一种重组人尿激酶原的纯化及去除病毒方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种尿激酶原纯化及去除病毒方法。

背景技术：

尿激酶原(Prourokinase,简称pro-UK)是一类丝氨酸蛋白酶,可以激活体内的纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶,从而溶解血栓中的纤维蛋白,因此在溶血栓的治疗方面有着广泛的应用。pro-UK中Lys158-Ile159间肽键容易被纤溶酶及其他一些酶类水解,生成尿激酶(urokinase,简称UK)。UK由A链和B链两条肽链组成,靠链间二硫键连接。和UK相比,pro-UK和纤维蛋白的亲和力较高,激活纤溶系统的部位常在血栓形成的部位,因而引起全身出血倾向的副作用要比尿激酶小,是一种更优越的纤溶酶原激活剂。Pro-UK和UK之间往往只有一个多肽键的差异,两者在分子表面特性、抗原性以及分子量方面非常相似,pro-UK也极易转化为UK，常规层析方法难以将其分离，所以细胞表达的发酵液纯化一方面要除去培养基和细胞正常代谢产物，另一方面要去除UK，因此pro-UK下游纯化非常困难。

中国专利CN1680550A公开了一种重组人尿激酶原的纯化方法，包括如下4步：A、用阳离子交换Streamline-SP扩张床色谱从工程细胞培养上清中回收重组人尿激酶原；B、用Sephacryl S-200凝胶色谱进一步纯化上述A收集的尿激酶原粗品；C、用对氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow亲和色谱法除去粗产品中的尿激酶；D、用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱除去重组人尿激酶原中残留细胞的DNA。其中，为了达到更好地实验效果，在步骤C和D之间还可包括步骤E：用阳离子交换Streamline-SP固定床色谱浓缩尿激酶原，浓缩可达10～15倍左右，以方便后续操作。

然而，该方法仍然存在蛋白纯度不高、会存在宿主细胞DNA、宿主细胞残留蛋白及病毒等外源性污染的问题。CN1680550A的方法安全性不高，主要原因是完成D步骤后是产品原液，原液将作为注射用重组人尿激酶原的原料进行制剂，但D步骤中所采用的Tris-HCl缓冲液将会进入到成品，直接通过静脉注射进入人体。 Tris-HCl缓冲液对人体具有一定的刺激性，一般只用于研究而不能用于人体，Tris-HCl缓冲液直接进入人体会对人体产生一定的危害，因此不适宜作为原液的缓冲体系。

上海天士力生产的重组人尿激酶原为通过基因工程方法构建的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达获得的，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治疗，已于2011年作为国家一类新药成功上市。

国家食品药品监督管理局药品审评中心制定的《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》(简称原则)规定，凡是用细胞表达的人用生物制品均要求对生产用细胞株、细胞培养液、产品原液和产品进行病毒检测，并要求纯化工艺中有灭活或除去病毒的步骤，以确保产品不被病毒污染及用药安全。

为了适应临床研究，提供一种临床安全有效，副作用小、高纯度的重组人尿激酶原纯化及去除方法是急需解决的事情。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新的CHO细胞表达的重组人尿激酶原的蛋白纯化及去除病毒方法，该方法得到蛋白纯度不低于98％，且清除了Tris-HCl缓冲液的残留和病毒，有效降低了临床使用风险。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明以CHO细胞表达的重组人尿激酶原的发酵液为起始原料，进行以下本发明的纯化步骤。

本发明提供了一种重组人尿激酶原的纯化及去除病毒方法，将尿激酶原发酵液通过层析后获得的初步纯化液加入低pH孵育和纳米过滤的步骤去除病毒而尿激酶原直接被洗脱下来，从而达到去除病毒的目的。

所述病毒包括但不限于如细小病毒、白血病病毒和狂犬病毒等。

本发明所述的尿激酶原发酵液通过CN 1062016、CN1178244(说明书第5页7-9的方法)、公开的方法制备得到。

本发明所述的低pH孵育步骤是指控制初步纯化液孵育温度，用酸调节pH值3.0-4.0后开始低pH孵育，再用碱调节溶液pH值7.0±0.5；即得孵育后的 初步纯化液(简称孵育后中间体3)。

所述的酸包括但不限于盐酸。

所述的碱包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠等，优选氢氧化钠。

进一步地，低pH孵育步骤是指初步纯化液置温度稳定的恒温水浴锅内，控制初步纯化液孵育温度22-28℃，(优选23-25℃)搅拌，用稀盐酸调节pH值3.0-4.0后开始低pH孵育，孵育30-90min，再用1-4M(优选3-4M)的NaOH调节溶液pH值7.0±0.5；即得孵育后的初步纯化液(简称孵育后中间体3)。

本发明之所以选择孵育时间30-90min(优选30-60min)，在病毒灭活的过程中病毒可能存在逃逸现象，一个点的病毒滴度达到要求，不代表后面的点的病毒滴度都能达到要求，一般会再做一到两个点证明我们想取的那个时间点的病毒滴度是真正的达到了灭活的要求。

本发明所述的纳米滤过步骤是指：孵育后的初步纯化液即孵育后中间体3经过层析洗脱后得到的洗脱液经过纳米膜过滤，病毒富集在纳米膜上，收集滤液即得本发明的尿激酶原。

所述纳米膜孔径为15-30nm，优选孔径20nm。

本发明优选在纳米膜过滤前进行用微孔滤膜预过滤，所述微孔滤膜的孔径0.1-0.45μm，优选0.1μm。预过滤过程是为了除掉蛋白复融过程中的蛋白聚集成的颗粒，以免堵掉纳米小孔滤膜。

