本申请要求2015年8月28日提交的美国临时专利申请序列号62/211,524的优先权和权益，该申请通过引用全部纳入本文用于所有目的。关于联邦资助研究的声明无。
背景技术：
：：端粒酶的过度表达与心脏和血管保护有关；然而，鉴于端粒酶在细胞永生化和增殖中的作用，在某些细胞类型中端粒酶的再活化也可能是致癌转化中的重要事件。端粒酶再活化在预防和改善心脏和血管疾病中的有益作用的基础机制至今尚不清楚。因此，希望开发克服了标准方案的缺陷的组合物和治疗和预防方法，并提供了血管疾病的新治疗范例，同时缓解化疗癌症治疗的不良或脱靶副作用。需要用于实现上述目标的组合物和方法。技术实现要素：本发明通过提供如本文所述的组合物和方法克服了上述缺点。在第一方面，本文提供了分离的肽，其包含与seqidno：6所示序列(rrrggx1asrslplpkrprr)至少80％同源的氨基酸序列，其中x1是选自以下的仿磷酸化(phosphomimetic)残基：天冬氨酸和谷氨酸，所述分离的肽能够防止tert核易位，其中所述分离的肽少于20个氨基酸。分离的肽可以具有如seqidno：2所示的序列。肽可以是血脑屏障(bbb)-透过性的。另一方面，本文提供了分离的多核苷酸，其包含编码包含本文所提供的分离的肽的肽的核酸序列。在另一方面，本文提供了包含相对于seqidno：1的位置6处的丝氨酸残基的不可磷酸化取代(non-phosphorylatablesubstitution)的分离的肽，其中所述分离的肽少于20个氨基酸，包含与seqidno：1所示序列至少80％同源的氨基酸序列，并且能够阻止tert核易位。分离的肽可以具有如seqidno：3所示的序列。该肽可以是bbb透过性的。本文还提供了分离的多核苷酸，其包含编码包含相对于seqidno：1的位置6处的丝氨酸残基的不可磷酸化取代的肽的核酸序列。在另一方面，本文提供了一种防止人细胞中端粒酶核易位的方法，所述方法包括使所述人细胞与tert核易位抑制剂接触。tert核易位抑制剂可以是肽。抑制剂可以是包含选自seqidno：2，seqidno：3和seqidno：4的序列的肽。抑制剂可以是具有选自seqidno：2，seqidno：3和seqidno：4的序列的肽。给药可以是肠胃外给药。另一方面，本文提供了减少对象的不良心脏作用的方法，所述方法包括向对象给予治疗有效量的tert核易位抑制剂，其中给予所述合成肽减少对象中不良心脏作用的出现。不良心脏作用可以是与向对象给予化疗剂相关的心脏毒性。对象将接受或正在接受化疗剂。tert核易位抑制剂可以是肽。肽可以具有选自seqidno：2，seqidno：3和seqidno：4的序列。给药可以是肠胃外给药。在一些情况下，本文还提供拮抗血管紧张素ii(angii)的不良心脏作用的方法，血管紧张素ii引起显著的心脏和血管损伤并且与高血压和许多其他cv疾病状态相关。另一方面，本文提供治疗对象的过度增殖性疾病的方法，所述方法包括向所述对象给予治疗有效量的分离的肽到所述对象中，其中所述分离的肽少于20个氨基酸并且包含与seqidno：6所示序列(rrrggx1asrslplpkrprr)至少80％同源的氨基酸序列；其中x1是相对于seqidno：1中的相应位置选自天冬氨酸和谷氨酸的仿磷酸化残基，所述分离的肽能够阻止tert核易位，由此治疗过度增殖性疾病。过度增殖性疾病可以是癌症。肽可以包含如seqidno：3所示的氨基酸序列。该肽可以被聚乙二醇化(peg化)。该聚乙二醇化肽可包含seqidno：4所示序列。本文还提供了减少氧化应激的方法，所述方法包括向对象给予有效量的tert核易位抑制剂。tert核易位抑制剂可以是肽。肽可以包含选自seqidno：2，seqidno：3和seqidno：4的序列。在另一方面，本文提供了一种防止人细胞中端粒酶(tert)的线粒体易位的方法，所述方法包括使所述人细胞与tert线粒体易位抑制剂接触。抑制剂可以是包含seqidno：5的肽。通过以下描述可以清楚地了解本发明的上述和其他方面和优势。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示了本发明的优选实施方式。这类实施方式不必然代表本发明的全部范围，而是因此对权利要求进行说明并在本文中解释本发明的范围。附图简要说明图1a-1b显示，在正常条件下，端粒酶在nls处被激酶(包括akt)磷酸化，导致核输入。(a)端粒酶主要定位于细胞核。(b)nucxtert作为诱饵肽，与端粒酶竞争参与磷酸化nls的激酶。这导致细胞质和线粒体中端粒酶的核输入和端粒酶积聚的减少。图2a-2b。(a)显示解剖的人微血管。顶图是明场图像，而底部三个图是激光激发下相同血管的图像，带有滤波器以观察5-fam的发射。用10μm浓度的5-fam标记的肽(nucxtert-w)处理血管8小时(h)，或不处理(对照)。(b)将h1299非小细胞肺癌细胞接种在载玻片上并用0，50或100μm5-fam标记的nucxtert-w处理8小时。dapi＝蓝色；5-fam标记的肽＝绿色。图3a-3b。(a)使用指定剂量的nucxtert-w过夜处理后使用分级分离为核和胞质隔室的h1299细胞进行的western印迹。gapdh作为细胞质加载对照，而组蛋白h3用作核加载对照。(b)a中呈现的western印迹的光密度量化表示为分别归一化至核和细胞质加载对照后的核：细胞质信号比。图4a-4b证明nucxtert肽保护人血管免受应激物影响。(a)从健康供体的脂肪中解剖得到活的人微血管并用bibr1532(端粒酶抑制剂)，mitoxtert或nucxtert(和nucxtert+bibr1532)处理过夜。然后对血管进行考验，用乙酰胆碱(ach)扩张刺激，用或不用angii应激物。(b)将如a中制备的人微血管用bibr1532，mitoxtert或nucxtert(和nucxtert+bibr1532)处理过夜。然后对血管进行考验，采用压力梯度扩张刺激，有或没有angii。图5a-5c。(a)nucxtert-a(序列详述于c)用于过夜处理人微血管。然后将流和ach用作扩张刺激，有或没有angii。(b)nucxtert-e(序列详述于c)用于过夜处理人微血管。然后将流和ach用作扩张刺激，有或没有angii。(c)表格详述了各种测试的nucxtert变体的序列和有效性。图6证明nucxtert肽恢复冠状动脉疾病人微血管的功能。从患有临床确诊的冠状动脉疾病(cad)的个体的脂肪中解剖得到活的人微血管。在载剂或l-name或peg-过氧化氢酶存在下用nucxtert处理血管。评估对压力梯度(流)刺激的响应。用或不用ng-硝基-l-精氨酸甲酯(l-name)或peg-过氧化氢酶，用载剂或mitoxtert处理来自健康人供者的脂肪的微血管。评估血管响应压力梯度(流)扩张的能力。图7a-7c显示了分离血管研究中peg化nucxtert-e的剂量滴定。具有s-＞e取代的nucxtert在c-末端聚乙二醇化以增加生物稳定性和细胞渗透性。测试了从10μm到1nm的有效剂量。聚乙二醇化肽可以滴定低至1nm而具有血管保护作用。当治疗非cad血管时，流介导的扩张(fmd)的机制没有改变，留下一氧化氮(no)介导(l-name可抑制，b)但保护免于angii诱导的内皮功能障碍(c)。n＝3-4。图8a-8l显示了体内肽的生物分布。聚乙二醇化肽(50nm)用锝(tc99m)进行放射性标记用于放射性追踪。将锝标记的肽(0.77nm)注射到正常c57小鼠的尾静脉中。(a-k)在注射后2、4和8小时将小鼠安乐死，并在个体器官中测定剩余的放射性。信号被归一化至血液。在每个主要器官中，观察到信号显著增加直至注射后8小时，表明此时肽未降解。