Ca2+在提高CELI家族酶活性中的应用的制作方法

本发明涉及Ca²⁺在提高CELI家族酶活性中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

CELI酶是一种单链、双链都特异识别的特异性核酸酶，等电点为6.0-6.5，分子量大小为43kDa(Yang et al,1999)；CEL I酶和CEL II酶都具有识别碱基错配的能力，其同源性为49％(见图5)(Yang et al,1999；Pimkin et al,2006)。传统理论认为该酶的催化活性只需要Mg²⁺和Zn²⁺(Till et al,2004)，它可以识别八种错配形式的碱基(mismatches)分别为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和TT(Oleykowski et al,1999；Oleykowski et al,1998)，因此被广泛应用于突变检测领域，如植物TILLING技术平台中(Till et al,2006)。该酶可以特异性切割错配碱基(Bing Yang et al,1999)。通过酶切扩增的目标检测片段并经琼脂糖或毛细管电泳分离检测，一般可方便获得突变位置和大小。因此，它是一种比较方便和经济的检测未知和已知突变位点的手段(Yeung et al,2005)。

目前CELI酶主要提取途径是从芹菜中提取，主要提取方法是通过硫酸铵沉淀法，得到粗提酶液(Till et al,2006)。如果需要得到纯度更高的酶，需要经过刀豆体蛋白A-琼脂糖柱吸附，用alpha-甘露糖苷洗脱，但是得率较低(Yang et al,1999)。因此，大部分TILLING突变体检测实验是用粗提酶来检测的，该粗提酶的主要成分即为CELI(Yang et al,1999；Till et al,2006)。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供Ca²⁺的新用途。

本发明提供了Ca²⁺在促进CELI酶活性中的应用。

上述应用中，所述CELI酶活性为切割错配位点。

本发明还提供了Ca²⁺在制备CELI酶酶切缓冲液或CELI酶酶切缓冲体系中的应用。

本发明的另一个目的是提供含有Ca²⁺的CELI酶酶切缓冲液。

本发明提供的含有Ca²⁺的CELI酶酶切缓冲液中，所述Ca²⁺在所述CELI酶酶切缓冲液中的浓度为0.5-50mM。

上述含有Ca²⁺的CELI酶酶切缓冲液中，所述Ca²⁺在所述CELI酶酶切缓冲液中的浓度具体为0.5mM、5mM、10mM、15mM、30mM或50mM；

上述含有Ca²⁺的CELI酶酶切缓冲液中，所述含有Ca²⁺的CELI酶酶切缓冲液由Ca²⁺、BSA、Triton X-100、KCl和HEPES缓冲液组成；所述HEPES缓冲液为浓度为 0.1M、pH值为7.5的HEPES缓冲液。

本发明还有一个目的是提供一种酶切反应体系。

本发明提供的酶切反应体系包括上述含有Ca²⁺的CELI酶酶切缓冲液和CELI酶。

本发明还有一个目的是提供一种CELI酶试剂盒。

本发明提供的CELI酶试剂盒为如下(1)或(2)：

(1)上述酶切缓冲液；

(2)上述酶切缓冲液和CELI酶。

上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在促进CELI酶切割含有错配位点DNA中的应用也属于本发明的保护范围。

上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒在检测待测DNA分子是否含有错配位点中的应用也属于本发明的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种用CELI酶酶切含有错配位点DNA的方法。

本发明提供的用CELI酶酶切含有错配位点DNA的方法包括如下步骤：将含有错配位点DNA和野生型DNA在上述酶切反应体系中进行酶切反应，实现酶切；

所述含有错配位点DNA和野生型DNA的质量比为1：(1-24)。

上述方法中，所述含有错配位点DNA和野生型DNA的质量比为1:(12-24)。

上述应用或方法中，所述错配位点的错配形式为AA、AG、AC、GG、GT、CC、CT和/或TT。

上述酶切缓冲液或上述酶切反应体系或上述试剂盒或上述方法在低丰度未知突变体检测中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明发现了新的催化活性物质Ca²⁺，通过实验证明：Ca²⁺可以进一步提高CELI酶活，特别是对低丰度突变的检测。比传统的酶切方法相比，本发明的方法更为灵敏，Ca²⁺的终浓度在0.5-50mM范围内都可以提高CELI酶的检测灵敏度，对低丰度未知突变体的检测，如某癌症基因都有很好的检测效果，特别是TILLING技术平台检测诱变群体时，有明显优势，不仅仅简化了PCR纯化步骤，同时相应地提高了检测分辨率。

