一种全血DNA提取试剂盒及提取方法与流程

本发明涉及DNA提取技术领域，具体涉及全血DNA提取试剂盒及其提取方法。

背景技术：

随着分子生物学技术的发展，基因组水平上的研究已成为热点。在分子遗传学和分子流行病学中，无论是全基因组关联分析(GWAS)、候选SNP位点基因分型，还是基因组文库的建立，都需要从各类样本中提取基因组DNA。由于血液样本取材方便，所含基因组DNA丰富可靠，因此上述许多研究均以血液作为样本提取完整的基因组DNA。提取纯化得到的基因组DNA浓度、纯度和一级结构的完整性都会影响到后续的研究，因此高效、可靠的基因组DNA提取方法是分子遗传学基础研究迫切需要的。

目前基因组DNA提取纯化的方法有很多种，如苯酚氯仿抽提法、SDS法、离心柱法和磁珠法。这些方法各有优缺点，但都应考虑以下原则：防止和抑制DNase对DNA的降解；尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏，保持DNA分子的完整；排除其他核酸分子的污染；排除有机溶剂和金属离子的污染；将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净。

基于纳米磁珠的DNA提取技术是利用亲水性纳米磁珠特异性地吸附样品溶液的DNA分子，在外加磁场的作用将吸附的DNA-磁珠复合物从样品溶液中分离，通过洗涤液洗涤去除溶液中的蛋白和盐离子，最后在仅留有特异吸附DNA的磁珠中加入洗脱液，将DNA释放于洗脱液中。磁珠法提取基因组DNA与上述其它方法相比，不使用有毒试剂，操作简单，不易污染，已经成为目前分子生物学和临床检验医学研究的理想方法。

技术实现要素：

为了解决上述不足的缺陷，本发明提供了一种全血DNA提取试剂盒及提取方法，提取纯化步骤少，操作简便，整个过程不涉及有毒试剂，安全便捷，所得基因组DNA含量高，完整度好，纯度高，可直接用于后续检测。

本发明提供了一种全血DNA提取试剂盒，包括裂解液、纳米磁珠、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液。

上述的试剂盒，其中，所述裂解液包括异硫氰酸胍、碘化锂、柠檬酸三钠、Tween 20，所述纳米磁珠包括包裹有二氧化硅的Fe₃O₄,洗涤液A包括异硫氰酸胍、Tris-HCL和无水乙醇，所述洗涤液B包括Tris-HCL、NaCL和无水乙醇，所述洗脱液包括Tris-HCL、EDTA二钠。

上述的试剂盒，其中，所述裂解液pH值为4.0-7.0，包含浓度3-5mM的异硫氰酸胍、浓度1-5M的碘化锂、浓度50-200mM的柠檬酸三钠和1％-5％Tween20。

上述的试剂盒，其中，所述纳米磁珠包括包裹有二氧化硅的Fe₃O₄，直径为200-2000nm，浓度为50-200mg/ml。

上述的试剂盒，其中，所述洗涤液A包含浓度1-4mM的异硫氰酸胍、pH 7.0-9.0浓度10-50mM的Tris-HCL和20％-50％的无水乙醇。

上述的试剂盒，其中，所述洗涤液B包含pH 7.0-9.0浓度1-5mM的Tris-HCL、浓度10-50mMNaCL和50％-80％的无水乙醇。

上述的试剂盒，其中，所述洗脱液包含pH为7.0-9.0浓度5-20mM的Tris-HCL和pH 8.0-9.0浓度0.5-3mM的EDTA二钠。

本发明的另一面，本发明还提供了一种全血DNA提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：

步骤S1：取50-200ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入100-500ul裂解液和50-200mg/ml的纳米磁珠10-30ul，震荡混匀1min，室温静置10min；

步骤S2：将步骤S1中的离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；

步骤S3：使用无菌移液枪头向步骤S2离心管中加入500-800ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；

步骤S4：使用无菌移液枪头向步骤S3离心管中加入500-800ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液，室温开盖干燥10-20min直至管内无液体残留；

步骤S5：使用无菌移液枪头向步骤S4离心管中加入100-200ul洗脱液，65℃水浴5-10min；

步骤S6：将步骤S5离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。

本发明具有以下优点：提取纯化步骤简单、操作过程安全便捷、基因组DNA产物含量高，完整度好，纯度高。通过简单的操作步骤得到高纯度、完整的基因组DNA，方便研究人员进行后续的实验。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明及其特征、外形和优点将会变得更明显。在全部附图中相同的标记指示相同的部分。并未刻意按照比例绘制附图，重点在于示出本发明的主旨。

图1为本发明的全血DNA提取方法与QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(血液)提取方法的基因组DNA完整度比较示意图。

图2是本发明的全血DNA提取方法与QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(血液)提取方法的基因组DNA中β-actin荧光PCR Ct值比较示意图。

具体实施方式

在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

为了彻底理解本发明，将在下列的描述中提出详细的步骤以及详细的结构，以便阐释本发明的技术方案。本发明的较佳实施例详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本发明还可以具有其他实施方式。

