新城疫病毒嵌合病毒样颗粒、疫苗及制备方法与流程

本发明涉及病毒疫苗技术领域，尤其是涉及一种新城疫病毒嵌合病毒样颗粒、制备方法及预防新城疫强毒的疫苗。

背景技术：

新城疫(Newcastle Disease,ND)是一种急性高接触性传染病。该病传播迅速，发病率、死亡率可达85％以上，强毒株引起的感染常达100％，是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一。自1926年首发于印尼西亚和英国新城以来，在其后90年的历史中，新城疫在全世界曾发生过多次大流行，实验表明有250多种鸟类可被新城疫病毒(NDV)感染。在我国许多地区每年都有此病的发生，并且在水禽和野鸟体内也分离到新城疫病毒。正是由于该病的危害和引发的后果极其严重，新城疫被国际兽疫局(OIE)列为A类疫病。

新城疫病毒是一种负链RNA病毒，属于禽副粘病毒I型。新城疫病毒含有六个主要蛋白，其中最主要的糖蛋白是新城疫病毒融合蛋白F和血凝素--神经氨酸酶蛋白HN。这两个蛋白不仅与病毒的毒力和致病性有关，同时也是诱导宿主体内免疫系统产生保护性抗体的蛋白。成熟的ND病毒粒子有囊膜,呈圆形,直径约为100-250nm。囊膜上有纤突长约8nm，为F蛋白和HN蛋白。另外，HN蛋白能结合红细胞表面的受体，这一特性可用来做为血凝效价和血清抗体效价检测的判断指标。新城疫病毒虽然只有一个血清型，但其强毒已进化出现了九个基因型，当前我国新城疫病毒的优势流行株属基因VII型，是危害严重的强毒病毒株。

近年来，虽然新城疫疫苗在世界范围内得到了广泛使用，但由于新城疫病毒一直处于不断的进化之中，目前已产生了多个不同的基因型。而在我国优势流行的强毒株基因Ⅶ型，常规疫苗对其攻击并不能提供理想的免疫保护效力。因此有必要用流行的强毒株来研制安全有效的新型疫苗，彻底防范新城疫疫病的传播。

病毒样颗粒(Virus Like Particles，VLPs)是指含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，称为病毒样颗粒。VLPs保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，免疫性强，能激发体液免疫和细胞免疫应答。由于VLPs只是一个纯粹的大分子蛋白聚合颗粒，不含病毒遗传物质，不能自主复制，因此使用时非常安全。在制备过程中采用细胞发酵罐进行动物细胞大规模悬浮培养，保证了批次间的均一性，不会造成环境污染。病毒样颗粒疫苗作为一种新型疫苗，不仅克服了传统疫苗的不足，也弥补了其它基因工程疫苗的缺憾，是目前最有发展前景、最安全的候选疫苗。

病毒样颗粒(VLPs)疫苗属基因工程苗，可选用重组杆状病毒作为载体来表达制备。由于重组昆虫杆状病毒表达系统易于筛选，安全性好，产物成本低，表达水平高，表达产物的翻译后加工与高等生物相似，可使蛋白产物保持天然结构、生物活性和免疫活性，且易于大规模生产外源蛋白，因此被认为是表达VLPs的最佳表达系统。

有研究报道，逆转录病毒的Gag前体蛋白可在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中表达，并且，在没有其它病毒组分存在的情况下，表达的Gag前体蛋白足以在昆虫细胞表面出芽，有效地组装和释放形成VLP。Gag前体蛋白的一个显著特点是能与一些不同病毒的结构蛋白相组合，稳定地共表达，因而具有很好的应用价值。

近几十年来，虽然全世界都广泛使用疫苗来防控新城疫，但是免疫禽群中仍频繁出现新城疫强毒感染现象。研究表明，虽然新城疫病毒只有一个血清型，但却有多个不同的基因型。自上世纪90年代末以来，引起我国新城疫流行的优势毒株为基因VII型强毒，而最常用的新城疫疫苗株为基因II型弱毒株Lasota。因此目前常用的新城疫疫苗毒株与当前流行毒株基因型不匹配。尽管疫苗株能对流行株攻击提供较好的临床保护(不发生症状和死亡)，但免疫保护力不足，鸡群中流行株的带毒率和病毒载量较高，这是免疫鸡群仍发生非典型新城疫的主要原因。

采用反向遗传学方法制备的毒株基因VII型疫苗能解决疫苗株与流行毒株基因型不匹配的问题。但所制备的疫苗抗原依然是具备遗传活性的活病毒，必须要经过化学处理进行灭活。同时，在生产制备抗原活病毒时，要防泄漏保证环境安全，收获后的废物需严格处理控制等。

有研究报道，用新城疫病毒的M基因、F基因和HN基因合成出了新城疫病毒病毒样颗粒，可用于制备疫苗。但这种含基质蛋白M的新城疫病毒病毒样颗粒产量不高，尤其当选用强毒基因VII型株的这几个结构蛋白基因制备病毒样颗粒抗原时，情况尤为明显。因此给实际生产和应用新城疫病毒病毒样颗粒疫苗造成了不便。

针对现有技术中存在的问题，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新城疫病毒嵌合病毒样颗粒，该新城疫病毒嵌合病毒样颗粒用于制备预防新城疫强毒的疫苗。

本发明的另一个目的在于提供一种预防新城疫强毒的疫苗，该疫苗为嵌合病毒样颗粒疫苗，是采用现代生物学原理和方法制备的新型疫苗，该疫苗采用目前流行的新城疫强毒毒株基因VII型作为疫苗株，解决了疫苗株与流行株不相匹配的问题；其次，该疫苗抗原含量高，容易生产；表达产物的翻译后加工与新城疫病毒的结构蛋白相似，颗粒表面上的新城疫病毒膜蛋白保持了其天然结构、生物活性和免疫原性。

本发明的第三个目的是提供上述的新城疫病毒嵌合病毒样颗粒的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