上述滤膜的材质为PVDF聚偏二氟乙烯膜。

具体地，优选纳米膜滤过步骤为：孵育后的初步纯化液即孵育后中间体3经过层析洗脱后得到的洗脱液经0.1μm孔径的PVDF预过滤器+20nm孔径的PVDF纳米过滤器，在压力不超过5bar的条件下收集滤液，过滤完成后用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液进行顶洗，收集滤液即可本发明的重组人尿激酶原原液。

本发明所述的初步纯化液是经过一定纯化步骤，使得重组人尿激酶原蛋白纯度达到一定标准≥95％的尿激酶原纯化中间体。可通过现有技术例如，通过免疫亲和层析法，或是阳离子交换层析和免疫亲和层析法等方法纯化方法制备完成。为了达到更好的技术效果，优选本发明的初步纯化液是通过下述方法完成的步骤 (1)蛋白捕获：尿激酶原发酵液选用阳离子交换层析法得到纯化中间体1；

步骤(2)凝胶层析：中间体1通过凝胶层析法获得纯化中间体2；

步骤(3)阳离子交换层析：中间体2通过阳离子交换层析法获得初步纯化液简称纯化中间体3；

进一步地，步骤(1)中所述发酵液取上清液调节pH值至5.5～6.5后阳离子交换层柱法上样(优选pH值至6.0)，采用0.005～0.015mol/L(优选0.008～0.01mol/L)磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化中间体1。

所述的阳离子交换层析柱填料包括但不限于Streamline SP、SP Sepharose F.F.，优选Streamline SP阳离子填料。所述的磷酸盐缓冲液为含NaCl的磷酸盐溶液，优选pH6.0±0.5含0.05～0.7mol/L NaCl。

为达到更好的洗脱效果，优选先用磷酸盐缓冲液平衡层析柱后再上样洗脱，所述平衡层析柱的磷酸盐缓冲液含NaCl的浓度低于洗脱时磷酸盐缓冲液含NaCl的浓度，也就是说低盐磷酸盐缓冲液平衡层析柱，再用高盐磷酸盐缓冲液洗脱层析柱。目的是通过缓冲液平衡使目标蛋白带正电荷，吸附在填料上，再通过缓冲液使目标蛋白带负电荷洗脱下来。缓冲液的pH值可以改变目标蛋白的电荷性质，盐离子(NaCl)浓度调节电荷强度。平衡层析柱时的磷酸盐缓冲液中加入低浓度的NaCl可增加目标蛋白的电荷强度，从而增强阳离子填料对目标蛋白的捕获能力。接下来通过高盐(NaCl的浓度高于平衡时NaCl浓度)缓冲液洗脱使目标蛋白的离子强度降低，降低其与目标蛋白的结合能力。如果洗脱时的缓冲液盐离子浓度过高(≥0.8mol/L NaCl)会将吸附在填料上的其它杂蛋白一并洗脱下来进入纯化中间体1。因此本发明的洗脱时磷酸缓冲液的浓度pH6.0±0.5含0.3-0.7mol/L NaCl。

具体为，

步骤(1)以Streamline SP阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)进行平衡，发酵液取上清液调节pH值至5.5～6.5后上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0±0.5含0.3-0.7mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸 收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化中间体1。

本发明的步骤(2)中间体1上凝胶层析柱后，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰即为纯化中间体2。

所述的凝胶层析柱的填料包括但不限于Sephacryl S-200HR、Sephadex G-50，优选Sephacryl S-200HR凝胶分子筛。所述的磷酸盐缓冲液为含NaCl的磷酸盐溶液，优选(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)。

为达到更好的洗脱效果，优选先用磷酸盐缓冲液层析柱后再上样洗脱，平衡时磷酸盐缓冲液浓度与洗脱时磷酸盐缓冲液相同。

具体为，

以Sephacryl S-200HR凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析。层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐平衡缓冲液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体1直接上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐洗脱缓冲液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体2。

进一步地，本发明的步骤(3)中间体2调节pH值至6.0±0.5后阳离子交换层析柱上样，用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为初步纯化液简称纯化中间体3。

所述的阳离子交换层析柱填料包括但不限于SP Sepharose F.F.、SP Sephadex C-50，优选SP Sepharose F.F.阳离子填料。所述的磷酸盐缓冲液为含NaCl溶液，优选pH5.5～7.5含0.05～0.35mol/L NaCl。

为达到更好的洗脱效果，优选先用磷酸盐缓冲液平衡层析柱后再上样洗脱。所述平衡层析柱的磷酸盐缓冲液含NaCl浓度低于洗脱时磷酸盐缓冲液含NaCl浓度，也就是说低盐磷酸盐缓冲液平衡层析柱，再用高盐磷酸盐缓冲液洗脱层析柱。优选(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)进行平衡。所述的磷酸盐缓冲液洗脱时，采用从低盐到高盐两步梯度洗脱，优选pH5.5～7.5含0.20～0.35mol/L NaCl。第一次用低盐的缓冲液洗脱，洗脱杂质蛋白，收集目标蛋白，第二次用高盐的缓冲液洗脱，既可以进一步除去杂蛋白，同时还可以将纯化中间 体3进行浓缩后洗脱。这样获得的纯化中间体3的杂蛋白更少，目标蛋白量不变，但体积更小了，便于生产贮存。

具体为：

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体2调节pH值至6.0±0.5后上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐低盐缓冲液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)洗脱杂质，0.005～0.015mol/L磷酸盐高盐缓冲液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)洗脱目标蛋白，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为初步纯化液简称纯化中间体3。