(l)给小鼠皮下(subq)注射放射性标记的肽(0.77nm)，并在24和48小时后在血液中测定剩余的活性。n＝5-6。图9证明了peg-nucxtert的体内作用。小鼠接受常用应激物处理，以诱发高血压和内皮功能障碍。快速升压剂量的angii(1000ng/kg/分钟)通过渗透微型泵灌输14天。使用nucxtert(30μg/天，通过渗透微型泵)和angii共处理一小组动物，持续时间相同，使用相同的递送系统。将曲线与历史对照(载剂)进行比较。angii引起激动剂诱导的内皮依赖性扩张(ach，a)或fmd(b)的显著降低，而与nucxtert共处理阻止了angii诱导的内皮功能障碍的发作。响应血管扩张剂罂粟碱的平滑肌依赖性扩张没有受到影响(数据未显示)。*与载剂相比p＜0.05，单向anovarm，n＝5)。具体实施方式本说明书中引用的包括但不限于专利和专利申请的全部出版物和参考文献均通过引用其全文纳入本文，就像指示各出版物或参考文献特定且独立地通过如陈述全文一样通过引用纳入本文。被本申请要求优先权的任何专利申请也以就上述出版物和参考文献而言的方式通过引用其全文纳入本文。综述尽管已知tert失调在许多血管疾病表型(包括与冠状动脉疾病(cad)相关的血管功能障碍)中发挥重要作用，并且tert表达赋予mi后成年小鼠心脏的心脏保护作用，但癌症背景下对tert功能的全面抑制导致脱靶毒性，包括血管和心脏损伤。本文提供的组合物和方法至少部分基于以下发现：给予肽抑制剂后，核中的tert积累显著减弱。进一步发现线粒体相关端粒酶而不是核端粒酶是与端粒酶活性相关的心血管保护的原因，而nls肽抑制剂保护分离的人血管免受应激响应的损害，并可减少肺肿瘤细胞的迁移。抑制端粒酶的催化亚单位tert的核转运能增加细胞质(包括线粒体)端粒酶定位和活性。因此，本文提供了利用在心脏和血管疾病中端粒酶过度表达的益处而不增加癌症风险的组合物和方法，并且还提供了以较低毒性的方式抑制癌症中的核端粒酶的改进手段。本文提供的nls肽抑制剂组合物可以与传统和靶向癌症疗法组合使用以最小化对血管系统和心脏的毒性。组合物在第一方面，本文提供了包含端粒酶核定位信号(nls)或线粒体定位信号(mls)的一种或多种合成肽，其中合成肽可以有效地与内源定位信号竞争细胞内的激酶修饰。本文所述的含nls的肽组合物和含mls的肽组合物被认为是分别特异性仅抑制tert的核和线粒体功能的首批端粒酶抑制剂。在某些情况下，合成肽是tert核定位/易位抑制剂。本文所述的肽被认为是仅特异性抑制tert的核功能的首批端粒酶抑制剂。通过模拟tert的核定位信号，抑制性肽阻断或减弱内源性端粒酶从细胞质移动到细胞核的能力。在其他情况下，合成肽是tert线粒体定位抑制剂。通过模拟tert的线粒体定位信号，抑制性肽阻断或减弱内源性端粒酶从细胞质移动到线粒体的能力。如本文所述，本发明的合成肽是血脑屏障(bbb)透过性肽。bbb透过性肽的特征在于肽具有渗透由脑毛细血管内皮细胞形成的血脑屏障的能力。如本文所用，术语“血脑屏障”或“bbb”指由脑毛细血管内皮细胞的膜特性，结构和紧密连接形成的药物，离子，肽，蛋白质和毒素的生物转运障碍。如本文所用，术语“肽”广义地定义为包括由通过化学键连接的两个或更多个氨基酸组成的任何有机化合物，其中一个氨基酸的氨基与第二个氨基酸的羧基结合。如本文所用，术语“氨基酸”广义地定义为包括天然存在的氨基酸以及非天然存在的氨基酸，包括氨基酸类似物和衍生物，例如含有氨基酸部分的分子。如本文所用，术语氨基酸因此包括，例如，天然存在的蛋白质性l-氨基酸；d-氨基酸；化学修饰的氨基酸，例如氨基酸类似物和衍生物；天然存在的非蛋白性氨基酸如正亮氨酸，β-丙氨酸，鸟氨酸等；以及具有本领域已知为氨基酸特征的性质的化学合成的化合物，包括非天然β-氨基酸，含有非天然侧链的那些，和d-氨基酸以及反和逆反肽序列。在一些情况下，合成肽是仿磷酸化(phosphomimetic)肽，意思是该肽包含“仿磷酸化”氨基酸，例如，天冬氨酸(d)，或谷氨酸(e)，代替天然存在的磷酸化氨基酸。在细胞内，蛋白质通常通过添加磷酸基团在丝氨酸，酪氨酸和苏氨酸氨基酸处被修饰。本发明的仿磷酸化(也称为“磷酸模拟”)肽可以通过用带负电的氨基酸残基，例如，天冬氨酸(d)或谷氨酸(e)取代磷酸化残基(例如，丝氨酸残基)(以模拟磷酸基团的负电荷)来获得。天冬氨酸和谷氨酸在化学上与磷酸化丝氨酸(“磷酸-丝氨酸”)相似。例如，当天冬氨酸取代丝氨酸时，它是磷酸-丝氨酸的仿磷酸化物，并且所得到的肽总是处于其磷酸化形式，因此具有组成性活性。在一些情况下，本文提供的仿磷酸化肽具有如seqidno：2所示的氨基酸序列(rrrggeasrslplpkrprr)。该肽在实施例部分中被称为nucxtert-e，包含代替在seqidno：1的位置6处存在的丝氨酸残基的谷氨酸(e)(rrrggsasrslplpkrprr)。在其他情况下，本文提供的仿磷酸化肽具有如seqidno：7所示的氨基酸序列(rrrggdasrslplpkrprr)，其中所述肽包含天冬氨酸(d)代替在seqidno：1的位置6处存在的丝氨酸残基。seqidno：1的位置6处的丝氨酸(在实施例部分中被称为nucxtert/nucxtert-w)对应于编码端粒酶的氨基酸序列(omimid187270；genbank：aad30037.1)的位置227。在野生型端粒酶序列的位置227处的丝氨酸的磷酸化使端粒酶的核输入成为可能。在一些情况下，合成肽是分离的肽，其包含与seqidno：6所示序列(rrrggx1asrslplpkrprr)至少80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、99％)同源的氨基酸序列，其中x1是选自以下的仿磷酸化残基：天冬氨酸和谷氨酸，所述分离的肽能够防止tert核易位，其中所述分离的肽少于20个氨基酸。根据具体实施方式，提供如本文所述的仿磷酸化肽用作药物或与一种或多种治疗剂联用。根据更具体的实施方式，提供此类仿磷酸化肽以降低或减轻氧化应激，或用于治疗癌症或用于治疗心脏和/或血管疾病，包括外周血管疾病。外周血管疾病包括但不限于肥大，糖尿病视网膜病变，脂肪血管和其他血管床疾病。在其他情况下，本文提供的合成肽是磷酸缺陷的，其中氨基酸取代从所得的肽或多肽去除磷酸化的氨基酸。例如，磷酸缺陷肽可以包含用不可磷酸化的氨基酸残基如丙氨酸取代seqidno：1所示的肽序列中的磷酸化氨基酸。在一个具体实施方式中，本文提供的磷酸缺陷合成肽具有如seqidno：3所示的氨基酸序列(rrrggaasrslplpkrprr)。该肽在实施例部分中被称为nucxtert-a，包含代替在seqidno：1的位置6处存在的丝氨酸残基的丙氨酸(a)(rrrggsasrslplpkrprr)。如上所述，seqidno：1的位置6处的丝氨酸(在实施例部分中被称为nucxtert/nucxtert-w)对应于编码端粒酶的氨基酸序列(omimid187270；genbank：aad30037.1)的位置227。在一些情况下，本文提供的合成肽包含聚(乙二醇)部分。此类肽在本文中称为聚乙二醇化肽。如本文所用，术语“聚乙二醇化”是指通过聚乙二醇化将聚(乙二醇)(“peg”)残基共价连接至肽。在一些情况下，肽在n-和/或c-末端聚乙二醇化以增加生物稳定性和细胞渗透性。例如，本发明的合成肽可以具有如seqidno：4所示的聚乙二醇化氨基酸序列(ac-cggrrrggeasrslplpkrprr-peg12-酰胺，其中“ac”指乙酰化，其可以通过阻止n-末端降解来增加肽稳定性)。肽的n-末端半胱氨酸的乙酰化形成衍生的n-乙酰基-l-半胱氨酸。如本文所用，术语“聚乙二醇化”是指多肽n-末端的聚(乙二醇)残基和/或内部赖氨酸残基的共价连接。