新城疫病毒病毒样颗粒，所述病毒样颗粒为嵌合颗粒，该颗粒包含逆转录病毒的Gag前体蛋白，新城疫病毒点突变融合蛋白ΔF，新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白HN。

其中，新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白HN的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示序列，其氨基酸序列为SEQ ID No.8所示序列。

优选地，所述逆转录病毒为鸡白血病病毒或人免疫缺陷病毒。

其中，鸡白血病病毒的Gag前体蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示序列，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示序列；人免疫缺陷病毒的Gag前体蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示序列，其氨基酸序列为SEQ ID No.4所示序列。

优选地，所述新城疫病毒点突变融合蛋白ΔF由新城疫病毒融合蛋白F的第147位的氨基酸突变后得到。所述新城疫病毒点突变融合蛋白ΔF的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示序列，氨基酸序列为SEQ ID No.6所示序列。

新城疫病毒点突变融合蛋白ΔF的核苷酸序列(SEQ ID No.5)如下：

ATGGGCTCCAAACCTTCTACCAGGATCCCAGCACCTCTAATGCTGATCACTCGGATTATGCTGATATTGAGCTGTATCCGTCTGACAAGCTCTCTTGACGGCAGGCCCCTTGCAGCTGCAGGAATTGTAGTAACAGGAGATAAGGCAGTCAATGTATACACCTCGTCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTGCTCCCGAATATGCCCAGAGATAAGGAGGCATGTGCAAAAGCCCCATTGGAGGCATATAACAGAACACTGACTACTCTGCTCACTCCTCTTGGCGACTCCATCCGCAAGATCCAAGGGTCTGTGTCCACGTCCGGAGGAAGGAGACAACAGCGCTTCATAGGTGCTGTTATTGGCAGTGTAGCTCTTGGGGTTGCAACAGCGGCACAGATAACAGCAGCTGCGGCCCTAATACAAGCCAAACAGGCTGCCGCCAACATCCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCTGCAACCAATGAAGCTGTGCATGAAGTCACCGACGGATTATCACAACTATCAGTGGCAGTTGGGAGGATGCAGCAGTTTGTCAATGACCAGTTTAATAATACGGCGCGAGAATTGGACTGTATAAAAATCACACAACAGGTCGGTGTAGAACTCAACCTATACCTAACTGAATTGACTACAGTATTCGGGCCACAGATCACCTCCCCTGCATTAACTCAGCTGACCATCCAGGCACTTTATAATTTAGCTGGTAGCAATATGGATTACTTATTAACTAAGTTAGGTATAGGAAACAATCAACTCAGTTCATTAATTGGTAGCGGCCTGATCACTGGTTACCCTATATTGTATGACTCACATACTCAACTCTTGGGCATACAAGTAAATTTGCCCTCAGTCGGGAACTTAAATAATATGCGTGCCACCTATTTGGAGACCTTATCTGTAAGTACAACCAAAGGATATGCCTCAGCGCTTGTCCCGAAAGTAGTGACACAAGTCGGTTCTGTGATAGAAGAGCTTGACACCTCATACTGTATAGAGTCTGATCTGGATTTATATTGTACTAGAATAGTGACATTCCCCATGTCCCCAGGTATTTATTCCTGTTTGAGCGGCAACACATCAGCCTGCATGTATTCAAAGACTGAAGGCGCACTCACTACGCCATACATGGCCCTTAGAGGCTCAGTTATTGCCAATTGTAAGATAACAACATGCAGATGTACGGACCCTCCTGGTATTATATCACAAAATTACGGAGAAGCTGTATCCCTGATAGATAGACATTCATGCAATGTCTTATCACTAGACGGAATAACTCTGAGGCTCAGTGGGGAATTTGATGCAACTTATCAAAAGAACATCTCAATATTAGATTCTCAGGTCATCGTGACAGGCAATCTTGATATATCAACTGAACTTGGAAACGTCAACAATTCAGTCAGCAATGCCTTGGATAGGTTGGCAGAGAGCAACGGCAAGCTAGAAAAAGTCAATGTCAGACTAACTAGCACATCTGCTCTCATTACCTATATTGTTCTAACTGTCGTTTCCCTAATTTTCGGTGCACTTAGTCTGGTTTTAGCGTGTTACCTGATGTACAAACAGAAGGCACAACAAAAGACCTTGTTATGGCTTGGGAATAATACCCTCGATCAGATGAGAGCCACCACAAGAGCATGA。

新城疫病毒点突变融合蛋白ΔF的氨基酸序列(SEQ ID No.6)如下：

MGSKPSTRIPAPLMLITRIMLILSCIRLTSSLDGRPLAAAGIVVTGDKAVNVYTSSQTGSIIVKLLPNMPRDKEACAKAPLEAYNRTLTTLLTPLGDSIRKIQGSVSTSGGRRQQRFIGAVIGSVALGVATAAQITAAAALIQAKQAAANILRLKESIAATNEAVHEVTDGLSQLSVAVGRMQQFVNDQFNNTARELDCIKITQQVGVELNLYLTELTTVFGPQITSPALTQLTIQALYNLAGSNMDYLLTKLGIGNNQLSSLIGSGLITGYPILYDSHTQLLGIQVNLPSVGNLNNMRATYLETLSVSTTKGYASALVPKVVTQVGSVIEELDTSYCIESDLDLYCTRIVTFPMSPGIYSCLSGNTSACMYSKTEGALTTPYMALRGSVIANCKITTCRCTDPPGIISQNYGEAVSLIDRHSCNVLSLDGITLRLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSVSNALDRLAESNGKLEKVNVRLTSTSALITYIVLTVVSLIFGALSLVLACYLMYKQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTRA。

优选地，所述新城疫病毒融合蛋白F以及新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白HN均来源于新城疫病毒的强毒毒株。