该步骤(3)能够更好的分离杂质蛋白及目标蛋白，浓缩得到高纯度的中间体3。

纯化中间体3可于-20℃以下冷冻储存。待需要下一步操作时可提前取出复融混合，并进行第(4)步低pH孵育操作，得到孵育后的纯化中间体3。

本发明纳米滤过步骤中所述的孵育后的初步纯化液即孵育后中间体3，进一步经过层析洗脱后得到的洗脱液，优选通过下述方法制备：

步骤(A)亲和层析：孵育后中间体3通过亲和层析法获得纯化中间体4；

步骤(B)阴离子交换层析：中间体4通过阴离子交换层析法获得纯化中间体5；

步骤(C)阳离子交换层析：中间体5通过阳离子交换层析法获得洗脱液简称纯化中间体6。

进一步地，本发明步骤(A)孵育后纯化中间体3pH值至7.0±0.5后亲和层析柱上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐洗脱缓冲液进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体4。

所述的亲和层析柱填料包括但不限于Benzamidine Sepharose 4FF H-sub、Arginine Sepharose 4B，优选Benzamidine Sepharose 4FF H-sub亲和填料。所述的磷酸盐缓冲液为含NaCl溶液，优选pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl。

优选先用磷酸盐缓冲液层析柱后再上样洗脱，平衡时磷酸盐缓冲液浓度与洗 脱时磷酸盐缓冲液相同。

步骤(A)主要目的是除出去UK，具体为，

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub亲和填料为介质进行亲和层析。层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)进行平衡。多批纯化中间体3的冷冻蛋白溶液复融及混合，混合溶液调节pH值至7.0±0.5后上样。采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体4。

本发明步骤(B)纯化中间体4与0.02～0.035mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0±0.5)按1：2体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后阴离子交换柱上样，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体5。

所述的阴离子交换柱填料包括但不限于Streamline DEAE、DEAE Sephacel DE-52，优选Streamline DEAE阴离子填料。所述的Tris-HCl缓冲液为含盐或不含盐的Tris-HCl缓冲液，优选pH8.0±0.5含0～0.20mol/L NaCl，进一步优选中间体4与不含盐Tris-HCl缓冲液混合。优选先用Tris-HCl含盐缓冲液平衡层析柱后再上样洗脱，平衡时Tris-HCl缓冲液含盐浓度高于洗脱时Tris-HCl缓冲液含盐浓度。优选平衡时Tris-HCl缓冲液液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl，洗脱时Tris-HCl洗脱缓冲液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)。

具体，本发明第B步阴离子层析的原理是，通过阴离子填料吸附带负电荷的DNA、宿主细胞残留蛋白及病毒等。在Tris-HCl缓冲液基础上增加NaCl，增强杂质的负电荷强度，从而增加阴离子填料对DNA等杂质的吸附。

以Streamline DEAE阴离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.015～0.025mol/L Tris-HCl平衡缓冲液(pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体4与0.02～0.035mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0±0.5)按1：2体积比混合，调节pH值至8.0±0.5后上样，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl洗脱缓冲液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体5。

本发明步骤(C)纯化中间体5调节pH值至6.0±0.5后阳离子交换层析柱上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为本发明所要得到的洗脱液简称纯化中间体6。

所述的阳离子交换层析柱填料包括但不限于SP Sepharose F.F.、SP Sephadex C-50，优选SP Sepharose F.F.阳离子填料，本发明所述的磷酸盐缓冲液为含NaCl溶液，优选pH5.5～7.5含0.05～0.5mol/L NaCl。

为了更好的洗脱，优选先用磷酸盐缓冲液层析柱后再上样洗脱，所述平衡层析柱的磷酸盐缓冲液含NaCl浓度低于洗脱时磷酸盐缓冲液含NaCl浓度，也就是说低盐磷酸盐缓冲液平衡层析柱，再用高盐磷酸盐缓冲液洗脱层析柱。优选(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)进行平衡，用(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)洗脱。

该步骤(C)用磷酸盐缓冲液洗脱纯化中间体5，替换了Tris-HCl缓冲液残留，减少刺激性，提高了对人体的安全性，还除去了病毒.

具体为：

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体5调节pH值至6.0±0.5后上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为洗脱液简称纯化中间体6。

用本发明的纳米过滤步骤，过滤纯化中间体6，即可得到本发明的纯化产物：纯的重组人尿激酶原。

进一步优选尿激酶原的纯化及去病毒方法，

本发明的步骤(1)～(3)、低pH孵育步骤、步骤(A)～(C)、纳米过滤步骤联合使用作为尿激酶原的纯化及去除病毒方法，具体为步骤(1)～(8)。见附图1。

步骤(1)蛋白捕获，得到纯化中间体1；

步骤(2)凝胶层析，得到纯化中间体2；

步骤(3)阳离子交换层析，得到纯化中间体3：

步骤(4)低pH孵育，得到孵育纯化中间体3：

步骤(5)亲和层析，得到纯化中间体4；

步骤(6)阴离子交换层析，得到纯化中间体5：

步骤(7)阳离子交换层析，得到纯化中间体6：

步骤(8)纳米过滤，得到人重组尿激酶原原液。

本发明中所述的尿激酶原是指重组人尿激酶原。

本发明的有益效果

为了说明本发明的有益效果，通过下述试验例来阐述

试验例一、增加低pH孵育步骤

1、增加低pH孵育步骤对纯化中间体3的影响

·实验目的：

–考察低pH步骤对纯化中间体3(实施例1步骤1-3)蛋白品质的影响

·实验过程：

–将纯化中间体3分别在pH3.9、3.5及3.0条件下处理90min，

–90min后调节pH值至7.0±0.5

–对比处理前及处理后蛋白含量、生物学活性、比活性、电泳纯度、SEC-HPLC纯度及单链比例等指标

·实验结果：

–初步证明低pH步骤对纯化中间体3蛋白品质无明显影响

2、增加低pH孵育步骤对原液影响

·实验目的：

–通过对低pH条件下处理后的纯化中间体3，进行纯化后三步(实施例1步骤1-7)制备。对制备的原液进行检测评估，以考察低pH孵育对原液的影响。

·实验流程

–分别选用低浓度蛋白及高浓度蛋白进行实验

–将纯化中间体3复融后升温至22-28℃

–调节pH值至3.0-4.0，22-28℃下放置90min

–调节pH值至7.0±0.5

–进行后三步纯化制备原液(纯化中间体6)