蛋白质的聚乙二醇化在现有技术中是众所周知的并且由例如veronese，f.m.，biomaterials22(2001)405-417综述。peg可以使用不同的官能团和具有不同分子量的聚乙二醇，直链和分支以及分叉的peg以及不同的连接基团连接(也参见francis，g.e.等，int.j.hematol.68(1998)1-18；delgado，c.等，crit.rev.ther.drugcarriersystems9(1992)249-304)。本文所用的术语“peg”、“聚乙二醇”或“聚(乙二醇)”指任何水溶性的聚(环氧乙烷)，并且包括含有-(ch2ch2o)n-结构(其中n是2至约800的整数)的分子。常用的peg是封端的peg，其中所述peg的一端被相对无活性基团(如烷氧基)封端，而另一端则是可被进一步修饰的羟基基团。常用的封端基团是甲氧基，而对应的封端的peg通常称作mpeg。概念peg通常用作mpeg的替代。通常，聚乙二醇化反应中使用的peg聚合物分子具有约10kda至40kda的分子量(本文所用的“分子量”应理解为peg的平均分子量，因为作为聚合化合物的peg不是以确定的分子量获得，但实际上具有分子量分布；术语“约”表示在所述peg制剂中，一些分子的重量大于指定分子量并且一些小于指定分子量，即术语约是指分子量分布，其中95％的peg分子的分子量在指定分子量的+/-10％以内)。peg是熟知的在多种水性和有机溶剂中具有良好溶解性的聚合物，其显示低毒性，无免疫原性并且澄清、无色、无味且稳定。由于这些原因和其他原因，已经选择peg作为用于连接的优选聚合物，但其仅用于说明而非限制的目的。可以用其他水溶性聚合物获得类似产品，包括但不限于：聚乙烯醇，其它聚(氧化烯)如聚(丙二醇)等，聚(氧乙基化多元醇)如聚(氧乙基化甘油)等，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐，和聚氨基酸。本领域技术人员将能够基于期望的剂量，循环时间，对蛋白水解的耐受性和其他考虑来选择期望的聚合物。多种peg衍生物市售可得且适合应用于本发明peg-偶联肽的制备。合适的peg衍生物是平均分子量为约5至约40kda，在一个实施方式中为约20至约40kda，优选约30kda至约35kda的活化peg分子。peg衍生物在一个实施方式中是直链或支链peg。可以从谢氏聚合物有限公司(shearwaterpolymers)(美国阿拉巴马州亨茨维尔，万维网上的nektar.com)获得适用于制备本文提供的聚乙二醇化肽的多种peg衍生物。在其他情况下，本文提供的合成肽可以通过豆蔻酰化而包含豆蔻酰基。本文所用，术语“豆蔻酰化”和“豆蔻酰基化”是指脂化修饰，其中衍生自豆蔻酸的豆蔻酰基通过酰胺键共价连接至n-末端甘氨酸残基的α-氨基。豆蔻酰基是14碳饱和脂肪酸(c14)，它使蛋白质对膜有足够的疏水性和亲和性，但不足以将蛋白质永久锚定在膜上。通常，n-豆蔻酰化因此作为构象定位开关起作用，其中蛋白构象变化影响肽或多肽对膜附着的亲和性。由于这种条件定位，选择性定位于膜的信号蛋白，如src家族激酶，是n-豆蔻酰化的。适用于本文提供的肽的其他肽修饰包括但不限于糖基化，乙酰化，磷酸化，以及添加肽接头如半胱氨酸接头或间隔物。肽修饰可发生在肽的n-末端和/或c-末端。例如，肽的氨基和/或羧基末端可以被修饰产生本发明的其他化合物。氨基末端修饰包括甲基化(即，-nhch3或-n(ch3)2)，乙酰化(例如用乙酸或其卤代衍生物如α-氯乙酸，α-溴乙酸或α-碘乙酸)，添加苄氧基羰基(cbz)基团，或用任何封端基团封闭氨基末端，所述封端基团含有由rcoo-定义的羧酸酯官能团或由r-so2-定义的磺酰基官能团，其中r选自烷基，芳基，杂芳基，烷基芳基等，以及类似的基团。人们还可以在n-末端掺入脱氨基酸(从而不存在n-末端氨基)以降低对蛋白酶的易感性或限制肽化合物的构象。在优选的实施方式中，n-末端被乙酰化。在最优选的实施方式中，n-末端甘氨酸被乙酰化以产生n-乙酰基甘氨酸(acg)。在一些情况下，使用间隔物或接头例如半胱氨酸(cys)接头来连接各种部分(例如放射性标记结合部分，螯合部分，间隔物部分)或货物分子(例如核酸，肽核酸(pna)，磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(pmo)，锁核酸(lna)，反义寡核苷酸，短干扰rna(sirna)，肽，环肽，蛋白质，抗体或药物)与本文提供的肽。例如，肽可以共价连接至与放射性同位素，例如锝-99m稳定复合的放射性标记结合部分。通常，接头序列允许肽与被载物分子的化学连接。在某些情况下，接头序列起着隔离肽与被载物的间隔物的作用。就含cys的接头序列而言，半胱氨酸残基允许形成二硫化物，硫醚或硫醇-马来酰亚胺键。优选地，氨基酸间隔物和被载物分子通过共价键化学连接。另一方面，本文提供了一种合成肽，其是tert线粒体定位抑制剂。通过模拟tert的线粒体定位信号，抑制性肽阻断或减弱内源性端粒酶从细胞质移动到线粒体的能力。在一些情况下，抑制tert线粒体定位的合成肽是具有如seqidno：5所示的氨基酸序列(mpraprcravrsllrshyre)的肽。该肽在实施例部分中被称为mitoxtert。本发明的肽可以例如通过使用标准固相技术来生物化学合成。这些方法包括专有固相合成，部分固相合成方法，片段缩合，经典溶液合成。当肽相对较短(即10kda)和/或当其不能通过重组技术产生(即，不由核酸序列编码)并因此涉及不同化学时，优选使用这些方法。固相多肽合成过程在本领域中是公知的并且由johnmorrowstewart和janisdillahayoung，《固相多肽合成》(solidphasepolypeptidesyntheses)(第二版，皮尔斯化学公司(piercechemicalcompany)，1984)进一步描述。合成肽可以通过制备型高效液相色谱纯化[creightont.(1983)蛋白质，结构和分子原理(proteins，structuresandmolecularprinciples).w.h.弗里曼出版社(whfreemanandco.)纽约]，并且其组成可通过氨基酸测序确认。重组技术也可用于产生本发明的肽和/或多肽。当肽与异源蛋白质(即融合蛋白)连接时，这些技术可能是优选的，因为重组技术更适合于产生较长的多肽(例如长于20个氨基酸)及其大量。这类重组技术描述于bitter等，(1987)methodsinenzymol.153：516-544，studier等，(1990)methodsinenzymol.185：60-89，brisson等，(1984)nature310：511-514，takamatsu等，(1987)emboj.6：307-311，coruzzi等，(1984)emboj.3∶1671-1680和brogli等，(1984)science224：838-843，gurley等，(1986)mol.cell.biol.6∶559-565以及weissbach和weissbach，1988，《植物分子生物学方法》(methodsforplantmolecularbiology)，学术出版社，纽约州，第viii部分，第421-463页。下文提供异源蛋白质的示例。为了使用重组技术产生本发明的肽和/或多肽，将编码本发明的核靶向肽的多核苷酸连接到核酸表达载体中，所述核酸表达载体包含在顺式调控序列(例如启动子序列)的转录控制下的多核苷酸序列，其适于引导宿主细胞中本发明多肽的组成型，组织特异性或可诱导转录。