优选地，所述新城疫病毒的强毒毒株为新城疫病毒基因III型至基因IX型毒株中的一种，优选地，所述新城疫病毒的强毒毒株为基因VII型毒株。

一种疫苗，所述疫苗包含上述的新城疫病毒嵌合病毒样颗粒。

优选地，所述疫苗还包含佐剂，所述佐剂选自白油佐剂，角鲨烯佐剂，植物油佐剂或弗氏佐剂。

上述的新城疫病毒嵌合病毒样颗粒的制备方法，该方法为用共同表达逆转录病毒的Gag前体蛋白，新城疫病毒点突变融合蛋白，新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的载体，转染细胞，回收并纯化所述细胞的培养液，获得新城疫病毒嵌合病毒样颗粒。

优选地，所述载体为杆状病毒质粒；所述细胞为昆虫细胞。

上述的新城疫病毒嵌合病毒样颗粒在制备新城疫病毒抗体检测制剂或新城疫病毒疫病监测制剂中的应用，所述制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒。

本发明的有益效果如下：

本发明属于病毒疫苗领域。常用新城疫病毒商品疫苗株为Lasota,属NDV基因II型弱毒株，与流行的强毒毒株遗传距离上相差较远，不能达到完全的保护效果。本发明采用目前流行的新城疫强毒毒株基因VII型作为疫苗株，解决了疫苗株与流行株不相匹配的问题。

病毒样颗粒疫苗是用现代生物学原理和方法制备的新型疫苗。本发明用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备的新城疫病毒嵌合病毒样颗粒疫苗，抗原含量高，容易生产。表达产物的翻译后加工与新城疫病毒结构蛋白相似，颗粒表面上的新城疫病毒膜蛋白保持了其天然结构、生物活性和免疫活性。在制备过程中采用昆虫细胞大规模悬浮培养，封闭式调控操作，保证了批次间的均一性和疫苗的优异质量。本发明所制备的疫苗抗原只是一个新城疫病毒蛋白空壳，不含新城疫病毒的任何遗传物质，没有新城疫病毒活性，不具传染性，非常安全，不会对环境造成污染和散毒。

新城疫病毒在自然界能引起感染的宿主细胞融合，造成宿主红细胞溶血。用带有强毒毒株的融合蛋白F基因、基质蛋白M基因和血凝素-神经氨酸酶蛋白HN基因构建重组杆状病毒来感染昆虫细胞制备新城疫病毒常规病毒样颗粒时，可以观察到受感染的昆虫细胞生长不良，细胞之间有融合现象出现，细胞变得巨大而不规则，易于死亡，因而影响了病毒样颗粒的产量。本发明用分子生物学方法对融合蛋白F第147位的氨基酸进行定向点突变后，能有效地消除受感染的昆虫细胞融合，提高昆虫细胞的存活率和细胞生长数量，从而提高新城疫病毒病毒样颗粒的合成。

用新城疫病毒的M基因、F基因和HN基因可以合成出新城疫病毒病毒样颗粒，但这种含基质蛋白M的新城疫病毒病毒样颗粒产量不高，尤其当选用强毒基因VII型株的这几个结构蛋白基因制备病毒样颗粒抗原时，情况尤为明显。因此给实际生产和应用新城疫病毒样颗粒疫苗造成了不便。本发明用逆转录病毒的Gag前体蛋白取代了新城疫病毒的基质蛋白M，所制备的新城疫病毒嵌合病毒样颗粒不但产量高，而且很稳定，是非常理想的新城疫病毒病毒样颗粒抗原。动物免疫攻毒保护实验结果证明，制备的新城疫病毒嵌合病毒样颗粒疫苗能有效保护免疫鸡只抵抗新城疫病毒强毒毒株的攻击，是理想的预防新城疫强毒病毒侵染的新型疫苗，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为重组杆状病毒质粒的构建示意图；

图2A和图2B为基因DNA凝胶电泳图；

图3为Western blots显示NDV嵌合病毒样颗粒的HIV-1-Gag前体蛋白或NDV嵌合病毒样颗粒的ALV-Gag前体蛋白；

图4A为NDV嵌合病毒样颗粒鸡红细胞血凝效价检测；

图4B为用鸡白血病病毒ALV的Gag前体蛋白基因制备的NDV嵌合病毒样颗粒和用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前体蛋白基因制备的NDV嵌合病毒样颗粒样品血凝效价示意图；

图5为超速离心纯化NDV嵌合病毒样颗粒；

图6A为电镜下的NDV嵌合病毒样颗粒图片；

图6B为图6A的局部放大图；

图7A为用未突变的融合蛋白F制备病毒样颗粒(pFastBac-M-HN-F)与用点突变的融合蛋白ΔF制备病毒样颗粒(pFastBac-M-HN-ΔF)时，细胞感染后的生长曲线比较图；

图7B为用未突变的融合蛋白F制备病毒样颗粒(pFastBac-M-HN-F)与用点突变的融合蛋白ΔF制备病毒样颗粒(pFastBac-M-HN-ΔF)时，细胞感染后的成活率比较图；

图8A为带有未突变的融合蛋白F的NDV病毒样颗粒血凝效价检测和带有点突变的融合蛋白ΔF的NDV病毒样颗粒血凝效价检测结果；

图8B为带有未突变的融合蛋白F的NDV病毒样颗粒样品与带有点突变的融合蛋白ΔF的NDV病毒样颗粒样品血凝效价示意图；

图9A为含基质蛋白M的常规NDV病毒样颗粒样品与含Gag前体蛋白的NDV嵌合病毒样颗粒样品血凝效价检测结果；

图9B为含基质蛋白M的常规NDV病毒样颗粒样品与含Gag前体蛋白的NDV嵌合病毒样颗粒样品血凝效价示意图；

图10A为免疫鸡只血清抗体效价示意图；

图10B为免疫鸡只攻毒保护示意图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

研究结果显示，只有疫苗株与流行毒株高度同源时方能产生理想的免疫保护效力，即不仅对流行株攻击提供高度的临床保护，而且能有效降低排毒和病毒的载量。

本发明的发明人选用的作为疫苗的抗原蛋白基因全取自于中国新城疫流行优势强毒株基因VII亚型，这种新型疫苗将会有效地降低新城疫强毒流行株在免疫鸡群里的进一步扩散传播。本发明制备的疫苗抗原是一个复合蛋白聚合颗粒，不含新城疫病毒的任何遗传物质，没有传染性，非常安全，不会对环境造成污染和散毒。