–样品送检

·实验结果

–纯化中间体3经过低pH处理后，蛋白浓度、蛋白活性、蛋白纯度(包括SDS-PAGE、SEC-HPLC、RP-HPLC纯度)、唾液酸比例均无显著变化，单链比例略有下降(下降约0.4％)，但是产生多余的UK仍然可以通过后三步纯化去除。

–经过低pH处理后的纯化中间体3，通过Scale-Down模式进行后三步得到的原液，检测项目均符合原液质量标准。

–本次试验输出的低pH处理工艺过程为：

·选取纯化中间体3置于2-12℃环境下复融

·将复融后纯化中间体3置于22-28℃生化培养箱/水浴锅中升温，升温后纯化中间体3升温至22-28℃，并将其取出

·将取出的纯化中间体3用盐酸调节pH值至3.0-4.0之间

·调节后重新置于22-28℃生化培养箱/水浴锅中，放置90min取出

·取出后重新调节pH值至7.0±0.5，进行后三步纯化

3、增加低pH孵育步骤灭活病毒效果验证(实施例1，步骤1-4)

·验证设计见附图2

–pH值：选用pH3.0-4.0作为处理条件；

–处理时间：采用处理80min作为最差条件进行验证(对于低pH孵育来说，时间越短对病毒的灭活效果越差，所以选择比90分钟要小的时间，如果在80分钟时病毒都能全部灭活，90分钟病毒灭活就没有问题)；

–温度：采用22℃孵育作为本次验证的最差条件进行验证(同上，温度越低对病毒灭活效果越差，所以选择最低的22度，来保证26度的效果)；

–蛋白浓度：选用低、中、高三种浓度蛋白进行该验证。

·验证病毒选择

选择小鼠白血病病毒(Mulv)及伪狂犬病毒(PRV)作为指示病毒，病毒信 息如下：表1

·验证结果

表2小鼠白血病病毒(Mulv)检验数据

表3伪狂犬病毒(PRV)检验数据

·如表2-3、图3可见，经低pH孵育的30min，60min，80min的LRV值均大于4，即病毒滴度下降大于4logs(99.99％)，病毒灭活在孵育30min时病毒滴度已经降到最低水平。

试验例二、增加纳米过滤步骤

·病毒去除过滤器选择(实施例1步骤1-8)

–考虑蛋白回收率

–考虑与生产规模相适应的膜面积

–选用20nm孔径的PVDF过滤器作为生产用过滤器

·验证病毒选择

除病毒过滤原理主要利用尺寸拦截原理对病毒进行物理去除，故本次验证选择猪细小病毒(PPV)和小鼠脑心肌炎病毒(EMCV)作为指示病毒，病毒信息如下：表4

·试验方法见图4

·验证结果见表5-6，图5

表5猪细小病毒(PPV)滴度检验数据

·表6小鼠脑心肌炎病毒(EMCV)病毒滴度检验数据

·图5中纵坐标Lg均表示LgTCID50/0.1mL值。

·三批样品的猪细小病毒和小鼠脑心肌炎病毒的降低量均大于4Lgs，纳米过滤可以有效地去除指示病毒；三批样品在过滤全过程的病毒过滤效果均保持稳定。

试验例三、增加低pH孵育和纳米过滤步骤对注射用重组人尿激酶原质量的影响

–原液检验结果

·三批纳米过滤蛋白收率分别为100.2％、101.5％、98.7％

·检验项目均符合注射用重组人尿激酶原原液质量标准要求

–成品检验结果

–检验项目均符合注射用重组人尿激酶原质量标准要求

–原液可比性研究

·原液的氨基酸组成与理论组成保持一致

·原液的二级结构含量与对照品原液含量基本一致

·原液的高分辨分子质量与对照品原液基本一致

·原液的二硫键对数及配对方式与理论及对照品原液一致

–结论：增加了低pH孵育及纳米过滤步骤后，注射用重组人尿激酶原产品品质进行全面质量对比，确认增加的步骤对产品品质无影响。

试验例四、本发明的方法与现有技术的比较

现有技术：CN1680550A

本发明方法：实施例1的方法

(一)、增加纯化第3步阳离子交换层析

试验方法：细胞发酵液分别按照CN1680550A中的方法和本发明方法进行纯化前2步和前3步的操作。按照CN1680550A中的方法经过纯化第1步和第2步后，收集纯化中间体2，本发明方法收集纯化中间体3，分别进行SDS-PAGE电泳。

试验结果：经过图6比较，按照CN1680550A中的方法，在进行第二步凝胶层析后直接将重组人尿激酶原纯化2中间体进行上样，可见含有一条20KD左右的杂质蛋白条带；而在本发明的方法中，加入SP Sepharose F.F.阳离子交换层析的步骤，并分别采用0.005～0.015mol/L磷酸盐高盐洗脱缓冲液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)和0.005～0.015mol/L磷酸盐低盐洗脱缓冲液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)的洗脱液进行洗脱，发现均可将20KD左右的杂质蛋白除去。