除了包含用于插入的编码序列(编码多肽)的转录和翻译的必需元件之外，本发明的表达构建体还可以包括工程改造以优化所表达的肽的稳定性，生产，纯化，产量或活性的序列。因此，可以使用多种标准蛋白质纯化技术来纯化本发明的肽和/或多肽，所述标准蛋白质纯化技术例如但不限于亲和层析，离子交换层析，过滤，电泳，疏水相互作用层析，凝胶过滤层析，反相色谱法，伴刀豆球蛋白a色谱法，色谱聚焦，和差异增溶。为了便于回收，表达的编码序列可以经工程改造以编码本发明的多肽和融合的可剪切部分。可以设计这样的融合蛋白使得可以通过亲和色谱容易地分离多肽；例如，通过固定在对可切割部分特异性的柱上。当在多肽和可切割部分之间工程改造切割位点时，可以通过用在该位点特异性切割融合蛋白的合适酶或试剂处理来从色谱柱释放多肽(例如参见booth等，immunol.lett.19：65-70(1988)；和gardella等，j.biol.chem.265：15854-15859(1990))。本发明的肽和/或多肽优选以“基本纯的”形式回收。如本文所用，短语“基本纯的”是指允许在本文所述的应用中有效使用蛋白质的纯度。“分离的”表示明显或基本没有其天然状态中通常伴随的组分的物质。例如，如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等包括从其天然细胞环境中，以及与细胞其它组分的结合体外分离和/或纯化肽或多肽分子；即，它与体内物质没有显着关联。使用方法本文提供了采用本文所述的一种或多种tert定位抑制剂的治疗方法。在一个方面，本文提供了用于减少与癌症治疗(例如，用化疗剂治疗)相关的心脏毒性的方法，其中所述方法包括或基本由以下步骤组成：在给予化疗剂之前或期间向对象给予tert核易位抑制剂。在一些情况下，tert核定位抑制剂与一种或多种化疗剂连续或同时给予以减少与这种化疗剂有关的心脏和血管毒性。与心脏和血管毒性相关的化疗剂包括但不限于抑制端粒酶的那些，以及多柔比星和酪氨酸激酶抑制剂。不直接靶向tert的抗癌药物通常会抑制酶，导致脱靶效应。给予tert核定位抑制剂降低了心脏和血管毒性，否则所述心脏和血管毒性会造成剂量限制。核端粒酶活性对细胞和肿瘤自噬的激活是重要的，这是化疗抵抗机制的关键，该机制使许多肿瘤对化疗不敏感。不受任何特定机制或作用模式的束缚，据信nls肽抑制剂和其他tert核定位抑制剂保留线粒体tert功能，同时减少或消除端粒酶的核功能。如实施例中所述，端粒酶的核功能对于细胞转化和肿瘤发生而言是重要的。因此，向接受化疗的对象给予tert核定位抑制剂可以增加化疗剂的功效，同时保护心脏和血管组织免受化疗相关毒性。另一方面，本文提供了用于减轻与氧化应激相关的氧化应激和代谢作用的方法，其中所述方法包括或基本由以下步骤组成：向对象给予治疗有效量的本文提供的抑制tert核定位的肽，由此给予的肽增强线粒体功能。不受任何特定机制或作用模式的束缚，据信nls肽抑制剂和tert核定位的其它抑制剂减少氧化应激并减少线粒体dna损伤。作为减轻氧化应激的手段，本文所述的肽和它们的衍生物可用于治疗和改善具有显着氧化应激成分的疾病，包括帕金森病，萎缩性侧索硬化症(als)，阿尔茨海默氏病和其他神经退行性疾病。另一方面，本文提供了用于降低或改善与给予血管紧张素ii相关的负面血管收缩作用的方法，其中所述方法包括或基本由以下步骤组成：在给予血管紧张素ii之前、期间、或之后给予本文提供的抑制tert核定位的肽。如以下实施例中所述，在本文所述的nls肽抑制剂存在下，冠状动脉和脂肪血管对血管紧张素ii的血管收缩特性较不敏感。angii在许多不同的病变中升高，包括一些高血压状态。如此，本文所述的肽抑制剂及其衍生物可用于治疗慢性和急性高血压。另一方面，本文提供了用于降低接受tki疗法的对象中酪氨酸激酶抑制剂(tki)疗法的不良或脱靶效应的方法。在一些恶性肿瘤如慢性粒细胞白血病中，持续性酪氨酸激酶抑制剂治疗可维持长期缓解。然而，人们逐渐认识到，随着患者寿命继续延长，tki具有血管副作用。另外，tki治疗在多年的过程中最终失败，可能是因为肿瘤细胞能够通过诱导自噬而逃避tki治疗的破坏。用于减少tki的不良或脱靶效应的方法包括或基本由以下步骤组成：向有需要的对象给予tert核定位抑制剂，由此给予预防、治疗或改善tki对血管系统的脱靶效应。另一方面，本文提供了治疗或预防肿瘤转移的方法。还提供了用于减少或抑制肿瘤细胞迁移的方法。所述方法包括或基本由以下步骤组成：向有需要的对象给予tert核定位抑制剂，由此给予预防、治疗或改善tki对血管系统的脱靶效应。另一方面，本文提供了治疗或预防心脏病的方法。给予tert核定位抑制剂可有效治疗或预防心脏病症或疾病，包括但不限于冠状动脉疾病，高血压和心肌梗塞。因此，本文提供了预防或治疗心脏病症或疾病的方法，其中所述方法包括或基本由以下步骤组成：向易患运动相关心肌梗塞的对象，向由于心肌梗塞后受损的血流介导的血管扩张而易患心脏病的对象，向具有冠状动脉疾病(cad)的对象，向具有正常心脏血管呈现心脏病症或病症的发作的对象给予tert核易位抑制剂。在一些情况下，该方法还包括治疗心肌梗塞(mi)后的对象。另一方面，本文提供了预防或治疗内皮功能障碍的方法，其中所述方法包括或基本由以下步骤组成：向对象给予治疗有效量的tert核定位抑制剂。内皮功能障碍的特征是丧失屏障功能和细胞物质渗入血管壁并丧失生理性血管张力。如本文所用，对“治疗内皮功能障碍”被认为是在治疗与内皮功能障碍相关的病症中改善内皮功能。此类疾病包括短暂性脑缺血发作，中风，心绞痛，心肌梗塞，心力衰竭和外周血管疾病等大血管病变(与大血管有关)，以及微血管病变(与小血管有关)，例如糖尿病视网膜病变(非增殖性，增殖性，黄斑水肿)，微量白蛋白尿，大量白蛋白尿，末期肾病，勃起功能障碍，自主神经病变，周围神经病变，骨髓炎和下肢缺血。tert核定位抑制剂的给予可以改善对象的内皮功能，并且在一些情况下，治疗受损血管的血管痉挛诱导的心绞痛。本文提供的方法特别有用的其他疾病和病症包括与内皮功能障碍相关的疾病和病症。这些疾病和病症包括但不限于，糖尿病，血脂异常，高血压，心肌梗塞，心血管疾病，冠状动脉疾病(cad)，微血管疾病，缺血性疾病，外周动脉疾病，由血管痉挛引起的心绞痛(例如，变异型(prinzmetal)心绞痛)先兆子痫和慢性肾脏疾病。根据该方法的治疗治疗或预防涉及内皮功能障碍的慢性心脏和血管病变。优选地，该方法预防或治疗冠状内皮功能障碍(ced)。在某些情况下，对象被诊断为患有或疑似患有ced，并且因此被确定为需要治疗以预防或降低经历冠状病症或cad的风险。一旦被确定为患有ced或怀疑患有ced，则可以用tert核定位抑制剂治疗对象以预防或降低发生cad事件的风险。在一些情况下，tert核定位抑制剂在限定的时间段内给予一次或多次。在优选实施方式中，短期给予抑制剂是适当的。在其他情况下，tert核定位抑制剂的靶向递送优选用于限制给予于对象后的全身暴露。有效量的治疗剂可以取决于各种因素，例如所用特定药物的活性，给药频率，治疗持续时间，所治疗病症的严重程度，以及治疗中的哺乳动物的病症和既往病史。起初可将低于有效剂量的剂量给予哺乳动物，然后可随着时间的推移逐渐增加剂量，直至达到所需的效果。另一方面，本文提供了调节内皮功能的方法，其中所述方法包括或基本由以下步骤组成：向对象给予有效量的tert线粒体易位抑制剂，由此给予tert线粒体易位抑制剂调节对象的内皮功能。给予的频率和持续时间可以是改善(例如ced的)症状而没有毒性的任何频率或持续时间。例如，药剂可以每天给予一次或两次，隔日给予一次，每周给予一次或两次，或根据需要给予。给药频率可以保持恒定或可以在治疗的持续时间内变化。治疗的有效持续时间可以从几周到几个月或几年不等。例如，治疗的有效持续时间可以是六个月，五年或终生。另外，治疗过程可以包括休息时间。