本发明提供了一种全血DNA提取试剂盒，包括裂解液、纳米磁珠、洗涤液A、洗涤液B和洗脱液。

在本发明一优选但非限制的实施例中，裂解液包括异硫氰酸胍、柠檬酸三钠、Tween 20，所述纳米磁珠包括包裹有二氧化硅的Fe₃O₄,洗涤液A包括异硫氰酸胍、Tris-HCL和无水乙醇，所述洗涤液B包括Tris-HCL、NaCL和无水乙醇，洗脱液包括Tris-HCL、EDTA二钠。

在本发明一优选但非限制的实施例中，裂解液pH值为4.0-7.0，包含浓度3-5mM的异硫氰酸胍、浓度50-200mM的柠檬酸三钠和1％-5％Tween 20。

在本发明一优选但非限制的实施例中，纳米磁珠包括包裹有二氧化硅的Fe₃O₄，直径为200-2000nm，浓度为50-200mg/ml。

在本发明一优选但非限制的实施例中，洗涤液A包含浓度1-4mM的异硫氰酸胍、pH 7.0-9.0浓度10-50mM的Tris-HCL和20％-50％的无水乙醇。

在本发明一优选但非限制的实施例中，洗涤液B包含pH 7.0-9.0浓度1-5mM的Tris-HCL、浓度10-50mMNaCL和50％-80％的无水乙醇。

在本发明一优选但非限制的实施例中，洗脱液包含pH为7.0-9.0浓度5-20mM的Tris-HCL和pH 8.0-9.0浓度0.5-3mM的EDTA二钠。

本发明的另一面一种基因组DNA提取试剂盒的提取方法，包括以下步骤：

步骤S1：取50-200ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向该离心管中加入100-500ul裂解液和50-200mg/ml的纳米磁珠10-30ul，震荡混匀1min，室温静置10min；

步骤S2：将步骤S1中的离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；

步骤S3：使用无菌移液枪头向步骤S2离心管中加入500-800u l洗涤液A，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液；

步骤S4：使用无菌移液枪头向步骤S3离心管中加入500-800u l洗涤液B，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液，室温开盖干燥10-20min直至管内无液体残留；

步骤S5：使用无菌移液枪头向步骤S4离心管中加入100-200u l洗脱液，65℃水浴5-10min；

步骤S6：将步骤S5离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。

以下举出本发明的具体实施例。

实施例1

1)取50ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向离心管中加入200ul裂解液和50mg/ml的纳米磁珠10ul。加纳米磁珠之前可将纳米磁珠充分混匀。震荡混匀1min，室温静置10min。其中，裂解液内加入的成分分别是：浓度3mM的异硫氰酸胍、浓度150mM的柠檬酸三钠和2％Tween 20，其余成分为水。裂解液的pH值为6.0。

2)将该离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。

3)从磁力架上取出离心管，使用无菌移液枪头向该离心管中加入500ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。其中，洗涤液A内加入的成分分别是：浓度1mM的异硫氰酸胍、pH 7.5且浓度15mM的Tris-HCL和50％的无水乙醇，其余成分为水。

4)从磁力架上取出离心管，使用无菌移液枪头向该离心管中加入500ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。其中，洗涤液B内加入的成分分别是：pH 7.5且浓度1mM的Tris-HCL、浓度10mM NaCL和80％的无水乙醇，其余成分为水。

5)从磁力架上取出离心管，室温开盖干燥10min直至管内无液体残留。

6)使用无菌移液枪头向该离心管中加入100ul洗脱液，65℃水浴10min。其中，洗脱液内加入的成分分别是：pH 7.5且浓度5mM的Tris-HCL和pH 8.0且浓度2mM的EDTA二钠，其余成分为水。洗脱液的pH值为8.0。

7)将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。

实施例2

1)取200ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向离心管中加入500ul裂解液和200mg/ml的纳米磁珠30ul。加纳米磁珠之前可将纳米磁珠充分混匀。震荡混匀1min，室温静置10min。其中，裂解液内加入的成分分别是：浓度5mM的异硫氰酸胍、浓度150mM的柠檬酸三钠和2％Tween 20，其余成分为水。裂解液的pH值为6.0。

2)将该离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。

3)从磁力架上取出离心管，使用无菌移液枪头向该离心管中加入800ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。其中，洗涤液A内加入的成分分别是：浓度1mM的异硫氰酸胍、pH 7.5且浓度15mM的Tris-HCL和50％的无水乙醇，其余成分为水。

4)从磁力架上取出离心管，使用无菌移液枪头向该离心管中加入800ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。其中，洗涤液B内加入的成分分别是：pH 7.5且浓度1mM的Tris-HCL、浓度10mM NaCL和80％的无水乙醇，其余成分为水。

5)从磁力架上取出离心管，室温开盖干燥20min直至管内无液体残留。

6)使用无菌移液枪头向该离心管中加入300ul洗脱液，65℃水浴10min。其中，洗脱液内加入的成分分别是：pH 7.5且浓度5mM的Tris-HCL和pH 8.0且浓度2mM的EDTA二钠，其余成分为水。洗脱液的pH值为8.0。