由于用0.005～0.015mol/L磷酸盐低盐洗脱缓冲液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)洗脱目标蛋白时，洗脱体积较大，所以最终选择0.005～0.015mol/L磷酸盐低盐洗脱缓冲液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)与0.005～0.015mol/L磷酸盐高盐洗脱缓冲液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)共同作为生产过程中最终洗脱目标蛋白缓冲液较为合适。

表7纯度比较

表7可见，在CN1680550A的纯化方法中，没有SP Sepharose F.F.阳离子交换层析的步骤，在进行凝胶层析之后，直接进行亲和层析，导致蛋白纯度不高，仅为90.660％～96.627％。而在本发明的方法中，增加SP Sepharose F.F.阳离子交换层析的步骤，可使蛋白纯度提高至98.3％～99.8％。

(二)优化纯化第2步凝胶层析缓冲体系中的pH值和盐浓度

1、试验方法：降低CN1680550A中的方法纯化第2步的缓体液的PH值和盐浓度，将纯化1中间体进行纯化第2步时，以吸收峰的最高点为分界线，分别进行吸收，分为前半峰和后半峰，将收到的两个样品分别进行第3步，然后对第3步收到的纯化3中间体进行宿主蛋白残留量(用酶联免疫法检测，按试剂盒使用说明书进行测定。)和SDS-PAGE的检验(药典方法)。

1.1降低纯化第2步凝胶层析缓冲体系中的pH值和盐浓度的电泳图比较

CN1680550A方法：将纯化1中间体进行第2步凝胶层析；

本发明：以Sephacryl S-200HR凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析，层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐平衡缓冲液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体1直接上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐洗脱缓冲液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)洗脱。

1.2降低纯化第2步凝胶层析的缓冲体系中的pH值和盐浓度前后纯化2中间体，分别通过第三步SP Sepharose F.F.阳离子交换层析后的纯化3中间体的电泳图比较

CN1680550A方法：进行第二步凝胶层析后按本发明纯化第3步进行纯化后，将纯化3中间体直接上样；

本发明的方法：以Sephacryl S-200HR凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析。层析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸盐平衡缓冲液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体1直接上样，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐洗脱缓冲液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280 紫外吸收曲线收集目标蛋白峰得到纯化中间体2；采用0.005～0.015mol/L磷酸盐高盐洗脱缓冲液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)进行洗脱；

本发明的方法：采用0.005～0.015mol/L磷酸盐低盐洗脱缓冲液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)进行洗脱得到纯化3中间体进行上样。

2、试验结果：

2.1通过降低纯化第2步凝胶层析的缓冲体系中的pH值和盐浓度，使得凝胶填料对蛋白产生非特异性吸附，延迟目标蛋白峰(峰2)的出峰位置，扩大凝胶的第二杂质峰和主峰之间的间距，分离度大于CN1680550A，从而提高蛋白纯度。

2.2本发明获得的纯化3中间体宿主细胞蛋白残留量远低于CN1680550A中获得的纯化3中间体，优化后去除宿主细胞蛋白能力提高2倍～5倍，见表8。

表8纯化中间体3宿主蛋白残留量(％)

2.3通过降低纯化第2步凝胶层析的缓冲体系中的pH值和盐浓度前后纯化2中间体，分别通过第三步SP Sepharose F.F.阳离子交换层析后的纯化3中间体，可以去除CN1680550A方法不能去除的28KD和32KD的杂蛋白，从而提高了目标蛋白纯度。纯化3中间体SDS-PAGE电泳纯度数据见表9。

表9 SDS-PAGE电泳纯度(％)

综上所述，本发明对CN1680550A中的工艺进行了优化和改进，增加步骤(3)并通过对纯化过程中缓冲液及盐离子浓度的调整，大大降低了杂蛋白的量，提高了目标蛋白纯度，同时大幅降低了DAN、宿主细胞残留蛋白及病毒等外源性污染。并通过第6步采用磷酸盐缓冲液替换Tris-HCl缓冲液，提高了产品的安全性，降低了制剂的临床应用风险，为制剂产品的产业化打下了良好的基础。

附图说明

图1、工艺流程图，其中虚线框内为病毒灭活/去除工艺步骤

图2、低pH孵育灭活病毒效果验证流程图

图3、纳米过滤去除病毒效果验证流程图

图4、SP Sepharose F.F.阳离子交换层析后的样品电泳图

条带1、CN1680550A方法中，在进行第二步凝胶层析后纯化中间体2直接上样，

条带2、本发明的方法中，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐高盐洗脱缓冲液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)进行洗脱；

条带3、本发明的方法中，采用0.005～0.015mol/L磷酸盐低盐洗脱缓冲液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)进行洗脱。

图5、降低纯化第2步凝胶层析的缓冲体系中的pH值和盐浓度前后纯化中间体2，分别通过第三步SP Sepharose F.F.阳离子交换层析后的纯化中间体3电泳图。

色谱峰1：CN1680550A凝胶层析图谱目标蛋白峰

色谱峰2:本发明凝胶层析图谱目标蛋白峰

图6、降低纯化第2步凝胶层析的缓冲体系中的pH值和盐浓度前后纯化2中间体，其中

条带1:凝胶层析上样前样本、

条带2:本发明凝胶层析前半峰

条带3:本发明凝胶层析后半峰

条带4:CN1680550A凝胶层析前半峰

条带5:CN1680550A凝胶层析后半峰

本发明具体实施方式

实施例1

纯化第1步：蛋白捕获

以Streamline SP阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)进行平衡，发酵液取上清液调节pH值至6.0后上样，采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.5mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化中间体1。

纯化第2步：凝胶层析

以Sephacryl S-200 HR凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体1直接上样，采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体2。