多种因素可以影响治疗的实际有效频率和持续时间。例如，所使用的特定治疗剂的活性，所治疗病症的严重程度，所给予的剂量，以及所治疗的哺乳动物的病症和既往病史可影响治疗的有效频率和持续时间。本文提供的组合物可主要经口，静脉内，肠胃外，舌下或经皮给予。相应的药物制剂优选以液体或固体形式产生。除了悬浮液，乳液，糖浆剂，片剂，薄膜片剂，包衣片剂，胶囊剂，丸剂，粉末剂，锭剂，植入剂，栓剂，乳膏剂，凝胶剂，药膏，膏药或其他透皮系统之外，溶液剂尤其适用于此目的，尤其适用于制备滴剂，注射剂或气雾剂喷雾剂。术语“约”或“大约”表示在本领域普遍技术人员确定的特定数值的可接受误差范围内，这将取决于该数值的测量或确定方式，即测量体系的极限。例如，“约”可按本领域实践表示在1个标准偏差之内或大于1个标准偏差。或者，关于所述组合物的“约”可指加减至多20％的范围，优选至多10％，更优选至多5％。除非上下文另有明确说明，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义。因此，例如，提及“一个分子”包括一个或多个此类分子，“一种试剂”包括一种或多种此类不同试剂，提及“一种抗体”包括一种或多种此类不同抗体，以及提及“所述方法”包括提及本领域普通技术人员已知的能够改进或取代该方法和本文所述药物组合物的相当步骤和方法。除非另有限定，在此使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解一致。鉴于上述详细描述，本发明的许多变体将对于本领域技术人员是不言自明的。所有这些明显的修改都在所附权利要求的完整预期范围内。通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例仅被认为是说明性的，决不限制本发明的范围。实施例端粒酶的过度表达与心脏和血管保护有关(bar等，2014)；然而，鉴于端粒酶在细胞永生化和增殖中的作用，在某些细胞类型中端粒酶的再活化也可能是致癌转化中的重要事件。端粒酶的再活化在预防和改善心脏和血管疾病中的有益作用的基础机制至今尚不清楚。我们在此报告发现线粒体相关端粒酶而非核端粒酶是与端粒酶活性相关的心血管保护的原因。我们已经开发了能够特异性改变端粒酶定位的新型肽疗法。抑制端粒酶的催化亚单位tert的核转运增加细胞质(包括线粒体)端粒酶定位和更重要的活性。这代表了一种利用在心脏和血管疾病中端粒酶过度表达的益处而不增加癌症风险的策略，并且还提供了以较低毒性的方式抑制癌症中的核端粒酶的全新手段。此外，这些新型疗法可以与传统和靶向的癌症疗法相结合，以最小化对血管系统和心脏的毒性。我们的数据表明端粒酶定位的调节可能是治疗微血管，血管和心脏疾病(包括慢性和急性病症)的全新方式的基础。具体来说，我们表明增加的tert线粒体易位(通过抑制核易位)具有有益的作用，包括预防血管紧张素ii(angii)诱导的内皮功能障碍和氧化应激，这是许多心血管事件的明确预测因子。实施例1-使用肽来调节端粒酶定位：血管功能和疾病的启示方法诱饵肽开发：基于先前进行的端粒酶nls的表征设计包含端粒酶nls的诱饵肽(chung等，cellsci，2012.125(pt11)：第2684-97页)。基于人端粒酶(htert；uniproto14746)的氨基酸序列设计肽序列。肽合成和处理：肽合成由genemed合成公司(genemedsynthesis)(得克萨斯州圣安东尼奥(sanantonio，tx))进行。所有肽序列均通过质谱法验证，并且仅以大于95％的纯度使用。冻干的肽储存在-20摄氏度。考虑到这些研究中使用的肽的荷电性质，选择磷酸盐缓冲盐水(pbs)作为溶解所有使用的肽的溶剂。在pbs中溶解肽后，将肽等分试样(以使冷冻/解冻循环最小化)储存在-80摄氏度。对于标记肽的实验，在由genemed合成公司进行的合成过程中将5-羧基荧光素标签添加至肽(n末端)。具体肽序列在下表1中详述。表1.端粒酶定位至核或线粒体的示例性肽抑制剂的序列**seqidno：1中的粗体残基表示端粒酶的位置227，其中野生型序列中的丝氨酸被磷酸化以实现端粒酶的核输入。微血管选择：从外科手术丢弃组织解剖得到微血管，其主要由脂肪组成。仅选择直径小于300微米的血管用于进一步研究。根据威斯康星州密尔沃基威斯康星医学院的机构审查委员会(institutionalreviewboard)批准的方案(pro00000114，pro00010828，pro00001094)，从废弃的手术组织获得所有微血管。解剖后，将血管在完全内皮细胞培养基中孵育过夜，所述内皮细胞培养基补充有5％胎牛血清(隆萨公司(lonza))，具有或不具有所述肽。过夜孵育后，洗掉肽并且血管进行插管并转移至生理盐水溶液中。视频显微镜设置可实时监测血管。血管用0.1-1nm剂量范围的内皮素-1(et-1)预收缩。本研究仅包括能够从基线收缩至少20％的血管。然后评估流介导的扩张(fmd)和ach诱导的扩张，随后评估对罂粟碱的内皮非依赖性扩张。建立该基线后，血管再次用et-1预收缩，并在存在血管紧张素ii(angii)的情况下重复扩张曲线，如下所述。fmd通过以两个相同方向和相反方向调整储器的高度以通过改变血管中心压力以产生流来评估。每次压力梯度变化后，使用视频显微镜测量和评估血管直径。在测量fmd之前，所有研究的血管均使用内皮素-1预收缩。分别使用药理学试剂nω-硝基-l-精氨酸甲酯(l-name；100μmol/l)和聚乙二醇-过氧化氢酶(peg-过氧化氢酶；500u/ml)评估扩张中血管对no扩散与过氧化氢信号传递的依赖性)。angii刺激：评估如上所述的基线血管参数，包括响应fmd扩张的能力。评估后，血管用终浓度为10nm的angii处理30分钟，然后重新评估fmd和对ach的响应。细胞培养：nci-h1299细胞系用于本文中描述的细胞培养实验。细胞在补充有10％胎牛血清(西格玛公司(sigma))的rpmi(英杰公司(invitrogen))中培养。细胞分级分离：使用ne-per核和细胞质提取试剂盒(赛默飞世尔科技公司(thermofisher))将处理的h1299细胞分级分离成核和非核组分。ddpcrtrap测定：根据在thermofisherne：per试剂盒中建立的方案获得并分级分离来自用nucxtert肽过夜处理的h1299细胞的细胞裂解物，产生核和非核部分。进行修改的定量端粒酶重复扩增方案(trap测定)。简而言之，将来自用thermofisherne：per方案分离的核部分的2微克裂解物和来自非核部分的4微克蛋白质裂解物与先前描述的ts寡核苷酸孵育，并使产物延伸，对kim等描述的原始程序稍作修改。在产生重复之后，使用qx200(伯乐公司(biorad))液滴发生器使样品经过液滴产生，其使用油∶水乳液产生用于分析的单个液滴。然后使用标准热循环仪对样品进行pcr，并且由kim等概述了条件。pcr后，将样品加载到qx200微滴读取器中并对液滴进行取样以确定每个单独样品中存在的阳性液滴的百分比。western印迹：如上所述，在将h1299细胞分级分离到核和非核室中后制备蛋白质裂解物。分级分离后，使用bca测定对每个样品中的蛋白质进行定量。从各部分获得30μg蛋白质。裂解物被煮沸并变性。将含有加载染料的样品加载到4-12％bis-tris凝胶中。施加110v电流持续75分钟以按大小分离蛋白质。然后将蛋白质在100v，冰上并冷却下转移至pvdf膜(伯乐公司(biorad))2小时。转移后，将膜用溶于吐温-20tris-缓冲盐水(tbst)中的10％粉末封闭剂(伯乐公司)在室温下封闭2小时。