发明人用逆转录病毒的Gag前体蛋白取代了新城疫病毒的基质蛋白M，所制备的新城疫病毒嵌合病毒样颗粒不但产量高，而且很稳定，是非常理想的新城疫病毒病毒样颗粒抗原，为制备抗强毒新城疫疫苗提供了广阔的应用前景。

实施例1

新城疫病毒(NDV)嵌合病毒样颗粒蛋白载体的构建及检测

根据新城疫病毒强毒株流行趋势同时结合抗原分析和密码子优化，人工合成了新城疫病毒强毒株基因VII型的F蛋白和HN蛋白的基因，以及两个反转录病毒(鸡白血病病毒ALV，人免疫缺陷病毒HIV-1)的Gag前体蛋白基因。

新城疫病毒融合蛋白F和血凝素—神经氨酸酶HN做为新城疫病毒(NDV)嵌合病毒样颗粒的膜糖蛋白，具有强毒株基因VII型病毒表面抗原的功能。而Gag前体蛋白将作为NDV嵌合病毒样颗粒的基质蛋白，以出芽方式，从宿主细胞释放，自组装成嵌合病毒样颗粒。具体构建步骤简述如下：将Gag基因、F基因和HN基因通过PCR扩增后，分别用限制性内切酶进行酶切反应。用凝胶电泳收集纯化酶切后的三个基因DNA片段。用上述同样的方法步骤处理pFastBac质粒载体，然后用T4联接酶将三个基因的DNA片段分别联接到pFastBac质粒载体上，用以表达上述的三个目的蛋白。将所得的重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，采用菌落蓝白斑筛选法，挑选白色菌落。37C°摇床培养所选菌落细菌，进行DNA质粒抽提，获得重组杆状病毒质粒Bacmid，见图1。

在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9,用获得的重组杆状病毒质粒Bacmid做细胞转染，六天后收获含有重组杆状病毒的细胞培养上清液。加入含有SDS的裂解液至细胞上清液中裂解重组杆状病毒，用氯仿抽提、乙醇沉淀获得重组杆状病毒DNA；以此DNA做模板，加入对应F基因、HN基因和Gag基因的不同PCR引物，分别进行PCR扩增反应；

其中，F基因的上游引物序列为SEQ ID No.9所示序列；

F基因的下游引物序列为SEQ ID No.10所示序列；

HN基因的上游引物序列为SEQ ID No.11所示序列；

HN基因的下游引物序列为SEQ ID No.12所示序列；

鸡白血病病毒ALV的Gag基因的上游引物序列为SEQ ID No.13所示序列；

鸡白血病病毒ALV的Gag基因的下游引物序列为SEQ ID No.14所示序列；

人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag基因的上游引物序列为SEQ ID No.15所示序列；

人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag基因的下游引物序列为SEQ ID No.16所示序列。

扩增产物进行凝胶电泳，获得预期的三个DNA片段，图2A中M:DNA分子大小标记；F：NDV融合蛋白F基因DNA片段，1662个碱基对；HN：NDV血凝素-神经氨酸酶蛋白HN基因DNA片段，1716个碱基对；Pr55Gag：人免疫缺陷病毒HIV-1Gag前体蛋白基因DNA片段，1503个碱基对；图2B中M:DNA分子大小标记；F：NDV融合蛋白F基因DNA片段，1662个碱基对；HN：NDV血凝素-神经氨酸酶蛋白HN基因DNA片段，1716个碱基对；Pr61Gag：鸡白血病病毒ALV Gag前体蛋白基因DNA片段，1734个碱基对。图2A和2B可以证明所制备的重组杆状病毒带有所需的三个外源基因。

实施例2

NDV嵌合病毒样颗粒蛋白的表达及自组装

将带有F基因、HN基因和Gag基因(来自于鸡白血病病毒ALV，或人免疫缺陷病毒HIV-1)的重组杆状病毒质粒Bacmid转染昆虫细胞sf9，六天后收取细胞上清液，获得第一代重组杆状病毒毒种，称为P1代。用P1代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得第二代重组杆状病毒毒种，称为P2代。再用P2代毒种进行放大，获得P3代。以P3代作为生产毒种制备NDV嵌合病毒样颗粒。简单而言，将生长状态良好的Sf-9细胞接种到摇瓶中，待细胞成长至对数生长期时，稀释细胞浓度至每毫升3.0×10⁶个细胞。将P3代毒种按MOI为0.1比率，接种病毒到细胞摇瓶中，3到4天后收获细胞上清液，检测NDV嵌合病毒样颗粒的生成。

Western Blot检测收获的细胞上清液中是否含有Gag基质蛋白。具体操作简述如下：在10μL细胞上清液中加入10μL电泳上样液混合，进行SDS-PAGE电泳，然后做Western Blot的印膜转印。用抗HIV-1Gag p24兔源多抗(检测用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前体基因制备的病毒样颗粒蛋白)，或用抗ALV Gag p26兔源多抗(检测用鸡白血病病毒ALV的Gag基因制备的病毒样颗粒蛋白)作为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ECL化学发光试剂曝光胶片，显影后可见胶片上清晰的Gag前体蛋白条带，如图3所示。说明上清液样品与Gag抗体有特异性反应，重组杆状病毒能够正确表达Gag前体蛋白。且Gag前体蛋白以自组装成颗粒的形式释放到细胞上清液中。