纯化第3步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体2调节pH值至6.0后上样，采用0.01mol/L磷酸盐低盐缓冲液(pH6.0含0.25mol/L NaCl)洗脱杂质，0.01mol/L磷酸盐高盐缓冲液(pH7.0含0.3mol/L NaCl)洗脱目标蛋白，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体3。于-20℃以下冷冻储存。

纯化第4步：低pH孵育

将孵育后纯化中间3体置温度稳定的恒温水浴锅内，控制温度26℃，在升温过程中不停搅拌纯化中间体3，待温度上升至控制温度时，用稀盐酸调节纯化中间体3pH值3.5；重新置于恒温水浴锅中开始低pH孵育，孵育90min，用2M的NaOH调节溶液pH值7.0±0.5；将孵育后纯化中间体3置于冰箱暂存。

纯化第5步：亲和层析

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub亲和填料为介质进行亲和层析。层析柱采 用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)进行平衡。根据制剂所需蛋白量要求取多批纯化中间体3的冷冻蛋白溶液复融及混合，混合溶液调节pH值至7.0后上样。采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体4。

纯化第6步：阴离子交换层析

以Streamline DEAE阴离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体4与0.03mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)按1：2体积比混合，调节pH值至8.0后上样，用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体5。

纯化第7步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体5调节pH值至6.0后上样，采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体6。

纯化第8步：纳米过滤

纯化中间体6经0.1μm孔径的PVDF预过滤器(预过滤过程是为了除掉蛋白复融过程中的蛋白聚集成的颗粒，以免堵掉20nm的小孔滤膜)+20nm孔径的PVDF纳米过滤器，在压力不超过5bar的条件下收集滤液，纯化中间体6过滤完成后用0.01mol/L PB缓冲液缓冲液进行顶洗，过滤时间不超过120min，收集滤液即得尿激酶原。

实施例2

纯化第1步：蛋白捕获

以Streamline SP阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡，发酵液取上清液调节pH 值至5.5后上样，采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.3mol/L NaCl洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化中间体1。

纯化第2步：凝胶层析

以Sephacryl S-200HR凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体1直接上样，采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/LNaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体2。

纯化第3步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体2调节pH值至5.5后上样，采用0.005mol/L磷酸盐低盐缓冲液(pH5.5含0.20mol/L NaCl)洗脱杂质，0.005mol/L磷酸盐高盐缓冲液(pH6.5含0.28mol/L NaCl)洗脱目标蛋白，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体3。于-20℃以下冷冻储存。

纯化第4步：低pH孵育

将孵育后纯化中间3体置温度稳定的恒温水浴锅内，控制温度22℃，在升温过程中不停搅拌纯化中间体3，待温度上升至控制温度时，用稀盐酸调节纯化中间体3pH值3.0；重新置于恒温水浴锅中开始低pH孵育，孵育30min，用1M的NaOH调节溶液pH值7.0±0.5；将孵育后纯化中间体3置于冰箱暂存。

纯化第5步：亲和层析

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub亲和填料为介质进行亲和层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)进行平衡。根据制剂所需蛋白量要求取多批纯化中间体3的冷冻蛋白溶液复融及混合，混合溶液调节pH值至6.5后上样。采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体4。

纯化第6步：阴离子交换层析

以Streamline DEAE阴离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.015mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体4与0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)按1：2体积比混合，调节pH值至7.5后上样，用0.015mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体5。

纯化第7步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体5调节pH值至5.5后上样，采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体6。

纯化第8步：纳米过滤

纯化中间体6经0.1μm孔径的PVDF预过滤器(预过滤过程是为了除掉蛋白复融过程中的蛋白聚集成的颗粒，以免堵掉20nm的小孔滤膜)+20nm孔径的PVDF纳米过滤器，在压力不超过5bar的条件下收集滤液，纯化中间体6过滤完成后用0.01mol/L PB缓冲液缓冲液进行顶洗，过滤时间不超过120min，收集滤液即得尿激酶原。

实施例3

纯化第1步：蛋白捕获

以Streamline SP阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)进行平衡，发酵液取上清液调节pH值至6.5后上样，采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.7mol/L NaCl洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化中间体1。

纯化第2步：凝胶层析

以Sephacryl S-200HR凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.12mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间 体1直接上样，采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.12mol/L)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体2。

纯化第3步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体2调节pH值至6.5后上样，采用0.015mol/L磷酸盐低盐缓冲液(pH6.5含0.26mol/L NaCl)洗脱杂质，0.015mol/L磷酸盐高盐缓冲液(pH7.5含0.35mol/L NaCl)洗脱目标蛋白，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体3。于-20℃以下冷冻储存。

纯化第4步：低pH孵育

将孵育后纯化中间3体置温度稳定的恒温水浴锅内，控制温度28℃，在升温过程中不停搅拌纯化中间体3，待温度上升至控制温度时，用稀盐酸调节纯化中间体3pH值4.0；重新置于恒温水浴锅中开始低pH孵育，孵育60min，用4M的NaOH调节溶液pH值7.0±0.5；将孵育后纯化中间体3置于冰箱暂存。

纯化第5步：亲和层析

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub亲和填料为介质进行亲和层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)进行平衡。根据制剂所需蛋白量要求取多批纯化中间体3的冷冻蛋白溶液复融及混合，混合溶液调节pH值至7.5后上样。采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体4。

纯化第6步：阴离子交换层析

以Streamline DEAE阴离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.025mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5含0.20mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体4与0.035mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5)按1：2体积比混合，调节pH值至8.5后上样，用0.025mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5含0.15mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体5。

纯化第7步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体5调节pH值至6.5后上样，采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为本发明所要得到的尿激酶原。