附图说明

图1为Ca²⁺对CELI酶切效果。

图2为Ca²⁺对CELI酶切效果。

图3为Ca²⁺对CELI酶切效果。

图4为Ca²⁺和Mg²⁺对CELI酶切效果。

图5为CELI与CELII同源关系比较图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

Mutation Detection Kit-S100试剂盒是美国环球基因公司的产品，产品目录号为706025。

Binding Buffer是美国zymoresearch公司的产品；DNA Clean&Concentrator^TM-25。

实施例1、Ca²⁺在提高CELI酶活性中的应用

一、待酶切DNA样品的制备

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a₀(浓度为1ng/ul)；序列2为将序列1的第544位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a₁(浓度为1ng/ul)；序列4为将序列3的第503位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列5所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a₂(浓度为1ng/ul)；序列5为将序列3的第389位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列6所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a₃(浓度为1ng/ul)；序列6为将序列3的第563位核苷酸由C突变为A后得到的DNA分子。

人工合成序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列7所示的DNA分子，将其按2:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的DNA a₄(浓度为1ng/ul)；序列7为将序列3的第495位核苷酸由T突变为C后得到的DNA分子。

2、PCR扩增

分别以上述待PCR扩增的DNA a₀、待PCR扩增的DNA a₁、待PCR扩增的DNA a₂、待PCR扩增的DNA a₃、待PCR扩增的DNA a₄为模板，采用F和R引物对所述模板进行PCR扩增，扩增至45个热循环，然后进行99℃变性10min，降温至70℃，每个循环降低0.3℃，69个循环结束，分别得到PCR扩增产物a₀即待酶切DNA样品a₀、PCR扩增产物a₁即待酶切DNA样品a₁、PCR扩增产物a₂即待酶切DNA样品a₂、PCR扩增产物a₃即待酶切DNA样品a₃、PCR扩增产物a₄即待酶切DNA样品a₄。待扩增完毕后，用1％琼脂糖凝胶检测，检测条带是否特异，条带亮度是否达到要求。若条带较暗或不特异，需要重新扩增。引物序列如下：

F：ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG；

R：TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA。

以待PCR扩增的DNA a₀为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物a₀，对PCR扩增产物a₀进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a₀含有如序列表中序列1所示的DNA分子和将序列表中序列1的第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子。

以待PCR扩增的DNA a₁为模板，PCR扩增得到大小为1134bp的PCR扩增产物a₁，对PCR扩增产物a₁进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a₁含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为1134bp的将序列表中序列2的第503位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品a₁)。

以待PCR扩增的DNA a₂为模板，PCR扩增得到的大小为1134bp的PCR扩增产物a₂，对PCR扩增产物a₂进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a₂含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为1134bp的将序列表中序列2的第389位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品a₂)。

以待PCR扩增的DNA a₃为模板，PCR扩增得到的大小为1134bp的PCR扩增产物a₃，对PCR扩增产物a₃进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a₃含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为1134bp的将序列表中序列2的第563位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品a₃)。

以待PCR扩增的DNA a₄为模板，PCR扩增得到的大小为1134bp的PCR扩增产物a₄，对PCR扩增产物a₄进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物a₄含有如序列表中序列2所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为1134bp的将序列表中序列2的第495位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品a₄)。

PCR扩增体系(10ul)：10倍PCR缓冲液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H₂0 6.78ul；

PCR扩增热循环：95℃ 2min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1-3min；72℃ 5min，12℃hold。