血凝效价检测细胞上清液中病毒样颗粒的存在。NDV中的HN蛋白具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)活性。HN蛋白能结合红细胞表面的受体，这一特性可用来做为血凝效价检测的判断指标。因此可以用鸡红细胞凝集反应来检测细胞上清液中的病毒样颗粒。具体步骤是：在一块微量血凝板上，用移液器从第1孔至12孔各加入PBS 0.025mL，用移液器吸取收获的细胞上清液0.025mL，从第1孔起，依次做2倍倍比稀释，至最后一个孔，弃去移液器内0.025mL液体。再向每孔加入1％鸡红细胞悬液0.025mL，并设不加样品的红细胞对照孔，立即在微量板振荡器上摇匀，放置于25℃孵育30min。当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度，作为判定终点。结果见图4A和图4B，图4A中A行：显示用鸡白血病病毒ALV的Gag前体蛋白基因制备的NDV嵌合病毒样颗粒样品一的血凝效价为8；

B行：显示用鸡白血病病毒ALV的Gag前体蛋白基因制备的NDV嵌合病毒样颗粒样品二的血凝效价为8；

C行：显示用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前体蛋白基因制备的NDV嵌合病毒样颗粒样品一的血凝效价为9；

D行：显示用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前体蛋白基因制备的NDV嵌合病毒样颗粒样品二的血凝效价为9；

E行：用PBS作为空白对照。

图4B为用鸡白血病病毒ALV的Gag前体蛋白基因制备的NDV嵌合病毒样颗粒和用人免疫缺陷病毒HIV-1的Gag前体蛋白基因制备的NDV嵌合病毒样颗粒样品血凝效价示意图。

图中显示，用两种逆转录病毒Gag前体蛋白分别制备的NDV嵌合病毒样颗粒样品，在细胞上清液中达到2log8或2log9的水平。说明Gag前体蛋白与NDV膜糖蛋白一起，以自组装成NDV嵌合病毒样颗粒的形式释放到了细胞上清液中。

实施例3

NDV嵌合病毒样颗粒的纯化及电镜观察

采用不连续蔗糖密梯超速离心来纯化NDV嵌合病毒样颗粒。将收集的20mL细胞上清液用角转超速离心机4℃，100000xg，离心1个小时，弃掉离心的上清，加入5ml PBS悬浮溶解过夜。配制蔗糖溶液，质量百分比浓度分别配成20％、45％及60％，小心装入超速离心管中制成不连续蔗糖密度梯度。在顶层加入过夜的5ml PBS悬浮液，用水平转头进行超速离心，4℃，100000xg，时间1小时。在20％与45％交界处以及45％及60％交界处各有一条带，而位于20％与45％交界处的条带最为显著(见图5)。收集此处的条带，其内含有纯化的NDV嵌合病毒样颗粒。电镜拍片实验操作如下：将少量的纯化浓缩后的NDV嵌合病毒样颗粒样品固定处理后，置于铜网上，加2％磷钨酸钠溶液进行负染。电子显微镜下观察并拍片。如图6A和图6B所示，NDV嵌合病毒样颗粒呈圆形，有囊膜，囊膜上有一圈明显的放射状纤突，即表达的NDV膜表面的融合蛋白F和血凝素-神经氨酸酶蛋白HN。

实施例4

对融合蛋白F基因进行点突变有助于受感染的昆虫细胞存活因而增加NDV病毒样颗粒的生成

新城疫(ND)病毒在自然界能引起感染的宿主细胞融合，造成宿主红细胞溶血。在本实施例中，用带有NDV强毒毒株的融合蛋白F基因、基质蛋白M基因和血凝素-神经氨酸酶蛋白HN基因构建重组杆状病毒。当用其感染昆虫细胞制备VLP颗粒时，可以观察到受感染的昆虫细胞生长不良，细胞之间有融合现象出现，细胞变得巨大而不规则，易于死亡，图7A为用未突变的融合蛋白F制备病毒样颗粒(pFastBac-M-HN-F)与用点突变的融合蛋白ΔF制备病毒样颗粒(pFastBac-M-HN-ΔF)时，细胞感染后的生长曲线比较；图7B为用未突变的融合蛋白F制备病毒样颗粒(pFastBac-M-HN-F)与用点突变的融合蛋白ΔF制备病毒样颗粒(pFastBac-M-HN-ΔF)时细胞感染后的成活率比较；图中Fwt:带有未突变融合蛋白F的重组杆状病毒感染的细胞生长曲线；Fmut:带有点突变融合蛋白ΔF的重组杆状病毒感染的细胞生长曲线。用血凝效价检测细胞上清液，所测得血凝效价很低。

用分子生物学方法对融合蛋白F基因进行定向点突变，所述点突变是将第147位的天冬酰胺突变为丙氨酸，命名为N147A。具体操作如下：设计合成带有突变位点的寡核苷酸片段做为引物，这两个寡核苷酸片段序列分别是：

F基因点突变上游引物的序列为SEQ ID No.17所示序列；

F基因点突变下游引物序列为SEQ ID No.18所示序列。

采用PCR多聚链式反应获得带有点突变的F融合蛋白基因DNA片段，称为ΔF融合蛋白基因。用凝胶电泳纯化及回收此DNA片段，将其作为模板，用实施例1所提到的F基因的上游引物(SEQ ID No.9)和F基因的下游引物(SEQ ID No.10)再次进行PCR多聚链式反应扩增模板DNA，然后用凝胶电泳法进行DNA的纯化及回收。用T4链接酶将回收的DNA片段平端连接到细菌质粒上，转化到DHα感受态细菌细胞中，扩增含有点突变的ΔF基因DNA片段(核苷酸序列见SEQ ID No.5)。抽提扩增后的细菌质粒，用内切酶将ΔF基因片段从质粒中切下，再用T4链接酶接入到经修饰后带有NDV强毒毒株的基质蛋白M基因和血凝素-神经氨酸酶蛋白HN基因的pFastBac质粒上。经转化DH10Bac感受态细胞，采用菌落蓝白斑筛选法，挑选阳性的白斑菌落进行培养，抽提DNA质粒，获得重组杆状病毒pFastBac-M-HN-ΔF的Bacmid质粒。