纯化第8步：纳米过滤

纯化中间体6经0.1μm孔径的PVDF预过滤器(预过滤过程是为了除掉蛋白复融过程中的蛋白聚集成的颗粒，以免堵掉20nm的小孔滤膜)+20nm孔径的PVDF纳米过滤器，在压力不超过5bar的条件下收集滤液，纯化中间体6过滤完成后用0.01mol/L PB缓冲液缓冲液进行顶洗，过滤时间不超过120min，收集滤液即得尿激酶原。

实施例4

纯化第1步：蛋白捕获

以Streamline SP阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.12mol/L NaCl)进行平衡，发酵液取上清液调节pH值至6.0后上样，采用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.4mol/L洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化中间体1。

纯化第2步：凝胶层析

以Sephacryl S-200 HR凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.07mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体1直接上样，采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.07mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体2。

纯化第3步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.012mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.012mol/L NaCl)进行平衡，将纯化中间体2调节pH 值至6.0后上样，采用0.012mol/L磷酸盐低盐缓冲液(pH6.0含0.25mol/L NaCl)洗脱杂质，0.012mol/L磷酸盐高盐缓冲液(pH7.0含0.3mol/L NaCl)洗脱目标蛋白，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体3。于-20℃以下冷冻储存。

纯化第4步：低pH孵育将孵育后纯化中间3体置温度稳定的恒温水浴锅内，控制温度22℃，在升温过程中不停搅拌纯化中间体3，待温度上升至控制温度时，用稀盐酸调节纯化中间体3pH值3.0；重新置于恒温水浴锅中开始低pH孵育，孵育30min，用1M的NaOH调节溶液pH值7.0±0.5；将孵育后纯化中间体3置于冰箱暂存。

纯化第5步：亲和层析

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub亲和填料为介质进行亲和层析。层析柱采用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)进行平衡。根据制剂所需蛋白量要求取多批纯化中间体3的冷冻蛋白溶液复融及混合，混合溶液调节pH值至7.5后上样。采用0.008mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体4。

纯化第6步：阴离子交换层析

以Streamline DEAE阴离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0含0.15mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体4与0.03mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)按1：2体积比混合，调节pH值至8.0后上样，用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化中间体5。

纯化第7步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.009mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.11mol/L NaCl)进行平衡。纯化中间体5调节pH值至6.5后上样，采用0.009mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体6。

纯化第8步：纳米过滤

纯化中间体6经0.1μm孔径的PVDF预过滤器(预过滤过程是为了除掉蛋白复融过程中的蛋白聚集成的颗粒，以免堵掉20nm的小孔滤膜)+20nm孔径的PVDF纳米过滤器，在压力不超过5bar的条件下收集滤液，纯化中间体6过滤完成后用0.01mol/L PB缓冲液缓冲液进行顶洗，过滤时间不超过120min，收集滤液即得尿激酶原。

实施例5

纯化第1步：蛋白捕获

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)进行平衡，发酵液取上清液调节pH值至6.0后上样，采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.5mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化1中间体。

纯化第2步：凝胶层析

以Sephadex G-50凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)进行平衡，将纯化1中间体直接上样，采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化2中间体。

纯化第3步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)进行平衡，将纯化2中间体调节pH值至6.0后上样，采用0.01mol/L磷酸盐低盐缓冲液(pH6.0含0.25mol/L NaCl)洗脱杂质，0.01mol/L磷酸盐高盐缓冲液(pH7.0含0.3mol/L NaCl)洗脱目标蛋白，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化3中间体。于-20℃以下冷冻储存。

纯化第4步：低pH孵育

将孵育后纯化中间3体置温度稳定的恒温水浴锅内，控制温度26℃，在升温过程中不停搅拌纯化中间体3，待温度上升至控制温度时，用稀盐酸调节纯化中间体3pH值3.5；重新置于恒温水浴锅中开始低pH孵育，孵育90min，用2M的NaOH调节溶液pH值7.0±0.5；将孵育后纯化中间体3置于冰箱暂存。

纯化第5步：亲和层析

以BenzamidineSepharose 4FF H-sub亲和填料为介质进行亲和层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)进行平衡。根据制剂所需蛋白量要求取多批纯化3中间体的冷冻蛋白溶液复融及混合，混合溶液调节pH值至7.0后上样。采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化4中间体。

纯化第6步：阴离子交换层析

以Streamline DEAE阴离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)进行平衡。纯化4中间体与0.03mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)按1：2体积比混合，调节pH值至8.0后上样，用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化5中间体。

纯化第7步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)进行平衡。纯化5中间体调节pH值至6.0后上样，采用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体6。

纯化第8步：纳米过滤

纯化中间体6经0.1μm孔径的PVDF预过滤器(预过滤过程是为了除掉蛋白复融过程中的蛋白聚集成的颗粒，以免堵掉20nm的小孔滤膜)+20nm孔径的PVDF纳米过滤器，在压力不超过5bar的条件下收集滤液，纯化中间体6过滤完成后用0.01mol/L PB缓冲液缓冲液进行顶洗，过滤时间不超过120min，收集滤液即 得尿激酶原。

实施例6

纯化第1步：蛋白捕获

以Streamline SP阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡，发酵液取上清液调节pH值至5.5后上样，采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.3mol/L NaCl洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化1中间体。

纯化第2步：凝胶层析

以Sephacryl S-200 HR凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡，将纯化1中间体直接上样，采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/LNaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化2中间体。

纯化第3步：阳离子交换层析

以SP Sephadex C-50阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡，将纯化2中间体调节pH值至5.5后上样，采用0.005mol/L磷酸盐低盐缓冲液(pH5.5含0.20mol/L NaCl)洗脱杂质，0.005mol/L磷酸盐高盐缓冲液(pH6.5含0.28mol/L NaCl)洗脱目标蛋白，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化3中间体。于-20℃以下冷冻储存。