封闭后，将膜与溶解于5％封闭剂tbst中的一抗(抗htert(兔)，罗克兰德公司(rockland)，1∶500；抗gapdh(兔)，细胞信号转导技术公司(cellsignalingtechnology)，1∶1000；抗组蛋白h3，细胞信号转导技术公司，1∶1000)在4℃下孵育过夜。孵育过夜后，用tbst彻底洗膜，并与1∶5000稀释的抗兔抗体(细胞信号转导技术公司)孵育2小时。彻底洗涤后，将膜与femto检测溶液(htert；组蛋白h3)或bioradecl溶液(gapdh)一起孵育。然后使用ecl检测系统(伯乐公司)对膜成像。结果nucxtert抑制剂被活组织有效摄入：评估新肽改变端粒酶定位能力时需要考虑的首要障碍之一是它们被活体组织内化的能力。用5-羧基荧光素(5-fam)标记nucxtert。通过显微镜分析用5-fam标记的肽孵育的分离的人微血管。在用肽脉冲的血管中存在强信号，而未用肽处理的血管没有信号。类似地，使用人非小细胞肺癌(h1299)细胞的体外实验证实标记的肽有效流入细胞。另外，肽可以以核周图案检测(图2)。由于肽被血管摄入，所以可以使用方法中所述的人微血管研究肽处理对血管生理学的影响。表2详细说明了本章进行的实验中剩余者分离的微血管的患者特征。表2.患者特征风险因素**所有微血管从脂肪样品中分离；***一个使用的非-cad血管的患者特征不可得nucxtert抑制剂改变端粒酶定位：端粒酶活性测定以及western印迹，如图3a-3b所示，揭示用nucxtert肽脉冲的h1299细胞已经降低了端粒酶的核水平。如通过trap测定所测量的(图3b)，这反映在端粒酶活性降低中。此外，用nucxtert处理会增加端粒酶在非核隔室内的积聚。nucxtert保护人类微血管免受应激物影响：用nucxtert预处理分离的人微血管，并用血管紧张素ii(angii)(一种参与多种疾病病变(肥胖，高血压，肾衰竭，cad等)的有效血管收缩剂和血管应激物)刺激。使用增加的腔内流动(血流介导的扩张或“fmd“)或内皮依赖性激动剂乙酰胆碱(ach)诱发血管舒张。使用罂粟碱测试平滑肌依赖性和内皮细胞非依赖性扩张。用angii处理微血管导致血管扩张剂对乙酰胆碱和血流量的响应显着降低，如通过占最大直径的百分比所测量的。用已知的全局端粒酶活性的特异性抑制剂bibr1532(pascolo等，jbiolchem，2002)处理微血管有效地消除响应于乙酰胆碱的血管舒张(图4a，右上)，尽管血管响应于血流刺激而持续扩张(图4b，右上)。当用nucxtert预处理血管时，响应ach或血流刺激的血管舒张不受angii处理的影响。然而，用nucxtert和bibr1532处理有效地消除了nucxtert的血管舒张保护作用，表明催化端粒酶活性是nucxtert在对angii激发的响应中保持基线血管舒张所必需的。有趣的是，当用mitoxtert抑制剂(包含端粒酶mls区域的诱饵肽)预处理血管时，观察到无论血流还是ach刺激都不能保护内皮免于angii应激。我们推测这是由于该肽与端粒酶竞争进入线粒体的能力；然而，需要额外的工作，包括针对端粒酶表达的线粒体分级分离和western印迹来说明mitoxtert是否能够影响端粒酶蛋白的线粒体积累(图4a-4b，左下图)。因此，我们的体内和体外数据表明nucxtert和mitoxtert肽拮抗血管紧张素ii(angii)的不良心脏作用，血管紧张素ii引起显着的心脏和血管损伤并且与高血压和许多其他cv疾病状态相关。nucxtert修饰的肽差异性地保护血管系统：以前并未知晓或证明tert活性的全面抑制增加了对应激诱导的内皮功能障碍的敏感性，并且对心血管结果具有负面影响，但是特异性抑制核tert定位和核活性通过维持线粒体tert功能对血管系统具有保护作用。如本节所述，发现用tert肽抑制剂处理分离的人血管减弱了血管对包括angii在内的应激物的响应，表明肽抑制剂可保护血管系统免于由许多慢性病变，氧化应激物质和与血管和心脏毒性有关的化疗引起的损伤。翻译后修饰在经调节蛋白的细胞运输中起关键作用。野生型nucxtert是与存在于端粒酶中的核定位信号之一同源的合成肽。位置227的丝氨酸残基可被磷酸化以引发蛋白质的核易位。我们基于该一级序列合成了几种变体，包括在位置227含有谷氨酸取代的仿磷酸化物(nucxtert-e)，以及在端粒酶编码序列的227位具有丙氨酸的非磷酸化取代突变体(nucxtert-a；参见表1中详述的肽序列)。有趣的是，nucxtert-a不能保护血管免受响应angii刺激(采用流扩张刺激或乙酰胆碱(ach)扩张刺激)的血管扩张能力的衰减(图5)。用a肽以10μm浓度过夜孵育的血管具有142μm±38的平均直径。用e肽孵育的血管的平均直径为145μm±49。a和e肽处理的血管之间的基线血管收缩相似，经过10分钟的et-1处理后，a处理的血管收缩至其最大直径的平均53±12％，而在10分钟的et-1处理后，e肽处理的血管收缩至其最大直径的平均48±18％。在用angii处理和通过流梯度刺激后，a肽处理的血管在100cm流梯度下扩张至82μm±11的直径。相反，在angii治疗后(图5a和5b，右图)，e肽处理的血管在100cm血流梯度下扩张至136μm±51的平均直径。当a肽处理的血管暴露于angii并用ach刺激时，血管扩张至128μm±33的平均直径。用angii处理并用ach刺激的e肽处理的血管扩张至131μm±24的平均直径。本文称为nucxtert-e的仿磷酸化nucxtert在血流和ach刺激条件下在分离的微血管中防止angii诱导的内皮功能障碍，其水平与野生型序列的处理无法区分。nucxtert抑制剂恢复带病组织中的健康血管扩张机制：显示血管功能障碍的带病微血管从具有临床确认的冠状动脉疾病的供体的脂肪组织获得。在基线时，这些血管通过使用h2o2作为扩张的信号机制来响应血管舒张刺激。用过氧化氢清除剂，peg-过氧化氢酶处理血管可有效减弱血管舒张。然而，用一氧化氮合酶抑制剂l-name处理不会影响带病血管扩张的能力。相反，来自健康供体的血管呈现相反的趋势；用peg-过氧化氢酶处理不影响扩张潜力，而用l-name处理显著减弱血管流动刺激的能力。在cad患者的血管中，h2o2代表主要的血管扩张剂。在用nucxtert预处理的血管中，no被恢复作为fmd的主要机制。另外，用peg-过氧化氢酶处理不再抑制扩张反应(图6，上图)。与之形成鲜明对比的是，用mitoxtert处理导致健康血管经历相反的变化，从no介导的扩张到h2o2依赖性扩张(图6，下图)。分离的血管研究中的聚乙二醇化nucxterte的剂量滴定：具柜s-＞e取代的nucxtert在c-末端聚乙二醇化以增加生物稳定性和细胞渗透性。测试了从10μm到1nm的有效剂量(图7a-7c)。聚乙二醇化肽可以滴定低至1nm，具有血管保护作用。fmd的机制不改变(l-name可抑制，图7b)，但保护免于angii诱导的内皮功能障碍(图7c)。肽的体内生物分布：为了测定肽的体内生物分布，聚乙二醇化肽(50nm)用锝(tc99m)进行放射性标记用于放射性追踪。将锝标记的肽(0.77nm)注射到正常c57小鼠的尾静脉中。对于图8a-8k，在注射后2、4和8小时将小鼠安乐死，并在个体器官中测定剩余的放射性。信号被归一化至血液。在每个主要器官中，观察到信号显着增加直至注射后8小时，表明此时肽未降解。在图8l中，给小鼠皮下(subq)注射放射性标记的肽(0.77nm)，并在24和48小时后在血液中测定剩余的活性。尽管subq小鼠中的信号与iv注射相比显着较低，但是在24小时而不是48小时后观察到相对于背景的信号增加。这些数据表明肽在注射subq后在循环中分布持续至少24小时。由于肽带正电荷，我们的数据表明该肽穿过血脑屏障-这是本文提供的肽的有利特性，可证明其对脑血管功能障碍或神经病症的治疗非常重要。