将带有未突变的融合蛋白F基因的pFastBac-M-HN-F Bacmid质粒和带有点突变的融合蛋白ΔF基因的pFastBac-M-HN-ΔF Bacmid质粒分别转染sf-9昆虫细胞，制备NDV病毒样颗粒，然后进行血凝效价检测比较，结果见图8A和图8B。图8A为带有未突变的融合蛋白F的NDV病毒样颗粒血凝效价检测和带有点突变的融合蛋白ΔF的NDV病毒样颗粒血凝效价检测结果，图中A行显示用点突变的ΔF融合蛋白制备的常规NDV病毒样颗粒样品的血凝效价为6，B行显示用未突变的F融合蛋白制备的常规NDV病毒样颗粒样品的血凝效价为4；图8B为带有未突变的融合蛋白F的常规NDV病毒样颗粒样品与带有点突变的融合蛋白ΔF的常规NDV病毒样颗粒样品血凝效价示意图；实验结果证明，将融合蛋白F基因进行定向点突变后，能提高受感染的sf-9昆虫细胞的存活率和细胞数量，从而提高NDV病毒样颗粒的生成。

实施例5

用Gag前体蛋白取代NDV的基质蛋白M能有效提高NDV病毒样颗粒的产量

为了便于区别，将上述实施例4中用重组杆状病毒pFastBac-M-HN-ΔF制备的VLP产物称为NDV常规病毒样颗粒，即一种含有NDV基质蛋白M，点突变的融合蛋白ΔF和血凝素-神经氨酸酶蛋白HN的病毒样颗粒。而将本实施例中用Gag前体蛋白取代NDV的基质蛋白M获得的重组杆状病毒pFastBac-Gag-HN-ΔF来制备的VLP产物称为NDV嵌合病毒样颗粒。具体操作简述如下：人工基因合成Gag前体蛋白基因，抽提带有此基因DNA片段的质粒，进行内切酶酶切，凝胶电泳回收和纯化酶切后的Gag基因DNA片段。用相同的内切酶处理pFastBac-M-HN-ΔF质粒，凝胶电泳回收和纯化酶切后除去基质蛋白M基因DNA片段的pFastBac-HN-ΔF质粒。用T4链接酶将Gag基因DNA片段连接到上述的质粒中，并将此链接的质粒转化到DH10Bac感受态细菌细胞中。采用菌落蓝白斑筛选法，挑选阳性的白斑菌落进行培养，抽提DNA质粒，获得另一个NDV重组杆状病毒Bacmid质粒，即pFastBac-Gag-HN-ΔF。用此重组杆状病毒所制备的病毒样颗粒是以Gag前体蛋白作为颗粒的基质蛋白，支撑昆虫细胞出芽，形成具有囊膜的病毒样颗粒，释放到细胞上清液中，即为NDV嵌合病毒样颗粒。

为了比较NDV常规病毒样颗粒和NDV嵌合病毒样颗粒的产量差别，在严格控制两种病毒样颗粒生产条件使其尽量保持一致的情况下，进行了多次病毒样颗粒的制备和血凝效价的检测，见图9A和9B。图9A为含基质蛋白M的NDV常规病毒样颗粒样品与含Gag前体蛋白的NDV嵌合病毒样颗粒样品血凝效价检测，图中，A行显示用Gag前体蛋白制备的NDV嵌合病毒样颗粒样品一的血凝效价为9；B行显示用Gag前体蛋白制备的NDV嵌合病毒样颗粒样品二的血凝效价为9；C行显示用M基质蛋白制备的NDV常规病毒样颗粒样品一的血凝效价为7；D行显示用M基质蛋白制备的NDV常规病毒样颗粒样品二的血凝效价为6；图9B为含基质蛋白M的NDV常规病毒样颗粒样品与含Gag前体蛋白的NDV嵌合病毒样颗粒样品血凝效价示意图；结果显示，每次生产的NDV嵌合病毒样颗粒产量都高于NDV常规病毒样颗粒产量，而且重复性好，易于制备。

实施例6

NDV嵌合病毒样颗粒疫苗能刺激家禽产生抗体并保护其免于强毒攻击

为了检测NDV嵌合病毒样颗粒疫苗是否能有效产生保护作用，使免疫的鸡只不受NDV强毒毒株的致命攻击，本实施例直接用含有NDV嵌合病毒样颗粒的细胞上清液与市面上出售的商用白油佐剂混合，按规程要求乳化制备了家禽用NDV嵌合病毒样颗粒疫苗。疫苗乳化方法简介如下：取细胞上清液和白油佐剂，按1:1.5的体积比率混合，置于小型电动乳化仪转头下进行乳化。取1ml乳化完毕的乳液放于一个小型台式离心机的EP小管中，转速5000rpm，室温下离心15min。检查管内离心液，没有出现分层现象，表明乳化完全，疫苗制备合格。