纯化第4步：低pH孵育

将孵育后纯化中间3体置温度稳定的恒温水浴锅内，控制温度22℃，在升温过程中不停搅拌纯化中间体3，待温度上升至控制温度时，用稀盐酸调节纯化中间体3pH值3.0；重新置于恒温水浴锅中开始低pH孵育，孵育30min，用1M的NaOH调节溶液pH值7.0±0.5；将孵育后纯化中间体3置于冰箱暂存。

纯化第5步：亲和层析

以Arginine Sepharose 4B亲和填料为介质进行亲和层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)进行平衡。根据制剂所需蛋白量要求取多批纯化3中间体的冷冻蛋白溶液复融及混合，混合溶液调节pH值至6.5后上样。采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化4中间体。

纯化第6步：阴离子交换层析

以DEAE Sephacel DE-52阴离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.015mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡。纯化4中间体与0.02mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)按1：2体积比混合，调节pH值至7.5后上样，用0.015mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化5中间体。

纯化第7步：阳离子交换层析

以SP Sepharose F.F.阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡。纯化5中间体调节pH值至5.5后上样，采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体6。

纯化第8步：纳米过滤

纯化中间体6经0.1μm孔径的PVDF预过滤器(预过滤过程是为了除掉蛋白复融过程中的蛋白聚集成的颗粒，以免堵掉20nm的小孔滤膜)+20nm孔径的PVDF纳米过滤器，在压力不超过5bar的条件下收集滤液，纯化中间体6过滤完成后用0.01mol/L PB缓冲液缓冲液进行顶洗，过滤时间不超过120min，收集滤液即得尿激酶原。

实施例7

纯化第1步：蛋白捕获

以Sephadex G-50阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)进行平衡，发酵液取上清液调节pH值 至6.5后上样，采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.7mol/LNaCl洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化1中间体。

纯化第2步：凝胶层析

以Sephacryl S-200HR凝胶分子筛填料为介质进行凝胶层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.12mol/L NaCl)进行平衡，将纯化1中间体直接上样，采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.12mol/L)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化2中间体。

纯化第3步：阳离子交换层析

以SP Sephadex C-50阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)进行平衡，将纯化2中间体调节pH值至6.5后上样，采用0.015mol/L磷酸盐低盐缓冲液(pH6.5含0.26mol/L NaCl)洗脱杂质，0.015mol/L磷酸盐高盐缓冲液(pH7.5含0.35mol/L NaCl)洗脱目标蛋白，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化3中间体。于-20℃以下冷冻储存。

纯化第4步：低pH孵育

将孵育后纯化中间3体置温度稳定的恒温水浴锅内，控制温度28℃，在升温过程中不停搅拌纯化中间体3，待温度上升至控制温度时，用稀盐酸调节纯化中间体3pH值4.0；重新置于恒温水浴锅中开始低pH孵育，孵育60min，用4M的NaOH调节溶液pH值7.0±0.5；将孵育后纯化中间体3置于冰箱暂存。

纯化第5步：亲和层析

以BenzamidineSepharose 4FF H-sub亲和填料为介质进行亲和层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)进行平衡。根据制剂所需蛋白量要求取多批纯化3中间体的冷冻蛋白溶液复融及混合，混合溶液调节pH值至7.5后上样。采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)进行洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化4中间体。

纯化第6步：阴离子交换层析

以Streamline DEAE阴离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.025mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5含0.20mol/L NaCl)进行平衡。纯化4中间体与0.035mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5)按1：2体积比混合，调节pH值至8.5后上样，用0.025mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5含0.15mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰，即为纯化5中间体。

纯化第7步：阳离子交换层析

以SP Sephadex C-50阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)进行平衡。纯化5中间体调节pH值至6.5后上样，采用0.015mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，即为纯化中间体6。

纯化第8步：纳米过滤

纯化中间体6经0.1μm孔径的PVDF预过滤器(预过滤过程是为了除掉蛋白复融过程中的蛋白聚集成的颗粒，以免堵掉20nm的小孔滤膜)+20nm孔径的PVDF纳米过滤器，在压力不超过5bar的条件下收集滤液，纯化中间体6过滤完成后用0.01mol/L PB缓冲液缓冲液进行顶洗，过滤时间不超过120min，收集滤液即得尿激酶原。

实施例8

以蛋白G-Sepharose 4B为填料进行亲和层析，上样前用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液进行平衡，将尿激酶原发酵液调节pH至7.5±0.5后上样，上样完毕后用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，后用pH2.5±0.5的0.2mol/L的Gly-HCl缓冲液洗脱目标蛋白，根据UV280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，既得初步纯化液。

实施例9

以Streamline SP阳离子填料为介质进行交换层析。层析柱采用0.005磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)进行平衡，发酵液取上清液调节pH值至 5.5后上样，采用0.005mol/L磷酸盐缓冲液(pH5.5含0.3mol/L NaCl洗脱，根据UV 280紫外吸收曲线收集洗脱蛋白峰，即为纯化中间体；以蛋白G-Sepharose 4B为填料进行亲和层析，上样前用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液进行平衡，将纯化中间体调节pH至7.5±0.5后上样，上样完毕后用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，后用pH2.5±0.5的0.2mol/L的Gly-HCl缓冲液洗脱目标蛋白，根据UV280紫外吸收曲线收集目标蛋白峰，既得初步纯化液。

实施例10

取实施例5或6的初步纯化液，按照实施例1-4任何一项步骤4-8操作得到人重组尿激酶原原液。