短的x基因(1,2)
<400>49
atggctgcttagctgagttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccc60
ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>50
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的截短的x基因(1,3)
<400>50
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ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>51
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的截短的x基因(1,4)
<400>51
atggctgcttagctgtgttgctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccc60
ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>52
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的截短的x基因(2,3)
<400>52
atggctgctcgcctgagtagccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccc60
ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>53
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的截短的x基因(2,4)
<400>53
atggctgctcgcctgagttgctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccc60
ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>54
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有2个终止密码子的截短的x基因(3,4)
<400>54
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ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>55
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有1个终止密码子的截短的x基因(1)
<400>55
atggctgcttagctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccc60
ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>56
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有1个终止密码子的截短的x基因(2)
<400>56
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ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>57
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有1个终止密码子的截短的x基因(3)
<400>57
atggctgctcgcctgtgtagccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccc60
ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>58
<211>182
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有1个终止密码子的截短的x基因(4)
<400>58
atggctgctcgcctgtgttgctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtccc60
ttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctct120
tccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcc180
tg182
<210>59
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有起始和终止密码子的修饰的pre
<400>59
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ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
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ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
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ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccggggctgctt420
agctgagtagctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>60
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有起始和终止密码子的修饰的pre
<400>60
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccggggctgctt420
agctgagtagccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>61
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有起始和终止密码子的修饰的pre
<400>61
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccggggctgctt420
agctgagttgctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
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<210>62
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有起始和终止密码子的修饰的pre
<400>62
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccggggctgctt420
agctgtgtagctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
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<210>63
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有起始和终止密码子的修饰的pre
<400>63
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccggggctgctc420
gcctgagtagctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
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<210>64
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有起始和终止密码子的修饰的pre
<400>64
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccggggctgctt420
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ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaggtctgctgagactcggggctgctt420
agctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>116
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有启动子序列和起始和终止密码子的修饰的pre
<400>116
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaggtctgctgagactcggggctgctc420
gcctgagttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>117
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有启动子序列和起始和终止密码子的修饰的pre
<400>117
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
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ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaggtctgctgagactcggggctgctc420
gcctgtgtagccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>118
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有启动子序列和起始和终止密码子的修饰的pre
<400>118
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
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ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaggtctgctgagactcggggctgctc420
gcctgtgttgctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>119
<211>592
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有启动子序列和起始密码子的修饰的pre
<400>119
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctc420
gcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg592
<210>120
<211>593
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有启动子序列和起始密码子的修饰的pre
<400>120
aatcaacctctggattacaaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgc60
tccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccg120
tatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagtt180
gtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccac240
tggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccc300
tattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggct360
gttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaggtctgctgagactcggggctgct420
cgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccct480
caatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtct540
tcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctg593
<210>121
<211>179
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>dnaflap区域
<400>121
tacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtg60
caggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaac120
aaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttgg179
<210>122
<211>136
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>修饰的dnaflap区域
<400>122
tacaaatggcagtattcatccacaattttttggggggtacagtgcaggggaaagaatagt60
agacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaacgggtttattacagggacag120
cagagatccagtttgg136
<210>123
<211>16
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>中心聚嘌呤区(cppt)
<400>123
aaaagaaaagggggga16
<210>124
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>中心终止序列(cts)
<400>124
aaacaaattacaaaaattcaaaatttt27
<210>125
<211>589
<212>dna
<213>土拨鼠肝炎病毒
<400>125
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctc420
gcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc589
<210>126
<211>589
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有终止密码子的修饰的pre
<400>126
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctt420
agctgagtagctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc589
<210>127
<211>589
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有终止密码子的修饰的pre
<400>127
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
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agctgagtagccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc589
<210>128
<211>589
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有终止密码子的修饰的pre
<400>128
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctt420
agctgagttgctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc589
<210>129
<211>589
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有终止密码子的修饰的pre
<400>129
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
atggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttg180
tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctt420
agctgtgtagctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc589
<210>130
<211>589
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有终止密码子的修饰的pre
<400>130
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgct60
ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
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tggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccact240
ggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccct300
attgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctg360
ttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctc420
gcctgagtagctgactggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctc480
aatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtctt540
cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc589
<210>131
<211>589
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有终止密码子的修饰的pre
<400>131
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ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
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cgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc589
<210>132
<211>589
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有终止密码子的修饰的pre
<400>132
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ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
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<210>133
<211>589
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>具有终止密码子的修饰的pre
<400>133
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ccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgt120
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<213>人工序列
<220>
<223>具有终止密码子的修饰的pre
<400>134
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<211>589
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<213>人工序列
<220>
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<400>135
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<211>589
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<211>589
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