7)将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。

实施例3

1)取100ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向离心管中加入300ul裂解液和100mg/ml的纳米磁珠10ul。加纳米磁珠之前可将纳米磁珠充分混匀。震荡混匀1min，室温静置10min。其中，裂解液内加入的成分分别是：浓度5mM的异硫氰酸胍、浓度150mM的柠檬酸三钠和2％Tween 20，其余成分为水。裂解液的pH值为6.0。

2)将该离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。

3)从磁力架上取出离心管，使用无菌移液枪头向该离心管中加入500ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。其中，洗涤液A内加入的成分分别是：浓度1mM的异硫氰酸胍、pH 7.5且浓度15mM的Tris-HCL和50％的无水乙醇，其余成分为水。

4)从磁力架上取出离心管，使用无菌移液枪头向该离心管中加入500ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。其中，洗涤液B内加入的成分分别是：pH 7.5且浓度1mM的Tris-HCL、浓度10mM NaCL和80％的无水乙醇，其余成分为水。

5)从磁力架上取出离心管，室温开盖干燥20min直至管内无液体残留。

6)使用无菌移液枪头向该离心管中加入100ul洗脱液，65℃水浴10min。其中，洗脱液内加入的成分分别是：pH 7.5且浓度5mM的Tris-HCL和pH 8.0且浓度2mM的EDTA二钠，其余成分为水。洗脱液的pH值为8.0。

7)将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。

在本发明中，对照试剂1选用QIAampDNAMiniKit提取100ul新鲜全血样本，洗脱体积为100ul。对照试剂2选用上海生工磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(血液)提取100ul新鲜全血样本，洗脱体积为100ul。

实施例4

1)取100ul新鲜全血样本于1.5ml离心管中，使用无菌移液枪头向离心管中加入100ul裂解液和100mg/ml的纳米磁珠20ul。加纳米磁珠之前可将纳米磁珠充分混匀。震荡混匀1min，室温静置10min。其中，裂解液内加入的成分分别是：浓度5mM的异硫氰酸胍、浓度150mM的柠檬酸三钠和2％Tween 20，其余成分为水。裂解液的pH值为6.0。

2)将该离心管置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。

3)从磁力架上取出离心管，使用无菌移液枪头向该离心管中加入500ul洗涤液A，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。其中，洗涤液A内加入的成分分别是：浓度1mM的异硫氰酸胍、pH 7.5且浓度15mM的Tris-HCL和50％的无水乙醇，其余成分为水。

4)从磁力架上取出离心管，使用无菌移液枪头向该离心管中加入500ul洗涤液B，将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸弃上清溶液。其中，洗涤液B内加入的成分分别是：pH 7.5且浓度1mM的Tris-HCL、浓度10mM NaCL和80％的无水乙醇，其余成分为水。

5)从磁力架上取出离心管，室温开盖干燥20min直至管内无液体残留。

6)使用无菌移液枪头向该离心管中加入200ul洗脱液，65℃水浴10min。其中，洗脱液内加入的成分分别是：pH 7.5且浓度5mM的Tris-HCL和pH 8.0且浓度2mM的EDTA二钠，其余成分为水。洗脱液的pH值为8.0。

7)将该离心管震荡混匀1min，置于磁力架上30s，待纳米磁珠完全吸至管壁之后，使用无菌移液枪头吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。

在本发明中，对照试剂1选用QIAamp DNA Mini Kit提取100ul新鲜全血样本，洗脱体积为100ul。对照试剂2选用上海生工磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(血液)提取100ul新鲜全血样本，洗脱体积为100ul。

将实施例3、对照试剂1和对照试剂2，提取完成后，分别取基因组DNA溶液5ul做1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如附图1所示。

参照图1所示，使用本发明建立的基于纳米磁珠的全血DNA提取试剂盒及提取方法，将其实验结果与QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(血液)的实验结果比较，结果表明，本发明提取的全血基因组DNA完整度与QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(血液)的基因组DNA完整度处于同一水平。而且具有提取纯化步骤简单、操作过程安全便捷。

将实施例3、对照试剂1和对照试剂2，提取完成后，分别取基因组DNA溶液2ul，使用ThermoFisher的NanoDrop 2000超微量生物检测仪检测基因组DNA浓度和纯度，结果如表1所示。

表1

参照表1所示，本发明提取的全血DNA的纯度与QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(血液)的基因组DNA纯度处于同一水平。对于基因组DNA的浓度明显优于对照试剂盒。

将实施例3、对照试剂1和对照试剂2，提取完成后，分别取基因组DNA溶液5ul做靶标为β-action的荧光定量PCR，结果如附图2和表2所示。

表2

参照图2和如表2所示，本发明提取的全血DNA的浓度明显高于QIAamp DNA Mini Kit和上海生工磁珠法基因组DNA抽提试剂盒(血液)的基因组DNA浓度。

以上对本发明的较佳实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，这并不影响本发明的实质内容。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。