鸡只免疫及攻毒保护试验检验NDV嵌合病毒样颗粒疫苗效力：将11只三周龄的SPF小鸡分为两组，即试验组6只，空白对照组5只。试验组每只小鸡颈部皮下注射0.3ml的NDV嵌合病毒样颗粒疫苗，空白对照组不免疫。三周后每只鸡翅下静脉采血1ml，进行血清抗体检测。检测方法采用常规的血凝抑制法。具体操作如下：将96孔微量板横向放置，除第一列外，每孔各加25μL的PBS，但H1孔内加50μL的PBS作为红细胞对照。用100μL常用微量加样器，向第一列除H1孔外的各孔中分别加入50μL采集来的各鸡只的血清。取8道加样器，将第一列的各孔样品向微量板的第二列至第十二列依次做25μL的二倍系列稀释。依次向除H行的各孔中加入25μL预先配置好的4单位抗原，H行加25μL的PBS，混匀后室温静置30min。然后每孔加入1％红细胞悬液50μL混匀，室温孵育30min，观察红细胞凝集抑制结果，血清抗体效价见图10A，图10A为免疫鸡只血清抗体效价示意图；采血后的第二天，全部11只鸡用NDV强毒基因VII型毒株模拟自然感染途径进行攻毒。攻毒后两周内连续观察鸡只生存情况，接受NDV嵌合病毒样颗粒疫苗免疫的试验组6只鸡全部存活，而非免疫的空白对照组5只鸡陆续全部死亡，见图10B和表1，图10B为免疫鸡只攻毒保护示意图；表1为鸡只攻毒保护试验结果。试验结果充分证明，制备的NDV嵌合病毒样颗粒疫苗能有效保护免疫鸡只抵抗NDV强毒毒株的攻击。

表1

注释：“+”表示鸡只存活。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

<110> 诺华生物科技（武汉）有限责任公司

<120> 新城疫病毒病毒样颗粒、疫苗及制备方法

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1734

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggaagctg tgatcaaggt catctcctcc gcttgcaaga cctactgcgg caagacctcc 60

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cgtgctatga tcctgggcaa gtccggcgaa ctcaagacct ggggcctggt gctgggtgct 240

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cgtatcgaca agggcgagga agtgggcgag actaccgtgc agcgtgacgc taagatggct 420

cccgaggaaa ccgctacccc caagaccgtg ggcacctcct gctaccactg cggcaccgct 480

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gactgggctc gtgtgcgtga ggaactggct tccaccggtc cccctgtggt ggctatgccc 720

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ctggctgaca ccgtgcgtac caagggcctg cgttccccaa tcaccatggc tgaggtggag 840

gctctgatgt cctcccccct gctgcctcac gacgtgacca acctgatgcg tgtgatcctg 900

ggtcccgctc cctacgctct gtggatggac gcttggggcg tgcagctgca gaccgtgatc 960

gctgctgcta cccgtgaccc ccgtcaccct gctaacggac agggtcgtgg cgagcgtacc 1020

aacctgaacc gtctgaaggg cctggctgac ggcatggtcg gcaaccctca gggacaggct 1080

gctctgctgc gtcctggcga gctggtcgct atcaccgcca gcgctctgca ggctttccgt 1140

gaggtggccc gtttggccga accagctggt ccctgggctg acatcatgca gggcccctcc 1200

gagtccttcg tggacttcgc taaccgtctg atcaaggctg tggagggctc cgacctccct 1260

ccttccgctc gtgctcccgt gatcatcgac tgcttccgtc agaagtccca gcccgacatc 1320

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gtgctggacc gtcaaaagac cgctcccctg accgaccaag gtatcgctgc cgctatgtcc 1440

tccgctatcc agcccctgat catggctgtc gtgaaccgcg agagggacgg acagaccggt 1500

tccggtggtc gtgctcgtgg cctgtgctac acttgcggtt cccccggtca ctaccaggct 1560

cagtgcccca agaagcgcaa gtccggaaac tcccgcgagc gctgccagct ctgcaacggc 1620

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aagggactgt cctccggtcc ttggcctggt cctgagcccc ctgctgtgtc ctaa 1734

<210> 2

<211> 577

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Ala Val Ile Lys Val Ile Ser Ser Ala Cys Lys Thr Tyr Cys