异源错配双链形成：99℃ 10min；70℃ 20s，-0.3℃ per cycle，70cycles；12℃ 10min。

3、PCR产物纯化

(1)用在1倍体积的PCR扩增产物中加入2倍体积的Binding Buffer，翻转充分混匀(对小于200bp的PCR扩增产物，加入5倍体积的Binding Buffer)得到混合液。

(2)将所述混合液加入DNA纯化柱内(如果溶液体积>700μl，分次转移溶液)；室温放置1-2min或更长时间。

(3)13,000g离心1min，弃废液(目的DNA长度≤500bp时，离心结束后将收集管中的溶液再次转入DNA纯化柱中，离心)。

(4)在DNA纯化柱中加入650ul Wash Buffer，13,000g离心30秒，弃废液，将DNA纯化柱放回收集管。

(5)重复步骤(4)。

(6)13,000g离心3min，以去除柱中残余乙醇。

(7)将纯化柱放入新的离心管中，向柱中加入在60℃预热的30-50μl Elution Buffer或ddH₂O，室温放置1-2min或更长时间。

二、CELI酶的制备

1、取10kg芹菜，放入榨汁机中，缓慢榨汁后，避免温度过热，在汁液中加入预冷匀浆缓冲液(含100mM Tris-HCl(pH均为7.7)和100uM PMSF)，得到混合液。

2、将所述混合液4℃下14000rpm离心10min，弃沉淀，取上清液；向上清液中缓慢加入硫酸铵(每100ml上清液加25g硫酸铵)，分10次加入(每100ml体积加入14.4g硫酸胺)，待完全溶解后，低速搅拌30min；14000rpm离心45min，弃沉淀，取上清液。

3、向上清液中缓慢加入硫酸铵至(每100ml上清液加80g硫酸铵)，分十次加入(每100ml体积加入39.0g固体硫酸铵)。低速搅拌30min后，14000rpm离心3min。弃上清，收集沉淀。

4、用1/10体积的缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)溶解步骤3中得到的沉淀，1000rpm离心20min，弃沉淀，取上清。

5、把透析袋剪成适当长度的小段。用1mmol/L EDTA(pH 8.0)中将透析袋煮沸5min。用超纯水清洗透析袋。将透析袋放入10倍蛋白质溶液以上体积的缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)中，透析过夜，透析4-5次至透析液无颜色为止。

6、取40ml透析过的酶液经ConA-Sapharose-4B柱，用缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)冲洗，经alpha-甘露糖苷洗脱后，经缓冲液(0.1M Tris-HC1、100uM PMSF；pH为7.7)透析过夜，得到纯化后的CELI酶(约50mg)，分装-80度保存。

三、酶切反应及其效果

1、酶切缓冲液的配置

酶切缓冲液配置分成如下5组：

组1：10倍digestion buffer(不含有Mg²⁺缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、不同浓度的CaCl₂(0mM、0.5mM、5mM、10mM、15mM、30mM、60mM)；

组2：10倍digestion buffer(含有Mg²⁺缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl₂；

组3：10倍digestion buffer(不含有Mg²⁺缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、50mM CaCl₂；

2、酶切反应

分别取2ul的待酶切DNA样品a₀、待酶切DNA样品a₁、待酶切DNA样品a₂、待酶切DNA样品a₃、待酶切DNA样品a₄作为酶切反应底物，用上述各组酶切缓冲液进行酶切反应，得到酶切产物a₀、酶切产物a₁、酶切产物a₂、酶切产物a₃、酶切产物a₄。

CELI酶切反应体系(6ul)：10倍酶切缓冲液0.6ul、CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、PCR扩增产物2.0ul、纯水3.2ul。

若酶切产物a₀含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有791bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；

若酶切产物a₁含有1134bp、503bp和631bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有1134bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；

若酶切产物a₂含有1134bp、389bp和745bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有1134bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；

若酶切产物a₃含有1134bp、563bp和571bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有1134bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；