在体内cns中具有生物活性的肽为神经疾病脑血管疾病开辟了可能的治疗选择领域。peg-nucxtert的体内作用：为了测试nucxtert体内作用，用常用应激处理小鼠以诱导高血压和内皮功能障碍。快速升压剂量的angii(1000ng/kg/分钟)通过渗透微型泵灌输14天。使用nucxtert(30μg/天，通过渗透微型泵)和angii共同处理一小组动物，持续时间相同，使用相同的递送系统。将曲线与历史对照(载剂)进行比较。如图9所示，angii引起激动剂诱导的内皮依赖性扩张(ach)或fmd的显著降低。与nucxtert共处理预防了angii诱导的内皮功能障碍的发生。针对罂粟碱的平滑肌依赖性扩张没有受到影响(数据未显示)。讨论我们证明我们的合成核端粒酶抑制剂(nucxtert)肽很容易被活的人微血管摄入。此外，体外实验证明肽摄入在培养的人细胞系中发生，并且如预期的那样，该肽定位于核周区(图2)。使用数字液滴pcr(ddpcr)的改良trap测定法的蛋白质印迹和端粒酶活性分析揭示，用nucxtert处理显著降低核端粒酶的积累和活性，并伴随细胞质积聚和活性的相应增加(图3)。有趣的是，通过nucxtert处理保护从健康患者的脂肪组织解剖得到的分离的人微血管免受血管应激物的影响(图4)。使用含有谷氨酸的经修饰的nucxtert肽在内源性nls的位置227处进行丝氨酸取代也显示显著的血管保护作用。然而，在相同位置用丙氨酸取代丝氨酸会消除nucxtert的功效，表明这是该肽功能的关键残基，并且我们对该肽的合成修饰可增强功能(图5)。我们还确定nucxtert能够改变导致冠状动脉疾病患者组织中血管舒张的机制。如在健康微血管中所看到的，用nucxtert处理使血管扩张恢复主要为一氧化氮(no)依赖性机制。相反，用对应于端粒酶的线粒体定位序列(mls)的肽mitoxtert处理导致通常依赖于no介导的扩张的健康组织依赖于过氧化氢响应流而扩张(图6)。用全身端粒酶活化剂预处理血管显示端粒酶活性对血管系统抵抗应激物的能力具有保护作用。在心脏损伤和心肌梗塞模型中，这一点在体内也得到了极大的证实，在啮齿动物模型中，使用aav载体过表达端粒酶可以显着提高复苏率并降低心梗后死亡率(等，2014)。鉴于数据表明端粒酶可以调节血管舒张的机制，问题或酶在何处起作用是非常显著的。我们在这里已经证明使用诱饵肽可以有效地操纵端粒酶库。具体而言，将端粒酶转移至主要非核定位也导致血管保护。有趣的是，当端粒酶的催化活性受到抑制时，这种血管保护作用消除。这表明血管保护性表型依赖于端粒酶活性，并且该抑制剂特异性操纵端粒酶。几种不同肽的开发进一步揭示了nucxtert作用的特异性；在一个残基处的突变有效地阻止肽保护血管系统。这强烈表明这是一种高度特异性的治疗性；离体观察到的保护作用不是由于用非特异性肽处理组织，相反，这种特定的肽是特异性的。最引人注目的是，转移端粒酶的定位能够在新鲜分离的冠状动脉疾病患者的微血管中恢复正常血管舒张功能和正常的血管舒张机制(no介导对比过氧化氢)。这立即表明这种方法的实用性和这些治疗剂在该患者群体中纠正与这种疾病状态相关的血管功能障碍的效用。此外，它表明这种方法在治疗其他涉及微血管功能障碍的心脏和血管疾病(包括但不限于cad，变异型(prinzmetal)心绞痛等)方面的实用性。迄今为止，很少有有效的治疗方法可用于解决潜在的血管功能障碍，而这是大多数心血管疾病的重要组成部分。我们提供了可用于治疗急性和慢性冠心病，心血管疾病的一种新方法和几种新化合物。尽管全身范围内增加端粒酶水平的化合物的广泛使用可能引起鉴于加速或启动细胞转化潜力的担忧，但这些肽的致癌风险明显较低。当使用nucxtert肽时发生的核端粒酶活性的抑制也可以用作癌症治疗。实际上，激活核端粒酶活性的天然抑制剂途径的最近策略已经成功地表明，该方法通过抑制自噬的启动来增加癌症对化疗剂的敏感性。处于临床试验中的端粒酶抑制剂已经显示出抗肿瘤功效。然而，如bibr1532所证实的，在全身水平上抑制端粒酶的催化活性很可能导致严重的血管损伤。这些疗法可能会增加内皮功能障碍并增加如血栓形成等风险。考虑到患者可能需要采取抗端粒酶方案以观察抗肿瘤活性的时间长度，这特别令人不安。试图重新移动内源性端粒酶库以防止肿瘤细胞增殖所需的端粒延长(核活性)可以抑制肿瘤细胞增殖，同时还通过保留内皮中线粒体的端粒酶功能而显著降低内皮损伤或血栓形成事件的风险。许多现有的抗癌疗法也间接抑制端粒酶活性，导致血管损伤和血栓形成风险增加。nucxtert肽可以通过转移端粒酶核库来保护内皮细胞健康，从而帮助解决这些毒性问题。应该进行一些额外的研究来验证用nucxtert处理后，端粒酶确实不仅定位于细胞质，而且更特异性地定位于线粒体隔室。此外，应该进行确认用仿磷酸化肽(nucxtert-e)处理后以及使用磷酸化缺陷肽(nucxtert-a)处理后改变的端粒酶定位的实验。这些实验将涉及分级分离处理的细胞和潜在的血管，随后进行western印迹和trap测定实验以验证线粒体隔室内的蛋白质水平和活性增加。实施例2-nls肽抑制剂可减少肺肿瘤细胞迁移最近的出版物显示了增加端粒酶活性的短期心脏保护作用(bar等)和间接激活核端粒酶活性的天然抑制抑制了细胞自噬的激活-这是肿瘤化疗耐药性的关键原因之一。我们的数据表明所述肽抑制剂可降低高度侵袭性和转移性肺肿瘤细胞系的迁移潜力。以下参考文献通过引用全文纳入本文：bar，c.等，端粒酶表达在急性心肌梗塞后成年小鼠心脏中赋予心脏保护作用(telomeraseexpressionconferscardioprotectionintheadultmouseheartafteracutemyocardialinfarction).natcommun，2014.5：第5863页.widlansky，m.e.等，内皮功能障碍的临床启示(theclinicalimplicationsofendothelialdysfunction).jamcollcardiol，2003.42(7)：第1149-60页.freed，j.k.等，神经酰胺在人微循环中将血流诱导的血管舒张的介质从一氧化氮变为过氧化氢(ceramidechangesthemediatorofflow-inducedvasodilationfromnitricoxidetohydrogenperoxideinthehumanmicrocirculation).circulationresearch，2014.115(5)：第525-532页.beyer，a.m.等，腔内压力的急剧上升使人动脉中血流介导的扩张介质从一氧化氮转变为过氧化氢(anacuteriseinintraluminalpressureshiftsthemediatorofflow-mediateddilationfromnitricoxidetohydrogenperoxideinhumanarterioles).americanjournalofphysiology-heartandcirculatoryphysiology，2014：p.ajpheart.00557.2014.kothawade，k.和c.n.baireymerz，女性微血管性冠状动脉功能障碍：病理生理学，诊断和控制(microvascularcoronarydysfunctioninwomen：pathophysiology,diagnosis，andmanagement).currproblcardiol，2011.36(8)：第291-318页.leeansyah，e.