Gly Lys Thr Ser Pro Ser Lys Lys Glu Ile Gly Ala Met Leu Ser Leu

Leu Gln Lys Glu Gly Leu Leu Met Ser Pro Ser Asp Leu Tyr Ser Pro

Gly Ser Trp Asp Pro Ile Thr Ala Ala Leu Ser Gln Arg Ala Met Ile

Leu Gly Lys Ser Gly Glu Leu Lys Thr Trp Gly Leu Val Leu Gly Ala

Leu Lys Ala Ala Arg Glu Glu Gln Val Thr Ser Glu Gln Ala Lys Phe

Trp Leu Gly Leu Gly Gly Gly Arg Val Ser Pro Pro Gly Pro Glu Cys

Ile Glu Lys Pro Ala Thr Glu Arg Arg Ile Asp Lys Gly Glu Glu Val

Gly Glu Thr Thr Val Gln Arg Asp Ala Lys Met Ala Pro Glu Glu Thr

Ala Thr Pro Lys Thr Val Gly Thr Ser Cys Tyr His Cys Gly Thr Ala

Ile Gly Cys Asn Cys Ala Thr Ala Ser Ala Pro Pro Pro Pro Tyr Val

Gly Ser Gly Leu Tyr Pro Ser Leu Ala Gly Val Gly Glu Gln Gln Gly

Gln Gly Gly Asp Thr Pro Pro Gly Ala Glu Gln Ser Arg Ala Glu Pro

Gly His Ala Gly Gln Ala Pro Gly Pro Ala Leu Thr Asp Trp Ala Arg

Val Arg Glu Glu Leu Ala Ser Thr Gly Pro Pro Val Val Ala Met Pro

Val Val Ile Lys Thr Glu Gly Pro Ala Trp Thr Pro Leu Glu Pro Lys

Leu Ile Thr Arg Leu Ala Asp Thr Val Arg Thr Lys Gly Leu Arg Ser

Pro Ile Thr Met Ala Glu Val Glu Ala Leu Met Ser Ser Pro Leu Leu

Pro His Asp Val Thr Asn Leu Met Arg Val Ile Leu Gly Pro Ala Pro

Tyr Ala Leu Trp Met Asp Ala Trp Gly Val Gln Leu Gln Thr Val Ile

Ala Ala Ala Thr Arg Asp Pro Arg His Pro Ala Asn Gly Gln Gly Arg

Gly Glu Arg Thr Asn Leu Asn Arg Leu Lys Gly Leu Ala Asp Gly Met

Val Gly Asn Pro Gln Gly Gln Ala Ala Leu Leu Arg Pro Gly Glu Leu

Val Ala Ile Thr Ala Ser Ala Leu Gln Ala Phe Arg Glu Val Ala Arg

Leu Ala Glu Pro Ala Gly Pro Trp Ala Asp Ile Met Gln Gly Pro Ser

Glu Ser Phe Val Asp Phe Ala Asn Arg Leu Ile Lys Ala Val Glu Gly

Ser Asp Leu Pro Pro Ser Ala Arg Ala Pro Val Ile Ile Asp Cys Phe

Arg Gln Lys Ser Gln Pro Asp Ile Gln Gln Leu Ile Arg Thr Ala Pro

Ser Thr Leu Thr Thr Pro Gly Glu Ile Ile Lys Tyr Val Leu Asp Arg

Gln Lys Thr Ala Pro Leu Thr Asp Gln Gly Ile Ala Ala Ala Met Ser

Ser Ala Ile Gln Pro Leu Ile Met Ala Val Val Asn Arg Glu Arg Asp

Gly Gln Thr Gly Ser Gly Gly Arg Ala Arg Gly Leu Cys Tyr Thr Cys

Gly Ser Pro Gly His Tyr Gln Ala Gln Cys Pro Lys Lys Arg Lys Ser

Gly Asn Ser Arg Glu Arg Cys Gln Leu Cys Asn Gly Met Gly His Asn

Ala Lys Gln Cys Arg Lys Arg Asp Gly Asn Gln Gly Gln Arg Pro Gly

Lys Gly Leu Ser Ser Gly Pro Trp Pro Gly Pro Glu Pro Pro Ala Val

Ser

<210> 3

<211> 1503

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgatggga aaaaattcgg 60

ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120

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caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480

gagaaggctt tcagcccaga agtgataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540

ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600

ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gagtgcatcc agtgcatgca 660

gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720

agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780

atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840

agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900

tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960

ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcatt gggaccagga 1020

gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080

agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaatccag ctaccataat gatacagaaa 1140

ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200

atagccaaaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260

caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320

cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaccag agccaacagc cccaccagaa 1380

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<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp

Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys

His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro

Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu

Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn

Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Glu Ile Lys Asp

Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys

Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gln Val

Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His

Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu

Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser

Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly

Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu

Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala

Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr

Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile

Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys

Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly

Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu

Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr

Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala

Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly

Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser

Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg

Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His

Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys

Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn

Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe

Leu Gln Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg

Phe Gly Glu Glu Thr Thr Thr Pro Ser Gln Lys Gln Glu Pro Ile Asp

Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Ala Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Ser Asp

Pro Ser Ser Gln

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<211> 1662

<212> DNA

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gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420

ctaatacaag ccaaacaggc tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480

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aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020

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aataataccc tcgatcagat gagagccacc acaagagcat ga 1662

<210> 6

<211> 553

<212> PRT

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<400> 6

Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile

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Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys

Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys

Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro

Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly

Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Arg

Arg Gln Gln Arg Phe Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly

Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala

Lys Gln Ala Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala

Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ser

Val Ala Val Gly Arg Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Asn

Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val

Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln

Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn

Leu Ala Gly Ser Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly

Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr

Pro Ile Leu Tyr Asp Ser His Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn

Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu

Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Pro

Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser

Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr

Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser

Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met

Ala Leu Arg Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg

Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val

Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile

Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile

Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser

Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Val Ser Asn Ala Leu Asp Arg

Leu Ala Glu Ser Asn Gly Lys Leu Glu Lys Val Asn Val Arg Leu Thr

Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Val Ser Leu

Ile Phe Gly Ala Leu Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys

Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu

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<210> 8

<211> 571

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Asp Arg Ala Val Gly Arg Val Val Leu Glu Asn Glu Glu Arg Glu

Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Val Phe Arg Ile Ala Val Leu Phe Leu

Met Val Met Thr Leu Ala Ile Ser Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Ser Met

Gly Ala Ser Thr Pro His Asp Leu Ala Gly Ile Ser Thr Val Ile Ser

Lys Ala Glu Asp Lys Val Thr Ser Leu Leu Ser Ser Ser Gln Asp Val

Thr Asn Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu

Leu Asn Thr Glu Ser Ile Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr

Gln Ile Asn Gly Ala Glu Asn Asn Ser Gly Cys Gly Ala Pro Val His

Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp

Ile Ser Gly Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Tyr Lys Glu His Leu

Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro

Ser Phe Asp Met Ser Thr Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile

Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser His Gln Tyr Leu Ala Leu

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu

Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Gly

Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Lys Ser Val Ala Pro Thr Ser Met Val His

Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Thr

Thr Val Leu Phe Lys Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly

Gly Ser Phe Ile Asp Gly Arg Val Trp Phe Pro Val Tyr Gly Gly Leu

Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ala Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile

Tyr Lys Arg His Asn Asn Thr Cys Pro Asp Lys Gln Asp Tyr Gln Ile

Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg

Val Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Lys

Asp Pro Val Leu Thr Ile Pro Pro Asn Thr Ile Thr Leu Met Gly Ala

Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg

Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Asn

Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Met Phe Asn Ala Phe Thr

Arg Pro Gly Ser Val Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser

Cys Ile Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe His Arg

Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Asp Glu Gln

Ala Arg Leu Asn Pro Val Ser Ala Val Phe Asp Asn Ile Ser Arg Ser

Arg Val Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr

Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Val Tyr Cys Leu Ser

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgggctcca aaccttctac 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tcatgctctt gtggtggc 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atggaccgcg cagttggc 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttaaactcta tcatccttg 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggaagctg tgatcaagg 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttaggacaca gcagggggc 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atgggtgcga gagcgtcag 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttattgtgac gaggggtcg 19

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctaatacaag ccaaacaggc tgccgccaac atcctcc 37

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggaggatgtt ggcggcagcc tgtttggctt gtattag 37