若酶切产物a₄含有1134bp、495bp和639bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有1134bp的酶切片段，说明CELI酶无法检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品。

3、毛细管电泳

酶切反应结束后立即加入2ul的0.225M的EDTA终止反应(15ul体系应加入3ul EDTA)，再补入91ul超纯水稀释样品，可直接上机(FS 96，美国AATI公司)进行毛细管电泳，毛细管电泳条件如表1所示。

表1、毛细管电泳条件

4、Ca²⁺对CELI酶酶切效果的影响

酶切产物a₀经用毛细管分离的结果如图1所示(其中泳道1和泳道2的酶切缓冲液为组2；其余泳道的酶切缓冲液为组1)。从图1可以看出：酶切产物分离得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，与目的酶切片段中错配位点一致，且浓度范围在0.5-30mM的Ca²⁺的酶切效果好于Mg²⁺的酶切效果，说明浓度范围在0.5-30mM的Ca²⁺的酶切效果均可提高CELI酶切活性。

PCR产物未纯化和纯化的酶切产物a₁、酶切产物a₂、酶切产物a₃、酶切产物a₄经用毛细管分离的结果分别如图2和图3所示：其中图2和图3的1-8泳道的酶切缓冲液为组2；图2和图3的9-12泳道的酶切缓冲液为组3。从图2和图3可以看出：酶切产物a₁含有1134bp、503bp和631bp的酶切片段，酶切产物a₂含有1134bp、389bp和745bp的酶切片段，酶切产物a₃含有1134bp、563bp和571bp的酶切片段，酶切产物a₄含有1134bp、495bp和639bp的酶切片段，与目的酶切片段中错配位点一致，说明在PCR产物未纯化时Ca²⁺酶切效果要明显高于PCR产物纯化时Mg²⁺酶切效果，说明产物无需纯化，添加Ca²⁺即可得到很好的酶切效果，节约了纯化成本和时间。

实施例2、Ca²⁺在提高CELI酶活性中的应用

一、待酶切DNA样品的制备

1、DNA的合成

人工合成序列表中序列1所示的DNA分子(野生型DNA分子)和序列表中序列2所示的DNA分子(突变型DNA分子)，序列2为将序列1的第544位核苷酸由G突变为A后得到的DNA分子。

将序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:1比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的模板1(待PCR扩增的模板1的浓度，150ng/ul)。

将序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:12比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的模板2(待PCR扩增的模板2的浓度，150ng/ul)。

将序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:24比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的模板3(待PCR扩增的模板3的浓度，150ng/ul)。

将序列2所示的DNA分子和序列1所示的DNA分子按1:48比例(质量比)混合，得到待PCR扩增的模板4(待PCR扩增的模板4的浓度，150ng/ul)。

2、PCR扩增

分别以上述待PCR扩增的模板1、待PCR扩增的模板2、待PCR扩增的模板3、 待PCR扩增的模板4为模板，采用F和R引物对上述模板进行PCR扩增，扩增至45个热循环，然后进行99℃变性10min，降温至70℃，每个循环降低0.3℃，69个循环结束，分别得到PCR扩增产物1即待酶切DNA样品1、PCR扩增产物2即待酶切DNA样品2、PCR扩增产物3即待酶切DNA样品3、PCR扩增产物4即待酶切DNA样品4。待扩增完毕后，用1％琼脂糖凝胶检测，检测条带是否特异，条带亮度是否达到要求。若条带较暗或不特异，需要重新扩增。引物序列如下：

F：ATGCACTTAACAGAGGAAATCTTG；

R：TTACTTAATACTTTTCTTGTAGCCTTTA。

以待PCR扩增的模板1为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物1，对PCR扩增产物1进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物1含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和将序列表中序列1的第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品1)。

以待PCR扩增的模板2为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物2，对PCR扩增产物2进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物2含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为791bp的将序列表中序列1第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品2)。

以待PCR扩增的模板3为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物3，对PCR扩增产物3进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物3含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和将序列表中序列3的第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品3)。