等，人类免疫缺陷病毒(hiv)核苷(酸)逆转录酶抑制剂对端粒酶活性的抑制：促成hiv相关加速老化的潜在因素(inhibitionoftelomeraseactivitybyhumanimmunodeficiencyvirus(hiv)nucleos(t)idereversetranscriptaseinhibitors：apotentialfactorcontributingtohiv-associatedacceleratedaging).journalofinfectiousdiseases，2013：p.jit006.eitan，e.等，小鼠脑中新的端粒酶增加化合物延迟了肌萎缩侧索硬化的发作(noveltelomerase-increasingcompoundinmousebraindelaystheonsetofamyotrophiclateralsclerosis).embomolmed，2012.4(4)：第313-29页.spilsbury，a.等，端粒酶蛋白tert在阿尔茨海默病和体外tau相关病变中的作用(theroleoftelomeraseproteintertinalzheimer′sdiseaseandintau-relatedpathologyinvitro).jneurosci，2015.35(4)：第1659-74页.mouraret，n.等，端粒酶在肺动脉高压中的作用(rolefortelomeraseinpulmonaryhypertension).circulation，2015.131(8)：第742-55页.asai，a.等，一种新型端粒酶模板拮抗剂(grn163)作为潜在抗癌剂(anoveltelomerasetemplateantagonist(grn163)asapotentialanticanceragent).cancerres，2003.63(14)：第3931-9页.santos，j.，d.gutterman，和a.beyer，线粒体端粒酶通过抑制线粒体衍生的自由基产生来调节血流介导的扩张(664.1)(mitochondrialtelomeraseregulatesflowmediateddilationbysuppressingmitochondrialderivedfreeradicalproduction(664.1)).thefasebjournal，2014.28(增刊1)：第664.1页.hockenberry，j.，d.d.gutterman，和a.m.beyer，端粒酶催化亚基过表达保护免于血管紧张素ii诱导的血管功能障碍(overexpressionofthecatalyticsubunitoftelomeraseprotectsagainstangiiinducedvasculardysfunction).hypertension，2014.64(增刊1)：第a538-a538页.chung，j.，p.khadka，和i.k.chung，htert的核输入需要双向核定位信号和akt介导的磷酸化(nuclearimportofhtertrequiresabipartitenuclearlocalizationsignalandakt-mediatedphosphorylation).jcellsci，2012.125(pt11)：第2684-97页.santos，j.h.等，线粒体htert加剧自由基介导的mtdna损伤(mitochondrialhtertexacerbatesfree-radical-mediatedmtdnadamage).agingcell，2004.3(6)：第399-411页.pascolo，e.等，合成的非核苷类药物候选物bibr1532抑制人端粒酶的机制(mechanismofhumantelomeraseinhibitionbybibr1532，asynthetic，non-nucleosidicdrugcandidate).jbiolchem，2002.277(18)：第15566-72页.jeong，s.a.等，akt介导的磷酸化增加了htert对于输入蛋白α的结合亲和性以促进核移位(akt-mediatedphosphorylationincreasesthebindingaffinityofhtertforimportinαtopromotenucleartranslocation).j.cellsci.，2015：p.jcs.166132.kim，n.w.等，人端粒酶活性与永生细胞和癌症的特异性关联(specificassociationofhumantelomeraseactivitywithimmortalcellsandcancer).science，1994.266(5193)：第2011-5页.mender，i.和j.w.shay，端粒酶重复扩增方案(trap)(telomeraserepeatedamplificationprotocol(trap)).bioprotoc，2015.5(22).已通过一个或多个优选的实施方式描述了本发明，但应理解除了明确描述的那些方案之外，许多等同方案、替代方案、变化方案和修改方案是可能实现的并在本发明范围内。序列表<110>威斯康星州医药大学股份有限公司（themedicalcollegeofwisconsin,inc）j·d·艾本（ebben,johnathan）a·m·拜尔（beyer,andreas）<120>端粒酶易位的肽抑制剂及其治疗用途<130>650053.00423<150>62/211,524<151>2015-08-28<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>1argargargglyglyseralaserargserleuproleuprolysarg151015proargarg<210>2<211>19<212>prt<213>人工序列<220><223>仿磷酸化nucxtert-e<400>2argargargglyglyglualaserargserleuproleuprolysarg151015proargarg<210>3<211>19<212>prt<213>人工序列<220><223>磷酸缺失nucxtert-a<400>3argargargglyglyalaalaserargserleuproleuprolysarg151015proargarg<210>4<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>peg化加帽变体nucxtert<400>4cysglyglyargargargglyglyglualaserargserleuproleu151015prolysargproargarg20<210>5<211>20<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>5metproargalaproargcysargalavalargserleuleuargser151015histyrargglu20<210>6<211>19<212>prt<213>人工序列<220><223>变体nucxtert<220><221>变体<222>(6)..(6)<223>x是asp或glu<400>6argargargglyglyxaaalaserargserleuproleuprolysarg151015proargarg<210>7<211>19<212>prt<213>人工序列<220><223>仿磷酸化天冬氨酸肽<400>7argargargglyglyaspalaserargserleuproleuprolysarg151015proargarg当前第1页12当前第1页12