以待PCR扩增的模板4为模板，PCR扩增得到大小为791bp的PCR扩增产物4，对PCR扩增产物4进行测序。测序结果表明，PCR扩增产物4含有如序列表中序列1所示的DNA分子(野生型样品的DNA)和大小为791bp的将序列表中序列1第544位核苷酸由G突变为A的异源双链DNA分子(点突DNA样品4)。

PCR扩增体系(10ul)：10倍PCR缓冲液1.0ul、dNTP 0.8ul、Forward primer(10um)0.16ul、Reverse primer(10um)0.16ul、DNA模板1.0ul、聚合酶0.1ul、H₂0 6.78ul；

PCR扩增热循环：95℃ 2min；94℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 1-3min；72℃ 5min，12℃ hold。

异源错配双链形成：99℃ 10min；70℃ 20s，-0.3℃ per cycle，70cycles；12℃ 10min。

3、PCR扩增产物的纯化

PCR扩增产物的纯化的步骤同实施例1中的步骤3。

二、酶切反应及其效果

1、酶切缓冲液的配置

酶切缓冲液配置分成如下2组：

组1：10倍digestion buffer(含有Mg²⁺缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、100mM MgCl₂；

组2：10倍digestion buffer(含有Ca²⁺缓冲液配置)：2ug/ml BSA、0.02％Triton X-100(vol/vol)、0.1M KCl、0.1M HEPES(pH 7.5)、50mM CaCl₂。

2、酶切反应

分别取2ul的待酶切DNA样品1、待酶切DNA样品2、待酶切DNA样品3、待酶切DNA样品4作为酶切反应底物，分别用上述各组酶切缓冲液进行酶切反应，分别得到酶切产物1、酶切产物2、酶切产物3、酶切产物4。

CELI酶切反应体系(6ul)：10倍酶切缓冲液0.6ul、实施例1中的步骤二制备的CELI酶(0.3mg/ml)0.2ul、待酶切DNA样品2.0ul、纯水3.2ul。

若酶切产物含有791bp、544bp和247bp的酶切片段，说明CELI酶可以有效的检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品；若酶切产物仅含有791bp的酶切片段，说明CELI酶未检测出待酶切DNA样品中的点突DNA样品。

3、毛细管电泳

酶切反应结束后立即向酶切反应体系中加入2ul的0.225M的EDTA终止反应(15ul体系应加入3ul EDTA)，再补入91ul超纯水稀释样品，可直接上机(FS 96，美国AATI公司)进行毛细管电泳，毛细管电泳条件如表1所示。

表1、毛细管电泳条件

4、不同浓度的突变DNA分子的CELI酶酶切效果

用组1的酶切缓冲液进行酶切得到的酶切产物的电泳结果如图4的泳道1-4所示，用组2的酶切缓冲液进行酶切得到的酶切产物的电泳结果如图4的泳道5-8所示：从图中可以看出，用含有Mg²⁺缓冲液的对含有不同浓度的突变DNA分子的待酶切DNA样品进行酶切，只有泳道1(突变DNA分子浓度为1ng/ul)中的酶切产物分离得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，说明用含有Mg²⁺缓冲液的进行酶切，仅可以检测出浓度为1ng/ul的突变DNA分子；用含有Ca²⁺缓冲液的对含有不同浓度的突变DNA分子的待酶切DNA样品进行酶切，泳道1(突变DNA分子浓度为1ng/ul)、泳 道1(突变DNA分子浓度为0.08ng/ul)和泳道1(突变DNA分子浓度为0.04ng/ul)中的酶切产物均分离得到791bp、544bp和247bp的酶切片段，说明用含有Ca²⁺缓冲液的进行酶切，可以检测出浓度为0.04ng/ul的突变DNA分子。上述实验结果表明：和Mg²⁺相比，含有Ca²⁺的酶切缓冲液可以检测较低浓度的突变DNA分子，说明Ca²⁺可以促进CELI酶的活性。